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1、细菌的感染与致病机理,动物医学院张 炜,内容提要,细菌是否有致病性，经典的依据是柯赫法则，近年来提出的分子水平的柯赫法则对此标准作了补充和完善。就某种病原菌而言，其致病性一般通过测定LD50以及ID50来定量。细菌的致病性在很大程度上取决于其毒力因子，包括侵袭力与毒素，以及毒力因子的分泌系统。毒素有外毒素与内毒素之分,几个概念,感染（infection）是指病原微生物在宿主体内持续存在或增殖。发病（disease）表示病原微生物感染之后，对宿主造成明显的损害。病原菌（pathogenic bacteria）是指那些导致机体发病的细菌。是一群高度特化了的微生物，为了自身的生存，已适应而且必须在宿
2、主生物体内持续存在或增殖，有时可造成宿主发病。,微生物学研究侧重于感染。因为感染的范围更广，发病仅仅是感染可能出现的后果之一。感染不一定都导致发病，而发病则离不开感染。如将防治传染病的重点转移到预防感染，则可收到事半功倍之效。,第一节 细菌的致病性和毒力,一定种类的病原菌在一定的条件下，能在宿主体内引起感染的能力称为致病性（pathogenicity）病原菌致病力的强弱程度称为毒力（virulent），同一细菌的不同菌株，其毒力不一样，因此，毒力是菌株的特征。,科赫,细菌致病性的确定,柯赫法则（Kochs postulates）由德国细菌学家罗伯特柯赫（Robert Koch）于1890年提出
3、，是确定某种细菌是否具有致病性的主要依据,柯赫法则要点,特殊的病原菌应在同一疾病中查见，在健康者不存在 此病原菌能被分离培养而得到纯种 此纯培养物接种易感动物，能导致同样病症 自实验感染的动物体内能重新获得该病原菌的纯培养,Kochs postulates,The microorganism must be found in abundance in all organisms suffering from the disease,but not in healthy organisms.The microorganism must be isolated from a diseased or
4、ganism and grown in pure culture.The cultured microorganism should cause disease when introduced into a healthy organism.The microorganism must be reisolated from the inoculated,diseased experimental host and identified as being identical to the original specific causative agent.,贡献举例,柯赫法则在确定细菌致病性方面
5、具有重要意义，在“柯赫原则”原理指导下产生的纯培养技术，1882-1900年间，许多在欧洲流行的感染性疾病的病原都被分离出来了，如斑疹伤寒、痢疾、梅毒、淋病、肺炎和结核,可以将非感染性疾病与感染性疾病区分开.中毒性疾病营养缺乏性疾病鱼类缺氧死亡,易与感染性疾病混淆,牛栎树叶中毒,维生素E缺乏,鱼翻塘死亡,不足之处,具一定的局限性，某些情况并不符合该法则健康带菌或隐性感染，例:幽门螺杆菌研究表明，超过90%十二指肠溃疡和80%左右的胃溃疡，都是由幽门螺杆菌感染所导致的。成人感染率,无症状者可达50%左右,有些病原菌迄今仍无法在体外人工培养 只有1%不到的微生物可以人工培养有的则没有可用的易感动物
