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1、园 艺 学 报 2014，41（6）：12361244 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131213；修回日期：20140410 基金项目：福建省科技厅区域重大项目（2010N3001）；福建农林大学园艺植物种质与高优生产技术创新团队项目（cxtd12013） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ynxtea，guixinchen；Tel：0591-83795093） 茉莉花香气相关基因JsDXS及其启动子的克隆与表达分析 孙
2、 君1，陈桂信1,*，叶乃兴1,2,*，吕恃衡1，刘志钦3，黄 玮1，林志达1 （1福建农林大学园艺学院，福州 350002；2福建农林大学茶叶科技与经济研究所，福州 350002；3福建农林大学生命科学学院，福州 350002） 摘 要：以双瓣茉莉花瓣为材料，采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法，获得茉莉花香气形成限速酶即5磷酸脱氧木酮糖合成酶（Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase，DXS）基因（命名为JsDXS）；采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列；采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在花瓣发育过程中的表达动态。结果表明，JsDXS全长cDNA
3、 为2 505 bp，其中ORF（Open Reading Frame）为2 145 bp，编码714个氨基酸，含有TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like和Transketolase C等保守功能结构域；分离得到JsDXS基因上游调控序列745 bp，其含启动子核心元件TATA-box及T/GBOXATPIN2（茉莉酮酸酯相关元件）、CIACADIANLELHC（生物钟相关元件）、MYCCONSENSUSAT（低温相关元件）等与花香形成相关的重要顺式作用元件；荧光定量PCR分析表明，该基因在18：00时表达量较低，随着时间的推移逐渐上调，到夜间22：00时表达量达到最高，逐渐又
4、出现下调的趋势，直至凌晨2：00时表达量降到最低，说明该基因的表达受生物钟的控制。 关键词：茉莉花；香气；5磷酸脱氧木酮糖合成酶；启动子；顺式作用元件；表达分析 中图分类号：S 685.16 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1236-09 Cloning and Expression Analysis of Deoxyoxylulose-5-phosphate Synthase Gene Related to Aroma from Jasminum sambac and Isolation of Its Promoter SUN Jun1，CHEN Gui-xin
5、1,*，YE Nai-xing1,2,*，L Shi-heng1，LIU Zhi-qin3，HUANG Wei1，and LIN Zhi-da1 （1College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2The Institute of Tea Science and Technology and Economy，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；3College of Life S
6、cience，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China） Abstract：The full length cDNA sequence of Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase gene（JsDXS）was cloned from Jasminum sambacby using RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends（RACE）method. According to the 2 505 bp sequence，the prom
7、oter of JsDXS was isolated using Genome Walking Method. The gene expression pattern in blooming was analyzed by the real-time PCR. Gene structure 6期 孙 君等：茉莉花香气相关基因JsDXS及其启动子的克隆与表达分析 1237 analysis showed that the full length cDNA contained a 2 145 bp open reading frame（ORF），encoding a protein of 714
