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1、出血与血栓的实验诊断,协和医院检验科陈凤花,当前致死主要病种,脑血管疾病心血管疾病等高血压、糖尿病等慢性疾病发病率上升 这些都与体内凝血、止血机制有关，许多病种都牵连到体内凝血、止血机制,止血、凝血和纤溶机制,血管壁的作用血小板的作用凝血因子的作用抗凝系统的作用纤维蛋白溶解（纤溶）系统的作用血液流变学改变,血管中流动的血液为什么不凝固破损的血管为什么能止血,生理状态下,机体内存在着复杂的凝血系统和抗凝系统,凝血血栓,抗凝出血,正常止血机能,两个方面,四个因素,凝血机制,抗凝机制,血管壁（vessel wall）,血小板（platelet）,凝血系统（coagulation system）,抗凝
2、及纤溶系统（anticoagulation and fibrinolytic）,凝血与抗凝机制的病理生理基础,止血、凝血和纤溶机制,血栓止血的平衡（四个部分）,血小板,凝血酶,纤维蛋白,凝血,一、血管壁的止血与抗凝作用,（一）血管壁的止血作用 1.血管壁的完整性,是防止出血或血栓形成的重要保证 血管内皮细胞之间及内皮下胶原 血小板参与血管壁的完整性和维持通透性,血管壁完整性破坏的出血机制,当Vit C缺乏或PLT减少时，管壁抵抗力下降,内皮细胞间隙增大,脆性、通透性增加,RBC及血液成分外溢,出血,良好的弹力纤维-保持血管壁的柔韧性健全的神经纤维-维持血管壁的舒缩性带负电荷的胶原纤维-启动凝血
3、过程,2.血管内皮下层,3.血管内皮细胞产生,Von Willebrand Factor vWF(vWF)Fibronectin Fn(纤维结合蛋白)Tissue Factor TF(组织因子 FIII)Endouthelin ET(内皮素),当血管壁受损后的一系列变化,.神经反射,管腔收缩,血流变慢,出血/停止,.内皮细胞分泌vWF、Fn,促进PLT粘附,.释放FIII,启动外源性凝血途径,.暴露内皮下胶原,促进血小板粘附启动内源性凝血途径,（二）正常血管壁抗血栓形成能力,血管内皮细胞合成前列环素(PGI2)扩张血管、抑制plt功能纤溶酶原激活物(PA)激活纤溶酶、清除小凝块 血栓调节素(t
4、hrombomodulin TM)参与蛋白C系统的抗凝作用肝素或类肝素物质 具有多种抗凝活性,创伤、炎症中毒、缺氧,管壁抗凝作用病理性血栓形成,血小板来自骨髓成熟的巨核细胞（一）静态下血小板形态 蛋白质 glycoprotein GP 如：GPIa Ib IIb a 代谢产生花生四烯酸、血栓烷A2 磷脂(TXA2)、血小板 活化因子等 提供催化表面（PF3）,二、血小板在止血机能中的作用,包膜,（一）静态下血小板形态,膜下：微管与微丝框架 变形 活化胞浆：血栓收缩蛋白 血凝块缩小、加固三种特殊颗粒：-颗粒、致密颗粒、溶酶体,血管受损 血 小 胶原暴露 板 止 血小板粘附 血 功 血小板聚集 能
5、 血小板释放 血小板栓子,1.粘附功能（adhesion function）指血小板具有粘附于血管内皮下胶原及其他异物表面的能力 需要物质GPIb-vWF III型胶原纤维结合蛋白（Fn）,（二）血小板功能,指活化后的血小板与血小板之间相互连接的特性 参加因素GPIIb/IIIa纤维蛋白原钙离子聚集诱导剂：ADP、肾上腺素、TXA2、花生四烯酸,2.聚集功能（aggregation function）,IIb,IIb,粘附与聚集的结果,血小板大量聚集、粘附于血管破损处,形成白色血栓,暂时止血,3释放功能：(release reaction),指血小板在诱导剂的作用下，将胞浆内特殊颗粒中的内含物