6、 主要是指只感染人类或大动物的疾病,基因水平的柯赫法则”（Kochs postulates for genes）应在致病菌株中检出某些基因或其产物，而无毒力菌株中无。如有毒力菌株的某个基因被损坏，则菌株的毒力应减弱或消除。或者将此基因克隆到无毒菌株内，后者成为有毒力菌株,将细菌接种动物时，这个基因应在感染的过程中表达在接种动物检测到这个基因产物的抗体，或产生免疫保护。该法则也适用于细菌以外的微生物，如病毒,细菌毒力的测定 半数致死量（median lethal dose,LD50）是指能使接种的实验动物在感染后一定时限内死亡一半所需的微生物量或毒素量。,测定LD50应选取品种、年龄、体重乃至性
7、别等各方面都相同的易感动物，分成若干组，每组数量相同，以递减剂量的微生物或毒素分别接种各组动物，在一定时限内观察记录结果，最后以生物统计学方法计算出LD50。由于半数致死量采用了生物统计学方法对数据进行处理，因而避免了动物个体差异造成的误差。,半数感染量（median infectious dose,ID50）某些病原微生物只能感染实验动物、鸡胚或细胞，但不引致死亡，可用ID50来表示其毒力。测定的方法与测定LD50类似，只不过在统计结果时以感染者代替死亡者。,第二节 细菌的毒力因子及分泌系统,构成细菌毒力的物质称毒力因子（virulence factor），主要有侵袭力和毒素，此外有些毒力因
8、子尚不明确。近年来的研究发现，细菌的许多重要毒力因子的分泌与细菌的分泌系统有关。,侵袭力（invasiveness）,病原菌在机体内定殖，突破机体的防御屏障，内化作用，繁殖和扩散，这种能力称为侵袭力。,定 殖,干扰或逃避宿主的防御,抗吞噬作用 抗体液免疫机制内化作用在体内扩散,粘附素,定殖（colonization）,细菌感染第一步是体内定殖，前提是细菌要粘附在宿主消化道、呼吸道、生殖道、尿道及眼结膜等处，以免被肠蠕动、粘液分泌、呼吸道纤毛运动等作用所清除。,凡具有粘附作用的细菌结构成份，统称为粘附素（adhesin），通常是细菌表面的一些大分子结构成份，主要是革兰阴性菌的菌毛，其次是非菌毛粘
9、附素，如某些外膜蛋白（OMP）以及革兰阳性菌的脂磷壁酸（LTA）等。,某些粘附素无宿主特异性及组织嗜性 如F1（1型菌毛）能与细胞表面的D甘露糖残基结合大多数粘附素具有宿主特异性及组织嗜性 如大肠杆菌的F4（K88）菌毛仅粘附于猪的小肠前段，F6（987P）仅粘附于猪的小肠后段细胞或组织表面与粘附素相互作用的成份称为受体（receptor），多为细胞表面糖蛋白，部分粘附素受体为蛋白质，最有代表性的是细胞外基质（extracellular matrix,ECM),干扰或逃避宿主的防御机制,病原菌粘附于细胞或组织表面后，必须克服机体局部的防御机制，特别是要干扰或逃避局部的吞噬作用及分泌抗体介导的免
10、疫作用，才能建立感染。几种主要的作用方式:抗吞噬作用 抗体液免疫机制内化作用（internalization）在体内扩散,抗吞噬作用,不与吞噬细胞接触，如通过外毒素破坏细胞骨架以抑制吞噬细胞的作用，如链球菌溶血素等。抑制吞噬细胞的摄取，如荚膜、菌毛和链球菌的M蛋白。在吞噬细胞内生存，如沙门氏菌的某些成份可抑制溶酶体与吞噬小体的融合；再如李氏杆菌被吞噬后，很快从吞噬小体中逸出，直接进入细胞质。杀死或损伤吞噬细胞，细菌通过分泌外毒素或蛋白酶来破坏吞噬细胞的细胞膜，或诱导细胞凋亡，或直接杀死吞噬细胞。,抗体液免疫机制 抗原伪装或抗原变异，前者主要是在细菌表面结合机体组织成份，如金黄色葡萄球菌通过细胞