8、amino acid. There were several conserved domains，such as TPP-DXS，TPP-PYR-DXS- TK-like，Transketolase C，etc. One 745 bp sequence was found to be the promoter of JsDXS，which contained many cis-acting elements，such as TATA-box，T/GBOXATPIN2（related to jasmonate signaling），MYCCONSENSUSAT（related to cold s
9、tress），CIACADIANLELHC（necessary for circadian expression）. The real-time PCR analysis revealed that the gene expression at 18：00 was low and started to increase and reached a maximum at 22：00，and then started to decrease and reached a minimum at 2：00. This phenomenon perhaps illustrated that the exp
10、ression of JsDXS was regulated by circadian. Key words：Jasminum sambac；aroma；deoxyoxylulose-5-phosphate synthase；promoter；cis-acting element；expression analysis 茉莉花Jasminum sambac（L.）Ait是木犀科（Oleaceae）素馨属（Jasminum）茶用香花植物。茉莉花茶质量的优劣取决于花朵的质量，尤其是花朵中香气释放量与持续时间。前人对茉莉花品种形态特征和香气特性做了大量研究（郭友嘉 等，1993，1994；张丽霞 等
11、，2002；叶乃兴 等，2007；杨江帆，2008；李鹤，2012），发现茉莉花香气成分中含芳樟醇、法呢烯、石竹烯、橙花叔醇、依兰油烯、萜品醇等萜类化合物，烯萜类物质为茉莉花香气中最多的一大类。DXP（1脱氧D木酮糖5二磷酸）途径是1条类萜物质前体合成途径，提供萜类物质生物合成的基本骨架异戊烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（Dimethy lallyl diphosphate，DMAPP）。DXS（5磷酸脱氧木酮糖合成酶）在该途径中以丙酮酸和磷酸甘油醛为底物，生成DXP，是该途径中第1个限速酶，是萜类物质代谢工程的重要靶点（Estvez
12、et al.，2001；潘夕春 等，2007），对茉莉花萜烯类物质的形成具有重要作用。 DXS最早从大肠杆菌中分离出来（Sprenger et al.，1997），在植物中最早得到DXS的是拟南芥Arabidopsis thaliana和胡椒薄荷Mentha piperita（Lange et al.，1998），随后又从番茄Solanum lycopersicum（Lois et al.，2000）、甜叶菊Stevia rebaudiana（Tott et al.，2003）、菊花Chrysanthemum morifolium（Kishimoto & Ohmiya，2006）、橡胶Heve
13、a brasiliensis（Seetang-Nun et al.，2008）、阳春砂Amomum villosum（Yang et al.，2012）等多种植物中克隆到，Muoz-Bertomeu等（2006）将拟南芥DXS转入薰衣草（Lavandula angustifolia）后，其单萜烯精油的含量显著提高，子一代仍然具有转基因亲本的特性，且形态和生长习性等均无变化。 本研究中以开放的双瓣茉莉花瓣为材料，采用RT-PCR和RACE技术，分离得到JsDXS全长cDNA，对该基因进行生物信息学分析，找出JsDXS的功能结构域。采用染色体步移技术，分离JsDXS上游的启动子序列，发现启动子中含
14、有多个与生物钟相关等顺式作用元件。采用荧光定量PCR技术，分析JsDXS在花不同发育时期的表达模式，为将来深入研究JsDXS在茉莉花香气释放中的功能奠定基础，以期为生产上调控茉莉花香强度和释香时间提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 茉莉花瓣总RNA及茉莉花基因组DNA的提取 茉莉花供试材料为双瓣茉莉花，于2012年6月取自福建农林大学茉莉花种质资源圃。 采用改良CTAB法提取茉莉花瓣总RNA（郑鸿昌，2012）；采用Biospin植物基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司cat#BSC13S1）提取茉莉花基因组DNA。 1238 园 艺 学 报 41卷 1.2 JsDXS保守区、5R
15、ACE、3RACE及全长ORF的PCR扩增 以茉莉花总RNA为模板，参考郑鸿昌（2012）的方法，合成双链cDNA，于20 保存备用。根据已报道的油橄榄（Olea europaea）、丹参（Salvia miltiorrhiza）、连翘（Forsythia suspense）、金鱼草（Antirrhinum majus）等DXS基因序列，用DNAMAN设计出保守区简并引物。DXS-R：5-TGGGA(T/C)GT(C/T)GG(T/C)CA(C/T)CAG(G/T)(C/T)-3；DXS-F：5-GC(T/C)TC(G/A)TC(A/T)GA (A/T)GGAGCCAT-3。PCR扩增体系：2