6、释放出血小板的反应-颗粒 致密颗粒 溶酶体 与血小板粘附、聚集、炎症反应、创伤修复动脉粥样硬化等作用有关,4血块收缩功能,血凝块,血小板血栓收缩蛋白,纤维蛋白网 收缩,血清被挤出血块缩小加固,PF3提供凝血因子催化表面,5血小板促凝活性,血小板止血功能（小结）,维持血管壁的完整性，毛细血管的通透性 粘附、聚集在血管破损处，形成白色血栓 释放活性物质，促进血小板聚集，增强 血管收缩 促进凝血过程 血块收缩，形成稳固血栓,三、凝血因子与凝血过程,血液由流动状态变为凝胶状态称血液凝固。是由一系列凝血因子参加的、复杂的酶促反应和分子聚合过程,分为三个阶段，两个途径（内源性、外源性）,第一阶段：凝血酶原
7、激活物(凝血活酶)形成期第二阶段：凝血酶形成期第三阶段：纤维蛋白形成期,目前公认的凝血因子共14个，按罗马字命名的有12个，尚有高分子量激肽原(HMWK)，激肽释放酶原(PK)大多数由肝脏产生，其中II、VII、IX、X合成依赖于Vitk，称Vitk依赖因子正常情况下，所有因子都处于无活性状态,凝血因子,纤维蛋白原 凝血酶原 组织因子 钙离子,IIa Ca2+VIII-VIIIa III Plt-PF3 Ca2+IIa Xa VVa Ca2+,正常凝血过程（瀑布学说）,PF3 磷脂 凝血酶原(II)凝血酶(IIa)纤维蛋白原(I)可溶性纤维蛋白 稳固性纤维蛋白,内源性途径,胶原等带负电荷表面,
8、PKa PK,XIIXIIa HMWK,外源性途径,组织损伤释放,组织因子（III）,XI XIa,IIa,IX IXa,VIIa VII,XIIIXIIIa,参加因子：,所需时间：,X Xa,（凝血旁路）,VIII、IX、XI、XII V、X、II、I III、VII,Ca2+、PF3、磷脂,38min,内源性凝血途径 外源性凝血途径 TF+Ca2+TF+Ca2+PF3 共 同+Ca2+PF3 途 径,APTT,PT,参与因子 筛选试验外源,Ca2+PT内源,Ca2+APTT共同,Ca2+TT,四、正常抗凝及纤溶系统,（一）细胞抗凝机制,单核-巨噬细胞,吞 噬清 除,凝血过程有关 物质和产物
9、,（二）体液抗凝机制,血液中存在多种抗凝物质及抗凝系统 1抗凝血酶III（antithrombin III，AT-III）AT-III 灭活IIa、IXa、Xa、a、XIIa、激肽释放酶,肝素,这种抗凝作用占体内总抗凝的50%60%,2.组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor TFPI),TF,a,a,TFPI,灭活a、TF、a,TF,a,3.蛋白C系统,蛋白C（Protein C,PC）蛋白S（Protein S,PS)血栓调节素（thrombomodulin,TM）活化蛋白C抑制物(activated protein C inhibitor,AP
10、CI),血管内皮细胞,蛋白C,蛋白Ca,凝血酶,血栓调节素,APCI,灭活Va、a,激活纤溶系统,血管内皮细胞,蛋白S,蛋白C系统抗凝机制,4其它,肝素辅因子-（HC-）抗凝谱同AT-活性仅AT-的1/3在肝素协同下作用可扩大1000倍 肝素（heparin）生理状态下血液中含量甚微最重要的抗凝作用是增强AT-和 HC-效应,（三）纤维蛋白溶解系统（fibrinolysis，纤溶系统）,主要作用：分解纤维蛋白（原），清除血管内由于纤维蛋白沉积引起的阻塞，保持血流通畅,最重要的生理性抗凝系统,XIIa PK,纤溶酶原,纤溶酶,u-PA t-PA,纤维蛋白原 纤维蛋白单体 稳固纤维蛋白 纤溶酶 纤
11、溶酶 纤溶酶 B1-42 B15-42 D二聚体、多聚体A、B、C、H A、B、C、HX、Y、D、E X、Y、D、E X、Y、D、E 被降解的纤维蛋白（原）产物统称为FDP,a,凝血因子 纤溶系统 血小板 抗凝系统血管内皮细胞,止凝血障碍性疾病的发病机制,血管壁结构与功能异常血小板质与量异常凝血因子质与量异常抗凝及纤溶系统异常循环中凝血及抗凝物质增加综合因素,止凝血障碍的实验检查,一、毛细血管抵抗力试验(capillary resistance Test,CRT),又称毛细血管脆性试验或束臂试验,毛细血管壁完整性内皮结构与功能血小板质与量,异常,脆 性通透性,压力,易出血,原 理,方 法血压计