11、结合性凝固酶结合血纤维蛋白，或通过SPA结合免疫球蛋白。分泌蛋白酶降解免疫球蛋白，嗜血杆菌等可分泌IgA蛋白酶，破坏粘膜表面的IgA。通过LPS、OMP、荚膜及S层等的作用，逃避补体，抑制抗体产生。,内化作用（internalization）指某些细菌粘附于细胞表面之后，能进入吞噬细胞或非吞噬细胞内部的过程。细菌通过这种移位作用进入深层组织，或进入血循环，从感染的原发病灶扩散至全身或较远的靶器官。宿主细胞为进入其内的细菌提供了一个增殖的小环境和庇护所，使细菌逃避宿主免疫机制的杀灭。,鼠伤寒沙门氏菌内化作用过程示意（据Salyers等）,在体内增殖 细菌在宿主体内增殖是感染的核心问题，增殖速度对
12、致病性极其重要，如果增殖较快，细菌在感染之初就能克服机体防御机制，易在体内生存。反之，若增殖较慢，则易被机体清除。铁是许多细菌生长所必需，然而宿主体内无游离铁存在，细菌通过获铁系统为细菌生长提供所需的铁，获铁系统包括生产和利用铁载体或直接利用宿主的含铁化合物，如血红转铁蛋白、乳铁蛋白等。赤藓醇（erythritol）能刺激布氏杆菌在体内的生长。雄性及妊娠母畜生殖系统中有赤藓醇存在，因此布氏杆菌可在其中大量增殖，其感染局限于生殖系统。,在体内扩散 细菌分泌的蛋白酶称为胞外蛋白酶（extracellular proteinase），它们具有多种致病作用，例如激活外毒素、灭活血清中的补体等，有的蛋白
13、酶本身就是外毒素。此外，最主要的作用是作用于组织基质或细胞膜，增加其通透，利于细菌扩散。此类常见的有透明质酸酶（hyaluronidase），旧称扩散因子（spreading factor），分解结缔组织的透明质酸，葡萄球菌、链球菌等可产生。胶原酶（collagenase），主要分解ECM中的胶原蛋白，见之于梭菌、气单胞菌等。神经氨酸酶（neuraminidase），主要分解肠粘膜上皮细胞的细胞间质，霍乱弧菌及志贺菌可产生。,磷脂酶（phospholipase）又名毒素，可水解细胞膜的磷脂，产气荚膜梭菌等产生。卵磷脂酶（lecithinase），分解细胞膜的卵磷脂，产气荚膜梭菌等产生。激酶（k
14、inase），能将血纤维蛋白溶酶原激活为血纤维蛋白溶酶。包括链球菌产生的链激酶和葡萄球菌等产生的激酶，以分解血纤维蛋白，防止形成血凝块。凝固酶（coagulase），细菌在体内的扩散也可通过内化作用完成。特别是细胞结合性凝固酶，可为细菌提供抗原伪装外，使之不被吞噬或机体免疫机制所识别。见于致病性金黄色葡萄球菌。,毒素（toxin）,细菌毒素按其来源、性质和作用等的不同，可分为外毒素内毒素 在大多数情况下，外毒素一般简称毒素,外毒素（exotoxin）,定义：是某些病原菌在生长繁殖过程中所产生的对宿主细胞有毒性的可溶性蛋白质。大多数外毒素在菌体内合成后必须分泌于胞外，故名“外毒素”。但也有少数外
15、毒素存在于菌体细胞的胞周间隙，只有当菌体细胞裂解后才释放至胞外。多种细菌能产生外毒素，如肉毒梭菌、破伤风杆菌、白喉棒状杆菌、炭疽杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌。,特性,通常具有菌种特异性，如破伤风梭菌产生破伤风毒素、炭疽杆菌产生炭疽毒素、霍乱弧菌产生霍乱毒素等。毒性强，如1mg纯化的肉毒毒素能杀死2000万只小鼠。外毒素的毒性具有往往有高度的特异性。破伤风毒素选择性地作用于脊髓前角运动神经细胞，引起肌肉的强直性痉挛肉毒毒素选择性地作用于眼神经和咽神经，引起眼肌和咽肌麻痹也有一些毒素具有相同的作用，霍乱弧菌、大肠杆菌、金葡菌等许多细菌均可产生作用类似的肠毒素。,外毒素具有良好的免疫原性可刺激机体产生特
