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1、微生物在药学中的应用,抗生素其它药物微生物与药物变质（自学）药物的体外抗菌试验药物制剂的微生物学检查,抗生素（antibiotics）,原始含义：由微生物产生的、能抑制其它微生物生长的物质。现指：生物（包括微生物、植物和动物）在其生命活动过程中产生的（或由其它方法获得的）、能在低微浓度下有选择性地抑制或影响它种生物机能的有机物质。,医疗用抗生素的特点,差异毒力大生物活性强、有不同抗菌谱不易使病原菌产生耐药性毒副作用小，不易引起超敏反应半衰期长，生物利用度高,抗生素的分类 抗生素产生菌的分离和筛选抗生素的制备抗生素的生物合成 抗生素的主要作用机制 抗药性抗生素的单位及效价测定,（1）按化学结构分
2、类,-内酰胺类青霉素、头孢菌素等 四环类四环素、土霉素、金霉素 氨基糖苷类链霉素、卡那霉素、庆大霉素 大环内酯类红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素 多肽类多黏菌素、杆菌肽等 多烯类制霉菌素、两性霉素B、万古霉素苯羟基胺类氯霉素蒽环类柔红霉素、阿霉素环桥类利福霉素其他,（2）按作用对象,抗G+青霉素等 抗G-链霉素等 广谱四环素、红霉素、卡那霉素、头孢菌素等。抗真菌两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素等。抗肿瘤阿霉素、丝裂霉素、柔红霉素等。,新抗生素产生菌的分离和筛选,（以放线菌为例）从土壤中分离放线菌（初筛）：采样稀释分离（涂平板）获得单菌落摇瓶 滤纸片抗菌试验筛选,抗生素生产的工艺过程,菌种 孢子制备 种
3、子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品检验 成品包装,抗药性（drug resistance）p287,定义在微生物或肿瘤细胞多次与药物接触发生敏感性降低的现象，是微生物对药物所具有的相对抗性。获得抗药性多重抗药性交叉抗药性赖药性耐受性,抗菌药物的发展史也就是细菌对其耐药性的发展史,（1）抗菌药物只要使用了足够时间，就会出现细菌耐药性，如使用青霉素25年后出现耐青霉素肺炎球菌、氟喹诺酮使用10年后出现了肠杆菌耐药；（2）耐药性是不断进化的，随着抗菌药物的应用，耐药也从低度耐药向中度、高度耐药转化；（3）对一种抗菌药物耐药的微生物可能对其他抗菌药物也耐药；（4）细菌耐药性的消亡很慢；（5）
4、使用抗菌药物治疗后，患者容易携带耐药菌。,一、抗药性产生的遗传机制1、自发突变与药物选择（1）由敏感菌的遗传物质自发突变产生。（2）药物选择的结果是杀死敏感菌，耐药菌富集。2、细胞间抗药性的基因转移染色体上的耐药基因通过接合、转化、转导和转座子而转移。质粒上的耐药基因自行复制，代代相传，并在不同种属间转移（性菌毛的接合作用）,二、抗药性产生的生物化学机制,（1）产生钝化酶；（2）抗菌药物作用靶位的改变；（3）细胞膜通透性的改变，使抗菌药物不能进入细菌细胞或被细菌细胞膜的药物泵排出细胞；（4）形成细胞外膜，为细菌躲避抗菌药物作用提供场所,-内酰胺酶抗生素耐药菌产生耐药的-内酰胺酶。（钝化酶）-内
5、酰胺类抗生素的原始靶位为PBPs（penicillin-binding protein），耐药菌的PBPs的数目、位置、与抗生素亲和力发生改变，青霉素失活。（靶位的改变）磺胺类耐药菌株合成了对磺胺不敏感的二氢叶酸合成酶，而引起耐药。（靶位的改变）喹诺酮类耐药菌的gyrA(gyrase)基因突变，DNA螺旋酶A亚单位的变化，对该类药物不敏感。其中，gyrase（DNA旋转酶）为一种类型的拓扑异构酶，引入负超螺旋至闭环双链DNA中。（靶位的改变）,绿脓杆菌对-内酰胺类耐药，细菌外膜限制抗生素分子渗入膜内。四环素耐药菌由耐药决定簇编码的膜定位蛋白介导使四环素从细菌细胞流出而耐菌。（细胞膜通透性的改变