12、袖带上臂加压8min 在前臂直径5cm 圆圈内计数出血点,(收缩压+舒张压)2,参考值 男性0-5个 女性0-10个 出血点的数目超过正常为阳性 意 义 本实验观察血管壁、血小板的综合止血作用 1.异常提示：毛细血管脆性、通透性 2.常见于：血管壁结构与功能异常 血小板质与量异常,3.常见疾病 遗传性毛细血管扩张症 过敏性紫癜 Vit C或K缺乏症 原发性和继发性血小板减少症，血小板增多症，先天性和获得性血小板功能缺陷症 血管性血友病,二、出血时间（bleeding time,BT）,原 理 测定皮肤毛细血管刺破后，血液自然流出至自然停止所需的时间，主要反映血管壁和血小板相互作用,参考值 Du
13、ke法 1-3 min 4min为延长 Ivy 法 2-6min 7min为延长 BT测定器法 6.92.1min 9min为延长,Duck法：缺乏准确性 IVY法：敏感但难以标准化出血时间测定器法：较敏感和准确,意 义,1.BT长短主要受血小板数量和功能以及毛细血管的通透性和脆性的影响，受血浆凝血因子的影响较小,意 义,2.BT延长 血小板明显 50109/L，如ITP 血小板功能异常：血小板无力症 血管壁异常：遗传性毛细血管扩张症 药物影响，如阿斯匹林、潘生丁 严重缺乏血浆某些凝血因子，如血管性血友病（VWD）、DIC,意 义,3BT缩短 某些严重高凝状态或血栓性疾病 心梗、脑梗、DIC高
14、凝期,三、血小板计数（Platelet count）,参考值 100-300109/L 400109/L为增加,意 义,1血小板减少 生成障碍：再障、白血病、骨纤、放射病 破坏过多：ITP、SLE、脾亢 消耗过多：DIC、TTP,2血小板增多 一过性增多：急性大出血、溶血或脾切除术后 持续性增多：骨髓增生性疾病：慢粒、真红、原发性血小板增多症,意 义,血凝块,血小板血栓收缩蛋白,纤维蛋白网 收缩,血清被挤出血块缩小加固,原理,四、血块收缩试验（clot retraction test,CRT）,方法,全血标本注入试管中，静置，观察析出的血清占原有全血量的 百分比,表示血块收缩的程度,参考值,3
15、0min-1h 开始退缩 18h-24h 完全退缩 退缩完全：析出的血清 全血量,40-50%,意义,1主要用于血小板功能测定的初筛试验，反映血小板的血块收缩能力2血块收缩不良见于：a)血小板功能异常或量（尤其50109/L）b)纤维蛋白原或凝血酶原严重减少 c)严重 F、F缺乏和凝血障碍3.血块收缩过度 见于先天性F缺乏症、严重贫血,五、凝血时间（clotting time,CT）,原理 观察血液自离体后，到玻璃试管中凝固所需时间,血液,从血管中抽出,与带负电荷表面接触,内源性凝血途径启动,纤维蛋白形成（血液凝固）,XII XIIa,参考值 6-12min（试管法）,意 义,内源性途径因子测
16、定的初筛试验延长：1.因子、严重减少，如血友病 2.凝血酶原严重减少，如严重肝病，阻塞性黄疸 3.纤维蛋白原严重减少，如DIC、纤溶亢进、先天性缺乏缩短:高凝状态（hypercoagulation state）如血栓性疾病,Routine Coagulation Assays,First the Specimen,凝血项目检查测定注意事项,抗凝剂：枸橼酸钠溶液抗凝剂与标本比例为1:9标本勿溶血、凝血标本采集、运送应在规定时间内完成,Coagulation in the Laboratory,原 理 XII 因子活化剂 Ca2+、磷脂（替代PF3）血浆 参考值 32-43s（或与正常对照相差5s
17、以内）正常对照10s以上者 延长 正常对照5s以上者 缩短,六、活化部分凝血活酶时间,（activated partial thromboplastin time,APTT）,与CT意义相同延长：1.主要检测内源性途径的凝血因子缺陷（如、）2.其次检测第二、三阶段因子，如凝血 酶原、纤维蛋白原 3.严重肝病、DIC 4.循环中抗凝物质增多 5普通肝素应用的首选监测指标,意 义,Causes for Prolonged APTT,APTT缩短：,高凝状态(hypercoagulation state)（脑血栓、心梗、DIC高凝期）,七、血浆凝血酶原时间（Prothrombin time,PT）,
