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1、,以NF-B为靶点的缺血性急性肾衰基因治疗的实验研究,导 师 研究生,立论依据,急性肾功能衰竭（ARF)的概况,发病率：2.5；死亡率：高，50；治疗方法：透析；改善预后的关键：是在阐明其发病机制的基础上进行有效的针对性治疗。,急性肾功能衰竭(ARF)的发病机制与一些因子有关,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)细胞间黏附分子-1（ICAM-1）内皮素（endothelin,ET）游离型一氧化氮合酶iNOS,免疫因子的表达、平衡受到转录因子的调控,免疫因子的表达受到转录因子NF-B 的调控。,NFB可由多种激活剂激活，由无活性的结合状态经磷酸化后活化，易位到细胞核内，与特异性的结合位点（B位点）
2、结合，启动基因的转录,研究转录因子在疾病发病中的作用并进行干预，可在更早期阻断发病环节，起到“提纲挈领”“事半功倍”的效果。,NF-B 参与了缺血性ARF的发病,NF-B在肾病综合征、动脉粥样硬化、病毒感染和肿瘤发生中起一定作用；我们的前期研究结果表明:NF-B 在缺血性ARF中活性升高；可能促进了早期、晚期肾损害的发生；是通过调控iNOS等炎性因子的表达来实现的。,抑制NF-B 的策略在疾病中研究,治疗心肌梗塞 恶性肿瘤的转移 抑制肾的排斥反应 实验性肾小球肾炎,NFB decoy 作用的示意图,阳离子脂质体转染法,可能机制是：DNA负电荷与脂质体上的正电荷结合，脂质体上剩余的正电荷与细胞膜
3、上的唾液酸残基的负电荷结合，然后通过二者的融合将DNA导入细胞,脂质体介导转染的机制,方法：HVJ脂质体DNA转染法以及缺陷；鱼精蛋白(protamine)与阳离子脂质体和DNA一道，按一定的电荷比例制成复合物（LPD）进行体内、外转染，可提高基因转染效率,阳离子脂质体转染法,本研究将选择大鼠缺血性ARF模型，应用NF-B结合位点引诱物ODN进行体内外转染，通过观察对MCP-1、ICAM-1、iNOS和ET-1表达的影响，肾功能和肾组织的形态学的改变,观察其对肾细胞及肾功能的保护作用，为基因治疗提供理论依据。,研究内容、步骤和方法,研究内容,观察NF-B结合位点引诱物ODN 对体外刺激培养细胞
4、的免疫因子产生的影响 观察NF-B结合位点引诱物ODN对缺血型ARF的预防和治疗作用。,研究步骤,体外转染：选用NRK-52E细胞株，观察转染后对表达MCP-1、ICAM-1、ET-1 和iNOS的影响。体内转染：在肾动脉阻断的同时以及再灌注后不同时间，经肾动脉给予NF-B结合位点引诱物ODN，进行观察。,实验方法,大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养；阳离子脂质体的制备；iARF 模型的制备；肾动脉注射法。,大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养,本实验室已有传代的细胞株和成熟的方法,鱼精蛋白-脂质体ODN/DNA(LPD)的制备,将ODN与鱼精蛋白、脂质体混合，使鱼精蛋白、脂质体
5、与ODN/电荷比率为4,脂质体体外转染的实验步骤,细胞接种到48孔培养板，培养过夜或使铺满达5080；细胞培养液中加入LPD 使ODN终浓度为1 mmol/L，裸转染为直接将ODN与细胞孵育；同时各孔加入TNF 使终浓度为50 ng/ml，设立空白对照，置37，CO2 孵箱内，培养212 h。,体外分组,1.LPD组 2.裸转染组 3.空白对照组,转染效率：荧光显微镜观察胞内荧光素标记的NF-B decoy ODN 的分布 FCM检测细胞摄入率。NF-B活性 凝胶电泳迟滞分析（EMSA）各免疫因子的表达：mRNA表达的半定量RT-PCR分析,观察指标,肾脏内转染,戊巴比妥钠(sodium pe
6、ntobarbital)50mg/kg,麻醉，并插管呼吸按本科建立的方法制备iARF模型；用 30G 针将200l LPD，注入左肾动脉;准备实验阶段用FITC标记LPD;夹闭60min后，开始再灌注;,注射后2,12，24hr 处死大鼠，取出肾脏，做冷冻切片进行荧光显微镜检查，观察荧光的分布情况。,转染效率的观察,体内转染分组,Sham 组 iARF 组 NF-B decoy ODN 治疗组 错配物ODN治疗组,肾功能检测及肾组织形态学的检查；免疫组化检查 肾组织中的M/M的分布；EMSA检查肾组织的NF-B 活性的变化；RT-PCR和免疫组化检查MCP-1、ICAM ET-1和 iNOS
7、mRNA的表达及其在肾脏中的分布。,观察指标,可能遇到的问题及解决办法,虽然在设计体外实验部分的时候，已充分考虑到脂质体转染效率的影响因素如：+/-，脂质体本身的组成，但是，体内实验部分是否也能够在体外最佳条件下达到最佳效果。肾动脉分离和注射的出血问题。EMSA技术的难度,初步结果,图1 NRK-52E细胞转染效率FCM测定1：空白对照；2.PL法转染；3：裸转染,图2 NRK-52E细胞转染效率照片A：PL法转染2 h后普通光镜观察；B：A视野的荧光镜观察。C：裸转染2 h后普通光镜观察；D：C视野的荧光镜观察。E：空白对照普通光镜观察；F：E视野的荧光镜观察。N胞转染NFB decoy 2h后普通光镜下观察,经肾动脉给药2h后，NF-B decoy 主要分布在肾小球,经肾动脉给药12h后，NF-B decoy 主要分布在肾小管,下一步研究计划,NF-B decoy 转染治疗后对ARF大鼠肾功能的影响：生化学指标组织学指标观察肾组织中NF-B及其下游的分子MCP-1、ICAM-1、iNOS、ET-1的变化：EMSA,RT-PCR和免疫组化恳请各位老师提出宝贵意见并予以指导。,谢谢大家,