16、.5 L 10 Ex-Taq，Buffer（Mg2+ Plus），4 L dNTPs（2.5 mmol L-1），1 L模板，0.5 L DXS-R，0.5 L DXS-F，0.2 L Ex-Taq酶（5 U L-1），补ddH2O至25 L体系。95 预变性5 min，95 变性30 s，53 退火45 s，72 延伸90 s，35个循环，最后72 延伸10 min进行PCR扩增。根据保守区克隆结果分别设计特异性5RACE和3RACE引物（Primer Premier 5软件）。5-DXS：5-AGTAGTTCGTGTATGACTGAGTTGGTGC-3；3-DXS：5-CATGCAAAGG
17、GCTTATGACCAGGTAGTGC-3。将保守区PCR体系中引物改为0.5 L 5-DXS/3-DXS，0.25 L接头引物L4M，并补ddH2O至25 L，并将保守区PCR扩增程序中的退火温度提高至55 进行PCR扩增。将获得的全长cDNA，在其ORF两端设计特异引物（qDXS-R：5-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3；qDXS-F：5-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3）扩增全长序列。 1.3 JsDXS启动子的分离 依据加拿大Bio S & T Inc的Genome Walking kit试剂盒，从起始密码子下游200 bp内设计3条巢式引物
18、（Primer Premier 5.0软件）。DXS-a：5-GTGAGTGATACTCTGCTCTTTCCGACAAGG-3；DXS-b：5-CCCTGCTGCCCTCTTTCTTACCTGCTTA-3；DXS-c：5-AAACCCACTGTCTTGCTCAA ATTCCCAG-3。以茉莉花基因组DNA为模板，参照试剂盒说明书，以巢式引物和试剂盒配套引物进行3轮PCR扩增。 1.4 PCR产物纯化回收及克隆 将1.2和1.3所得PCR产物纯化回收并克隆至pMD18-T载体（TaKaRa），16 连接过夜后进行转化测序（北京六合华大基因有限公司）。 1.5 序列分析 JsDXS基因序列通过在线
19、NCBI的Blast功能进行氨基酸序列同源性比较；通过Protparam软件对基因的分子量、等电点进行预测，初步分析目的基因的功能；通过SignalP 4.1进行信号肽预测；通过ProtComp Version 9.0进行亚细胞定位预测；通过TMpred进行蛋白质跨膜结构的预测；通过在线SOPMA预测蛋白质二级结构。 启动子序列通过在线PlantCARE（http：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）及Place软件（http：/www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）预测其顺式
20、作用元件（刘志钦 等，2013）。 1.6 荧光定量PCR表达分析 分别提取18：00、20：00、22：00、0：00、2：00时的茉莉花瓣总RNA，用逆转录试剂盒（TaKaRa）反转录成cDNA，稀释10倍作模板。以茉莉花Actin基因为内参（Actin：5-CACTGCTGAGCGGG AAATTGT-3，Actin：5-GATCCTCCAATCCAGACACTGT-3）（欧雪凤，2012）。运用Primer Premier 5.0软件，按照荧光定量PCR引物设计原则，设计荧光定量PCR引物（rtDXS-R：5-GTTGCTGTAA 6期 孙 君等：茉莉花香气相关基因JsDXS及其启动子
21、的克隆与表达分析 1239 TAGGCGATGGTG-3，rtDXS-F：5-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3）。参照SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa）说明书，进行荧光定量PCR扩增体系：cDNA模板1 L，2SYBR Premix Ex-TaqTM 5 L，上下游引物（10 mol L-1）各0.2 L，用RNase-free H2O补足至10 L。95 预变性30 s，95 变性5 s，60 复性34 s，共40个循环。每份样品设3次重复。 试验数据应用Microsoft Excel 2003软件，采用2-Ct法计算其相对表达量
22、；应用SPSS软件对结果进行差异显著性分析。应用Microsoft Excel 2003软件作柱状图。 2 结果与分析 2.1 JsDXS克隆及序列分析 茉莉花瓣总RNA，28S与18S亮度比约为21，总RNA较完整，可进行RT-PCR扩增等后续试验。通过RT-PCR和RACE技术得到保守区PCR产物、5RACE和3RACE的PCR产物，最终克隆得到保守区1 181 bp、5RACE片段1 411 bp和3RACE片段883 bp。利用特异性引物扩增其ORF，测序后其精确长度为2 145 bp（图1）。 图1 茉莉花总RNA及从茉莉花中分离的JsDXS电泳图 M：Marker DL2000；1
23、：总RNA电泳图；2：保守区扩增产物；3：5RACE扩增产物；4：3RACE扩增产物； 5：JsDXS ORF全长扩增产物；6：JsDXS启动子扩增产物。 Fig. 1 Result of RNA and amplification product of JsDXS from Jasminum Sambac M：Marker DL2000；1：Result of RNA；2：Amplification product of conserved region；3：Amplification product of 5RACE； 4：Amplification product of 3RACE；5：