18、原 理 组织因子(兔脑、胎盘、肺组织浸液)Ca2+血浆参考值 正常为11-13s，超过对照3s以上为异常,凝血酶原（PT）参考值,3s有临床意义 凝血酶原时间比值(PTR)PTR=PT被检者/PT正常(参考值为1.00.05)国际标准化比值(INR)INR=PTRISI(ISI为国际敏感度指数)(参考值为1.00.1),INR意义：不但建立了测量值与正常人的对照，而且排除了不同实验室、不同试剂之间的差异，使它的值更具有临床统一的意义。在口服抗凝剂的监测中更有统一标准的临床意义,意 义,为外源性途径的筛选试验延长：1因子II、V、VII、X 单独或联合缺乏 2严重纤维蛋白原降低（尤其1g/L时）
19、3Vitk缺乏症、严重肝病 4纤溶亢进（如DIC后期）5循环中抗凝物质增加，如 SLE 6口服抗凝剂的首选监测指标：INR 2-3,Causes for Prolonged PT,Recapping the PT and APTT,八、凝血酶时间（thrombin clotting time,TT）,原 理 标准凝血酶 血浆 参考值 16-18s 超过正常对照3s以上为延长,意 义,主要检测凝血过程第三阶段 1纤维蛋白原质与量异常 2FDP增多，如纤溶亢进 3循环中抗凝物质增多，如AT-、肝素 样物质 4异常球蛋白增多，如多发性骨髓瘤,九、血浆纤维蛋白原(Fg)定量,参考值 目前推荐凝血酶比浊
20、法，2-4g/L 4g/L为异常意 义 Fg减少：1先天性纤维蛋白原缺乏症 2DIC消耗低凝期及纤溶期 3严重肝病,Fg增高：1高凝状态：血栓性疾病、急性感染、DM、MM、手术创伤、恶性肿瘤等 2生理性：部分正常老人，妊娠晚期,十、因子、促凝活性测定,受检血浆,白陶土磷脂和Ca2+,分别加入缺乏F、F、F和F的基质血浆,【参考值】F:C 103%25.7 F:C 98.130.4 F:C 10018.4 F:C 92.420.7【意义】1.增高 主要见于血栓前状态和血栓性疾病 2.减低 F:C、F:C、F:C减低 分别见于血友病A和B、因子缺乏症 见于肝脏疾病、Vit K缺乏、DIC等,十一、
21、因子、促凝活性测定,受检血浆,兔脑粉浸出液和Ca2+,分别加入缺乏F、F、F和F的基质血浆,【参考值】F:C 97.7%16.7 F:C 102.430.9 F:C 10317.3 F:C 10319.0【意义】1.增高 主要见于血栓前状态和血栓性疾病 2.减低 见于先天性、和因子缺乏、肝脏疾病、Vit K缺乏、DIC等,十二、因子定性试验,【意义】若血浆凝块在24h内，尤其在2h内完全溶解，表示F有先天性或获得性缺乏或严重缺乏,十三、抗凝血酶活性(AT-:A)测定,【参考值】发色底物法：108.5%5.3【临床意义】1.AT-活性减低 见于先天性和获得性AT-缺乏症，后者见于肝脏疾病、DIC
22、、血栓前状态和血栓性疾病 2.AT-活性增高 见于血友病、口服抗凝剂等,十四、蛋白C活性(PC:A)测定,【参考值】发色底物法：100.2%13.18【临床意义】PC:A减低 见于先天性和获得性PC缺乏症，后者见于肝脏疾病、DIC等,十五、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)测定,【参考值】胶乳凝集法：5mg/L【临床意义】1.增高见于原发性纤溶症、DIC、恶性肿瘤、急性早幼粒细胞白血病、肺梗死、溶栓治疗等 2.FDP增高是体内纤溶亢进的标志，但不能鉴别原发性纤溶和继发性纤溶,十六、D二聚体(D-dimer,DD)测定,【参考值】胶乳凝集法为阴性 ELISA200g/L【临床意义】1.DD是纤溶酶