16、异性的抗体，而使机体具有免疫保护作用，这种抗体称为抗毒素（antitoxin），可用于紧急治疗和预防。外毒素在0.4%甲醛溶液作用下，经过一段时间可以脱毒，但仍保留原有抗原性，称之为类毒素（toxoid）。类毒素注入机体后，仍可刺激机体产生抗毒素，可作为疫苗进行免疫接种。,多数外毒素不耐热，一般在6080经10min80min即可失去毒性，但也有少数例外，如葡萄球菌肠毒素及大肠杆菌热稳定肠毒素（ST）能耐100 30min。外毒素与酶都是蛋白质，许多性质相似，如易被热、酸及蛋白水解素酶灭活，具有很高的生物学活性，并具特异性。,组成,大多数外毒素由A、B两种亚单位组成。A亚单位为毒素的活性中心，
17、称活性亚单位，决定毒素的毒性效应。B亚单位称结合单位，能使毒素分子特异性地结合在宿主易感组织的细胞膜受体上，并协助A亚单位穿过细胞膜。A、B亚单位单独均无毒性，A亚单位必须在B亚单位的协助下，结合至受体释放到细胞内，才能发挥毒性作用，因此毒素结构的完整性是其致病的必备条件。B亚单位可单独与细胞膜受体结合，并阻断完整毒素的结合，B亚单位可刺激机体产生相应的抗体，从而阻断完整毒素结合细胞，可作为良好的亚单位疫苗。,分类,目前尚未统一，比较简明的是根据其性质分类A-B型毒素、攻膜毒素以及超抗原毒素三类。,定义：内毒素特指革兰阴性菌外膜中的脂多糖（LPS）成分，细菌在死亡后破裂或用人工方法裂解菌体后才
18、释放。,内毒素（endotoxin）,组成 LPS由O特异多糖侧链、非特异核心多糖和类脂A三个部分组成。具有毒性的部分是类脂A。类脂A高度保守，肠杆菌科细菌的类脂A结构完全一样。,特性,革兰阴性菌内毒素的毒性作用都大致相同，引致发热、血循环中白细胞骤减、弥散性血管内凝血、休克等，严重时亦可致死。内毒素耐热，加热100经1h仍不被破坏，必须加热160经24h，或用强酸、强碱或强氧化剂煮沸30min才失活。不能被甲醛脱毒成类毒素。内毒素的抗原性较弱，将内毒素注入机体可产生针对其中多糖抗原的相应抗体，但此抗体并无中和内毒素毒毒性的作用。,细菌外毒素和内毒素的基本特性比较,型分泌系统（Type sec
19、retion system）,细菌的分泌系统的发现是近年为细菌致病机制研究的重要进展，其中的型分泌系统与动植物的许多革兰阴性病原菌的毒力因子的分泌有关。在病原菌与宿主细胞接触后，这一系统得以启动，具有接触介导的特征。启动后细菌分泌与毒力有关的多种蛋白质，与相应的伴侣蛋白（chaperone）结合，从细菌的胞浆直接进入宿主细胞胞浆，发挥毒性作用。,第三节 机会致病菌,所谓机会致病菌是指某些细菌通常并不主动入侵宿主，但当宿主的免疫屏障被打开或免疫功能异常时，这类细菌就会进入机体的血液或组织，造成感染并致病。也就是说，宿主给它们提供了感染的机会。,就某种细菌而言，在某种宿主可能是专性致病菌，但对另一
20、种宿主则可能成为机会致病菌，猪链球菌球2型（Streptococcus suis type 2，SS2）是典型的例子。有些机会致病菌本是正常共栖菌或环境常在菌，但当宿主免疫功能受损或正常菌群遭破坏时，本来并无侵袭性的这些细菌“乘虚而入”，得以感染，而对宿主致病。例如抗生素使用失当的犬，往往发生化脓性皮炎，病原为葡萄球菌。,第四节 细菌毒力的增强与减弱,细菌毒力减弱的方法:长时间在体外连续培养传代在高于最适生长温度条件下培养:炭疽 在含有特殊物质的培养基中培养:卡介苗 在特殊气体条件下培养:如无荚膜炭疽芽胞苗是半强毒菌株在含50%动物血清的培养基上，在50%CO2的条件下选育的 通过非易感动物:猪丹毒通过豚鼠370代后，又通过鸡42代选育而成 通过基因工程的方法:去除毒力基因或用点突变,细菌毒力增强的方法,在自然条件下，回归易感动物是增强细菌毒力的最佳方法。易感动物既可是本动物，也可是实验动物。也可采用分子生物学技术改造毒力基因，达到增强毒力的目的。,谢 谢,