24、Full-length amplification product of JsDXS ORF； 6：The promoter product of JsDXS . 将保守区、5RACE和3RACE序列拼接，得到茉莉花DXS基因cDNA全长2 505 bp（图2），包含1个完整的阅读框（232 2 380 bp），编码714个氨基酸，该基因含有起始密码子ATG、终止密码子TAA、16个A的Poly A尾巴和AATAAA加尾信号，并含有保守功能结构域TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like及Transketolase-C。其相对分子量：76 768.0，分子式：C3396H5412N
25、950O1010S33，等电点：7.08，不稳定系数：39.28，属于稳定蛋白；带负电氨基酸总和（Asp + Glu）：73，带正电氨基酸总和（Arg + Lys）：72；脂溶指数：90.90。其蛋白质二级结构中38.74%为螺旋，14.97%为延伸链，7.13%为转角，39.16%为无规则卷曲。无信号肽，亚细胞定位在细胞质，其蛋白质无跨膜结构。 与其他植物氨基酸序列同源性为：丹参（Salvia miltiorrhiza）88%，橡胶树（Hevea brasiliensis）87%、穿心莲（Andrographis paniculata）87%、杜仲（Eucommia ulmoides）87%
26、、可可（Theobroma cacao）86%、阳春砂（Amomum villosum）86%、檄树（Morinda citrifolia）72%、甜叶菊（Stevia rebaudiana）72%、欧洲云杉（Picea abies）71%。 1240 园 艺 学 报 41卷 图2 JsDXS基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列 ATG：起始密码子；TAA：终止密码子；AATAAA：聚腺苷酸化加尾信号；TPP-DXS、TPP-PYR-DXS-TK-like、Transketolase-C：保守域。 Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid
27、 sequence of the JsDXS ATG：Start anticodon；TAA：Terminate anticodon；AATAAA：The polyadenylation signal； TPP-DXS，TPP-PYR-DXS-TK-like，Transketolase-C：Conserved domain. 2.2 启动子分离及顺式作用元件分析 将启动子PCR扩增产物（图1）克隆测序，得到上游启动子调控序列745 bp（图3），含有与茉莉酮酸酯相关元件T/GBOXATPIN2，脱落酸相关元件ABRE，生物钟相关元件CIACADIANLELHC，低温相关元件MYCCONSENS
28、USAT，热激相关元件HSE，光响应相关元件GATABOX、SORLIP1AT、TCT-motif，水杨酸相关元件TCA-element，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶相关元件CACTFTPPCA1，花粉特异性相关元件POLLEN1LELAT52，胚乳表达相关元件Skn-1 motif等。 6期 孙 君等：茉莉花香气相关基因JsDXS及其启动子的克隆与表达分析 1241 图4 茉莉花开放过程中JsDXS基因表达分析 不同字母代表不同时刻间存在显著差异（P 0.05）。 Fig. 4 Express analysis of JsDXS during blooming The results with sa
29、me letters are not significantly different at P 0.05 according to Duncans multiple-range test. 图3 茉莉花DXS基因启动子序列及部分顺式作用元件 ABRE：脱落酸相关元件；CACTFTPPCA1：参与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反应；CIACADIANLELHC：生物钟相关元件；GATABOX、SORLIP1AT、TCT-motif：光响应相关元件；HSE：热激相关元件；IBOXCORE、REBETALGLHCB2I：光敏色素调节元件；MYCCONSENSUSAT：低温相关元件；POLLEN1LELAT52
30、：花粉特异性相关元件；Skn-1 motif：胚乳表达相关元件；TCA-element：水杨酸相关元件； T/GBOXATPIN2：参与茉莉酮酸酯反应相关元件。 Fig. 3 The promoter sequence of JsDXS and partial cis-acting elements ABRE：Involved in the abscisic acid responsiveness；CACTFTPPCA1：Involved in phosphoenolpyruvate carboxylase responsiveness；CIACADIANLELHC：Necessary for