23、作用于交联纤维蛋白的特异性分子标记物 2.继发性纤溶症（如DIC）为阳性或增高；而原发性纤溶症不升高,从而鉴别两者,十七、血浆鱼精蛋白副凝固试验,原 理 纤溶过程中FDP 鱼精蛋白 十 游离 纤维蛋白单体 凝集参考值 正常人阴性,（plasma protamine paracoagulation test PPPT,3P试验）,意 义,阳性：1提示血中FDP增多，见于DIC/纤溶亢进 2溶栓治疗后 3假阳性：大出血（创伤、手术、咯 血、呕血）、恶性肿瘤、人工流产等阴性：1正常人 2原发性纤溶 3DIC晚期,出血性疾病(bleeding diseases),概念：是指机体正常的止血与凝血功能发生
24、障碍，导致皮肤黏膜或内脏自发性出血或轻微损伤而出血不止的一组疾病,出血性疾病的检查要点 1.出血性疾病的原因 血管异常 血小板异常 凝血或纤溶异常 抗凝因子增多 2.出血性疾病的实验室检查要点 过筛检查 特殊检查 3.弥散性血管内凝血(DIC)的基本检查,初筛试验 筛选试验 确诊试验,实验项目的选择,N N N N 凝血因子异常可能,+延长 N 不良 血小板功能异 常、vWD,+N/N N 血管因素+延长 不良 血小板量减少,束臂 Plt 血块收缩 结 果试验 BT 计数 试验 判断,APTT、PT、TT、纤维蛋白原定量检测,进一步做以下筛选试验：,凝血常规四项,凝血酶原时间（PT）活化部分凝
25、血活酶时间（APTT）纤维蛋白原水平（Fib）凝血酶时间（TT）,APTT、PT、TT、纤维蛋白原定量,1.仅有APTT延长 提示内源性途径因子异常：尤其是、IX、XI 不能用正常血浆纠正：提示抗、抗IX抗体存在,2.仅有PT延长 提示外源性因子异常(FII、V、VII、X）Vitk缺乏（II、VII、IX、X为Vitk依赖因子）严重肝病 延长不被正常血浆纠正：循环中抗凝物质增多,APTT、PT、TT、纤维蛋白原定量,3.全部异常 纤维蛋白原缺乏症 FDP增多 血中抗凝物质增多 肝功能衰竭 进一步做有关因子的测定(确诊试验),APTT、PT、TT、纤维蛋白原定量,104,凝血试验繁多,选择项目
26、时一定要注意先筛查（血小板计数、部分活化凝血活酶时间APTT、血浆凝血酶原时间PT）,再有的放矢地选择确诊试验,并力求简单、快速,先易后难,切忌不顾病人医疗负担,无目的“大撒网”地检查,筛查试验,止血:出血时间测定（BT）血小板计数（BPC）凝血:活化的部分凝血活酶时间（APTT）血浆凝血酶原时间（PT）血浆纤维蛋白原测定（Fg）纤溶：血浆凝血酶时间（TT）血浆鱼精蛋白副凝固试验（3P）(plasma protamine paracoagulation)纤维蛋白（原）降解产物测定,血栓与止血检查的临床应用,弥散性血管内凝血(DIC),发病机制:是一种发生在许多疾病基础上，由致病因素激活凝血及纤
27、溶系统，导致全身微血栓形成，凝血因子大量消耗并继发纤溶亢进，引起全身出血及微循环衰竭的临床综合征临床表现：出血,休克,栓塞,溶血,DIC的实验室检查,Patients with hemophilia characteristically have a prolonged activated partial thromboplastin time(APTT).The platelet count,prothrombin time(PT),thrombin time(TT),and bleeding time(BT)are normalfactor and activity is reduced,Hemophilia:laboratory features,血栓与止血检查项目的选择和应用,一期止血缺陷：BT、PLT（血管壁、血小板）二期止血缺陷：PT、APTT（凝血因子、病理性抗凝物质）纤溶活性亢进：FDP、DD（纤维蛋白降解产物）抗栓治疗的监测：肝素：APTT 口服抗凝剂：PT 溶栓治疗：DD、Fg/TT/FDP等,复习思考题,1.名词解释:国际标准化比值(INR)、DIC、出血时间、活化部分凝血活酶时间、血浆凝血酶原时间、血浆凝血酶时间2简述血栓与止血各种筛选试验的临床意义。3如何组合筛选试验？简述其临床应用。4简述DIC的实验室检查和诊断。,Thank you！,