6、）,三、耐药性的控制,1、避免耐药菌传播（医院）2、合理用药（1）抗生素可不用尽量不用，使用时应足量。（2）合理联合用药3、抗耐药菌新抗生素的寻找，如酶抑制剂抗生素等。4、耐药机制的研究耐药规律寻找，有助于合理用药。,四、耐药性和青霉素酶的测定,1、耐药性药敏试验2、青霉素酶耐药菌接平板培养 加含青霉素的淀粉 加I2出现透明圈（eg.金葡菌产酶株）。,MIC和MBC的测定杀菌曲线,最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC),第二十章 药物的体外抗菌试验,试管
7、连续稀释法 适用于试验菌数量较少的场合，试验工作量大。平板倍比稀释法 目前抗生素的临床前研究一般采用此法。平板倍比稀释法是根据药物在琼脂培养基中扩散的原理，将细菌接种在含有不同浓度抗生素的平板上恒温培养1618小时，可抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC），可杀灭细菌的最低药物浓度为最低杀菌浓度（MBC）。MIC或MBC值愈小，则药物的抑菌或杀菌作用愈强。最低杀菌浓度(MBC)测定将系列稀释的抗菌药物溶液与试验菌液(终浓度为105-106CFU/ml)混合，对照管不含抗菌药物，经37，1820h孵育后，将无细菌生长的各管培养液转种于不含抗菌药物的琼脂平皿表面，37再孵育18h，细菌
8、减少99.9%的最低药物浓度。,将菌悬液与一定浓度的药物混合，使其浓度为105 CFU/ml左右，于37恒温培养，定时取样进行平板活菌计数。以细菌浓度对数为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制杀菌曲线。实验应包括空白对照和阳性对照。药物的杀菌效果越好，细菌浓度随培养时间下降的越快，药效越好。,乳酸左氧氟沙星对大肠埃希氏菌763(2MBC=0.125mg/ml)的杀菌曲线1：对照；2：乳酸左氧氟沙星对大肠埃希氏菌为24h杀死全部细菌。,一、抗生素的效价单位,效价（potency）：在同一条件下比较抗生素检品和标准品的抗菌活性，从而得出检品的效价。检品的抗菌活性 标准品的抗菌活性单位（unit,u）是衡
9、量抗生素有效成分的具体尺度。,效价,100,各种单位：1 重量单位 以抗生素活性部分的重量为单位，1mg=1000 U2 类似重量单位 以抗生素盐类纯品的重量为单位，1mg=1000 U3 重量折算单位 以原始的生物活性单位相当的实际重量为1单位加以折算，如青霉素G钠盐：1mg=1667u（以50ml肉汤中抑制金葡菌生长的最小青霉素量为1 U）4 标准品与商品同质的、纯度较高的抗生素，每毫克含有一定量的单位，可供作测定效价的标准。我国由中国药品生物制品检定所分发5 标示量抗生素制剂标签上的标量（单位或重量）,物理方法化学方法微生物学方法稀释法比浊法琼脂扩散法 管碟法二剂量法（常用）,抗生素的效
10、价测定管碟法,抗生素的效价测定管碟法,原理：抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用抗生素在一定浓度范围内，其浓度和抑菌圈直径成曲线关系,=D antilog（IV/W)W=(SH+UH)-(SL+UL)V=(UH+UL)-(SH+SL)I=lg 高剂量/低剂量=lg 2（一般）D=高剂量（标准品）/高剂量（检品）1（一般）,氨基酸维生素 甾体化合物 酶与酶抑制剂 菌体制剂与活菌制剂（微生态制剂）核酸类药物免疫调节剂受体拮抗剂 微生物多糖 微生物免疫制剂微生物毒素其他,酶抑制剂（非感染性的生理疾病与人体某些酶的失控有关。）卡普托利是血管紧张素转移酶抑制剂：降血压Prosca是5-睾丸酮还原酶抑制