31、 circadian expression；GATABOX，SORLIP1AT，TCT-motif：Related to light； HSE：Involved in heat stress responsiveness；IBOXCORE，REBETALGLHCB2I：Involved in phytochrome regulation； MYCCONSENSUSAT：Related to cold；POLLEN1LELAT52：Responsible for pollen specific activation； Skn-1 motif：Required for endosperm expr
32、ession；TCA-element：Involved in salicylic acid responsiveness； T/GBOXATPIN2：Play a key role in jasmonate signaling. 2.3 相对荧光定量PCR表达分析 以茉莉花Actin为内参，采用实时荧光定量PCR对茉莉花开放过程中JsDXS的表达进行了分析，结果（图4）表明，其表达量在18：00时较低，随着时间的推移，呈现上调趋势，在22：00时达到最高，随后呈现下调趋势，在2：00时最低。 3 讨论 DXS是DXP途径的第一个酶，也是第一个关键酶。研究表明，超量表达DXS可提高单萜化合物、类
33、胡萝卜素、萜类化合物和萜类吲1242 园 艺 学 报 41卷 哚生物碱的含量（Bouvier et al.，1998；Chahed et al.，2000；Lois et al.，2000）。本试验中克隆得到茉莉花JsDXS全长cDNA 2 505 bp，与同属植物丹参相似度最高为88%，与其他植物如橡胶树（87%）、穿心莲（87%）、杜仲（87%）、可可（86%）、阳春砂（86%）也有很高的同源性，与檄树（72%），甜叶菊（72%），欧洲云杉（71%）同源性的也较高。JsDXS含有功能保守域TPP-DXS、TPP-PYR-DXS- TK-like、Transketolase-C，其中Tran
34、sketolase-C认为是分子调控结合位点（Lindqvist et al.，1992；Nikkola et al.，1994），说明DXS在长期进化中较保守。前人对DXS表达模式的研究多以不同组织器官（空间）为对象，其表达的节律性（时间）还鲜有报道。本研究中得出茉莉花瓣JsDXS的表达量在18：00时较低，随着时间的推移，呈现上调趋势，在22：00时达到最高，随后出现下调趋势，在2：00时最低。在整个花开放的过程中，JsDXS表达与茉莉花香强度呈现一定的关联，与李鹤（2012）报道的双瓣茉莉花萜烯类香气物质在17：0003：00这个时间段内所表现的趋势相一致，与茉莉花香相关CDS和HPL基
35、因的表达模式（欧雪凤，2012）也一致。 本研究中利用染色体步移方法分离得到JsDXS上游调控序列，其包含多个与茉莉生长发育及开花密切相关的顺式作用元件。其中，T/GBOXATPIN2（Boter et al.，2004）与茉莉酮酸酯相关，而茉莉酮酸酯类，包括茉莉酮酸（Jasmonic Acid，JA）和它的甲基酯（Methyl Jasmonate，MeJA）是许多花和果实中芳香物质的成分之一（薛炳烨和姚胜蕊，1999）。王鑫威等（2011）、魏洁书等（2013）对雨生红球藻及阳春砂DXS的研究表明MeJA对DXS表达有促进作用，茉莉酮酸酯与DXS及茉莉花开花的相关性还需进一步深入研究探讨。茉
36、莉花属于夜晚开花植物，DXS上游调控序列中发现的与生物钟相关元件CIACADIANLELHC（Piechulla et al.，1998）及低温相关元件MYCCONSENSUSAT（Chinnusamy et al.，2003；Lee et al.，2005）可能诱导茉莉花在低温的夜晚开花。此外，该启动子还含有与光响应相关元件GATABOX、SORLIP1AT（Hudson & Quail，2003；Jiao et al.，2005），光敏色素调节元件IBOXCORE（Terzaghi & Cashmore，1995）、REBETALGLHCB2I（Degenhardt & Tobin，199
37、6）等，其具体与茉莉花开花及香气物质合成相关的元件还需进一步通过点突变来验证。JsDXS是否调控茉莉花开花及花香物质合成还需对该基因进行转基因功能鉴定，构建启动子缺失载体和启动子表达载体来研究启动子核心元件和组织表达部位。 References Boter M，Ruz-Rivero O，Abdeen A，Prat S. 2004. Conserved MYC transcription factors play a key role in jasmonate signaling both in tomato and Arabidopsis. Genes Dev，18 (13)：15771591
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43、i Liang，Yang Lan-ping，Ren Qing. 1994. Study on the stability of the quality of flower resource during the blossom period for the Jasminum Sambac（L.）aiton in Fuzhou region . Analysis of the chemical components of absolute oil and headspace volatiles. Chinese Journal of Chromatography，12 (1)：1119. (in
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