11、剂：治疗前列腺肥大乌苯美司是氨肽酶（细胞表面的一种水解酶）抑制剂：刺激细胞免疫作用，用作肿瘤辅助治疗。洛伐他汀即1，3-羟基戊二酰辅酶A（HMGCoA）是还原酶抑制剂：治疗高血压普伐他汀：降血脂药阿卡波糖是-葡萄糖苷酶抑制剂：治疗糖尿病、肥胖与餐后高血糖 伏格列波糖是-葡萄糖苷酶抑制剂，用于治疗糖尿病。,通过分离参与各种病的酶，是能否找到有效的酶抑制剂最重要的步骤。有了自己独特的筛选模型，就能创造新药。从蛋白激酶-C抑制剂中分离到了有抗肿瘤活性的物质，从HIV蛋白酶抑制剂中找到了有可能治艾滋病的药物。,胆固醇是高血压的重要原因，胆固醇生成的一个限速性步骤是1，3-羟基戊二酰辅酶A（HMGCoA
12、）经过HMG-CoA还原酶的作用，经3-甲-3，5-二羟戊酸至鲨烯，最后生成胆固醇。若这个限速性还原反应被抑止，就可以抑制胆固醇的生成。根据这种机理，Merck公司从土曲菌中找到HMG-CoA还原酶抑制剂，并把它开发成为洛伐他汀。,1987年，Merck公司的降血脂药物洛伐他订（lovastatin，Mevacor）获FDA批准上市后，立即引起了医学界的关注，该药的成功开创了降血脂药物的崭新阶段。其后，先后又有辛伐他汀（simvastatin，Zocor）、普伐他汀（Pravastatin,Mevalotin）、氟伐他汀（fluvastatin,Lescol）上市。第5个上市的是辉瑞公司的阿托
13、伐他汀（atorvastatinCa，Lipitor），后者为他汀类药物中唯一能明显降低高胆固醇血症病人升高的低密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯的药物。第6个上市的是拜耳公司的西立伐他汀（cerivatatin，Lipobay），但该药因不良反应于2001年8月撤下。尽管如此，他汀家庭依然人丁兴旺，在降血脂药物中占据极为重要的一席。,食物中的淀粉经口腔唾液、胰淀粉酶消化成低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经-葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理状态下，小肠上，中、下三段均存在-葡萄糖苷酶，在服用-葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制,而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间
14、后延，从而对降低餐后高血糖有益,在长期使用后亦可降低空腹血糖。,微生物菌体制品,利用微生物制作的保健品，含有活的菌体，如昂立1 号、丽珠肠乐、整肠生等，也有以死菌体的制品，如冬虫夏草、灵芝孢子等，其中也存在微生物的部分代谢产物。,免疫调节剂 乌苯美司（激活人体细胞免疫功能，刺激细胞因子的生成和分泌，促进抗肿瘤效应细胞的产生和增殖）环胞菌素A（免疫排斥作用，抑制T淋巴细胞增殖、分化等，影响淋巴细胞的功能，）。藤霉素（FK506）雷泊霉素（免疫抑制剂）对器官移植、风湿性关节炎、肾硬变综合征和牛皮癣、红斑狼疮等无特效药可冶的免疫病有效。,受体拮抗剂 受体是细胞中一类生物活性分子，其功能是特异性地识别
15、和结合化学信使，如药物激素、神经递质等配基，然后在体内放大其反应，是体内信息传递的重要途径。根据对受体配基结合的拮抗作用，可以筛选出特异性强、毒性小的具有药理作用的药物。,担子菌类真菌，如灵芝、香菇、黑木耳、白木耳、茯苓、冬虫夏草等等食用菌和药用菌，有许多有效的医疗价值。真菌多糖对于人体具有免疫调节和激活淋巴细胞的功能，可作为免疫增强剂，从而可以提高人体抵御各种感染和抗肿瘤等方面的能力。香菇多糖(lentinan)就是一个典型的 T 细胞激活剂。冬虫夏草多糖(CP)、蜜环菌多糖 AP、树舌灵芝多糖(G-Z)、银耳多糖(TP)、猴头多糖(HEPS)、块菌多糖(PST)、裂褶菌多糖(SPG)等都能
16、在体外显著增强半刀豆球蛋白 A(Con A)诱导的淋巴细胞增殖。,微生物免疫制剂,1、人工自动免疫制剂 是专用于免疫预防的制剂，主要指各种疫苗。目前已知的疫苗可分为活苗，死苗，代谢产物和亚单位疫苗以及生物技术疫苗等。2、人工被动免疫制剂 将免疫血清或自然发病康复后的动物血清人工输入未免疫的动物，使其获得对某种病原的抵抗力，这种免疫接种方法成为人工被动免疫。人工被动免疫制剂是专用于免疫治疗的免疫制剂，可分为特异性与非特异性免疫治疗剂两大类。,微生物毒素的药物应用 细菌毒素有葡萄球菌毒素、链球菌外毒素、肉毒毒素、霍乱弧菌毒素、志贺氏菌毒素、白喉杆菌毒素、炭疽杆菌毒素、梭菌毒素等等。真菌毒素有黄曲霉
17、毒素、麦角、杂色曲霉素、烟曲霉震颤素、玉米赤霉烯酮、毒蘑菇毒素等等。,（事物的两面性）寻找新药的资源库。（1）可直接用作药物，如肉毒毒素可用于治疗重症肌无力和功能性失明的眼睑及内斜视。利用白喉毒素的 A 链与多种癌症细胞抗体连接研制出导向抗癌药物。（2）以微生物毒素为模板，改造和设计抗病抗癌和治疗新药。（3）作为外毒素菌苗使用，如肉毒毒素、白喉类毒素、炭疽毒素、金黄色葡萄球菌毒素、破伤风毒素，等。（4）作为超抗原（SAg）使用，是多克隆有丝分裂原，激活淋巴细胞增殖的能力远比植物凝集素高 10100 倍，可用于治疗自身免疫性疾病。（5）从毒蘑菇毒素中寻找抗癌新药。,血管紧张素与其受体结合后的复合
18、物，会引起高血压。已筛选到的血管紧张素受体拮抗剂Losartar有降血压作用，已上市。从曲霉分离到的Asperlicin是缩胆囊素受体拮抗剂，它是肽类激素，对胰液和胃液的分泌、胆囊收缩及肠道运动有调节作用，有可能作为治疗与缩胆囊素有关的胃肠系统疾病。从链霉菌分离到的六肽类催产素受体拮抗剂，有可能用于延缓早产。目前研究的还有内皮素受体拮抗剂、肾上腺受体拮抗剂、白三烯受体拮抗剂以及艾滋病的CD4gp120结合拮抗剂。,第二十一章 药物制剂的微生物学检查,灭菌制剂的无菌检查非灭菌制剂的微生物限度检查,注射剂 眼科制剂 手术用品（敷料、缝合线、无菌器具等）,灭菌制剂,一般药品的无菌检查直接接种法,需氧
19、菌、厌氧菌、霉菌的检查需氧菌：3035，7天 厌氧菌：3035，7天 霉 菌：2025，7天 观察培养液是否混浊或涂片染色镜检,阳性对照（24 h有菌生长）金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003 生孢梭状芽胞杆菌CMCC（B）64941 白色念珠菌CMCC（F）98001,二、特殊药品的无菌检查法1、油类药物用吐温培养基2、抗菌药物或含防腐剂药物适宜的培养基青霉素加入青霉素酶 磺胺药对氨基苯甲酸培养基（可使菌合成叶酸，不被干扰）培养基稀释药品至不抑制微生物生长薄膜过滤法,结果判定：阳性对照长菌 阴性对照不长菌 样品不长菌无菌检查合格,第二节 非灭菌制剂的微生物限度检查,适用于非灭菌制剂（口服及外用药）及其原辅料，检测项目：细菌总数测定霉菌（酵母）总数测定控制菌的检查活螨的检查,一、细菌总数测定(琼脂倾注平皿计数)1 阴性平板不长菌2 细菌37培养2448 h3 细菌总数结果报告方式（1）高、低稀释度菌落数在30300以内，计算比值；（2）比值2，以高稀释度平均值为准；（3）比值2，以低稀释度为准。,二、霉菌（酵母）总数测定,虎红培养基，2528，4872 h，550个菌落,三、控制菌（质控菌）的检查1 口服药不能检出沙门氏菌、大肠杆菌2 外用药、眼科制剂不能检出金葡菌、绿脓杆菌、破伤风梭菌。,EMB,用放大镜检查节肢动物螨虫是否存在。,四、活螨的检查,
