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1、利用MTT法测定不同浓度卡铂对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要：本实验主要探讨不同浓度的卡铂对Hela细胞增殖的抑制效果，利用MTT法来检测细胞相对数和相对活力，实验结果表明，不同浓度卡铂对Hela细胞的抑制率不同，各个浓度均对细胞有不同的抑制效果，抑制率最大的为卡铂浓度4.8ug/ml的培养液，其平均抑制率为49.61%，接近半数抑制浓度。关键词：MTT 不同浓度卡铂 Hela细胞 增殖抑制The Using of MTT method to determine different concentrations of carboplatins inhibitory effect to the
2、 Hela cell Proliferation Abstract: In this experiment focused on the different concentrations of carboplatin on Hela cell proliferation inhibitory effect, using MTT method to detect cells relative number and relative vitality, experimental results show that different concentrations of carboplatin on
3、 Hela cells inhibition rate is different in various concentrations on cells have different inhibitory effect, inhibiting rate for the largest concentration of carboplatin is 4.8ug/ml, the average inhibition rate was 49.61 percent, close to median inhibitory concentration.Key words: MTT different con
4、centrations of carboplatin Hela cell proliferation inhibition Hela细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒转型成癌细胞的，而且和正常子宫颈细胞有许多不同。宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二位最常见的恶性肿瘤。但早期宫颈癌的发生，特别是年轻化趋势十分明显。宫颈癌的化疗是以铂类药物为基础的化疗1。卡铂为第二代铂类化合物，其生化物征与顺铂相似，是近年来广泛受到重视的治疗癌症的新药。本文通过测定不同浓度卡铂对Hela细胞增殖的抑制率，从而得出卡铂对于宫颈癌细胞的抑制具有良好的效果。为临床上卡铂的应用提供参考。1 材料与方
5、法1.1材料 1.1.1细胞来源美国购入的海拉宫颈瘤细胞系（HELA 细胞），实验室传代保种。1.2方法（1）接种：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为23104/ml，每孔加入细胞悬液200l，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。（2）培养与药物处理：培养箱内培养24h，吸出培养液加入不同浓度梯度的各种抗肿瘤药物各200 l，每个浓度至少接种4孔作为重复实验，否则难以反应真实情况。（3）呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 l，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 1
6、50l，振荡30min，使结晶物充分融解。（4）比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。（5）计算与分析：按照公式计算各种药物处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率（未加药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。若该值为负说明药物对细胞增殖具有抑制作用，若值为零表明药物对细胞增殖无影响；若值为正说明药物对细胞增殖具有促进作用。(6) 对照设置：设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），且必须设置对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）。2 结果2.1 MTT法测定化疗药物的平均抑制率 表一 不同浓度的卡铂对Hela细胞的抑制效果卡
7、铂浓度对照0.6ug/ml1.2ug/ml2.4ug/ml4.8ug/ml490nm波长下的吸光值0.774 0.570 0.473 0.415 0.390 相对吸光值-0.204-0.301 -0.359 -0.384存活细胞个数（个）1073938863833细胞增殖抑制率-26.36%-38.89%-46.38%-49.61%注：细胞增殖抑制率（药物处理组的吸光值未加药物处理的对照组吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值 图一 不同浓度的卡铂对Hela细胞的抑制率 表二 不同细胞个数浓度在490nm下的吸光值细胞数孔数空白对照10000个5000个2500个1250个E0.0691.381
8、1.2930.8790.391F0.0621.5580.7910.7000.308G0.0781.0541.0700.4910.208H0.0741.5440.7990.3130.220平均吸光0.0711.3840.9880.5960.282相对吸光值1.3130.7250.2390.146注：相对吸光值=该组的平均吸光值-空白对照组的平均吸光值 图二 不同细胞个数在490nm下的相对吸光值表二中列出了无添加药物情况下，不同的细胞浓度个数在490 nm下的吸光值，根据该数值作出细胞个数与其相对吸光值的趋势线，如图二所示。计算出该趋势公式y = 1429.9e1.4035x R2 = 0.90
9、26 . 根据该公式可以计算出，添加了不同浓度卡铂的细胞培养中其细胞的存活个数。详见表一。 从上面表一中可以看出，浓度分别为0.6ug/ml、1.2ug/ml、2.4ug/ml、4.8ug/ml的卡铂对Hela细胞的抑制率不同，体外MTT的试验表明，本组实验设置的各个浓度与空白对照下，均对细胞有不同的抑制效果，且在本组设置的浓度范围内，细胞的抑制率与卡铂的浓度成正相关（见图一）。其中，抑制率最大的为卡铂浓度4.8ug/ml的培养液，其平均抑制率为49.61%，接近半数致死剂量。其次为浓度2.4ug/ml的卡铂，其对癌细胞的抑制率也较高，为46.38%。而卡铂浓度最低为0.6ug/ml的细胞培养
10、液中，其细胞的抑制率也有26.36%。说明该药物对于Hela细胞具有较好的抑制效果。讨论： 本实验由于设置的梯度浓度过少，因此无法精确地得出抑制细胞增殖的最佳卡铂浓度，另外，由于抗癌药物对于正常细胞具有一定的毒副作用，它们在杀伤肿瘤细胞的同时也大量杀伤机体内增殖旺盛的细胞，如造血细胞 、肠上皮细胞等，引起造血障碍，机体抵抗力下降，而该实验中没有很好地把这一因素考虑进去，导致该实验结果在临床应用上的限制。因此，为了增加实验的科学性级实用性，建议实验应该从体内外两方面研究药物对肿瘤和造血细胞的作用，这才是是评价药物优劣的重要依据。选择有效的化疗药物是恶性肿瘤化疗成功的关键，目前临床化疗多停留在经验
11、治疗阶段。通过药敏试验选择有效的化疗药物，可使化疗更具有目的性，对指导临床用药，提高疗效，减轻毒副作用等具有重要意义。四氮唑蓝比色分析法(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)是目前最常用的体外肿瘤药敏试验方法，已广泛应用于细胞系的体外药物敏感试验。MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的
12、琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色（或蓝色）结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中；在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，因此用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好
13、在0-0.7 范围内。同时，利用已知浓度细胞培养后的吸光度可以生成细胞生长趋势曲线，通过该曲线可推测出某一未知浓度细胞的原始接种浓度。MTT法缺点之一是不能区分癌细胞与非癌细胞，因此应尽可能除去原代肿瘤细胞悬液中其它非癌细胞的干扰，其中主要为成纤维细胞和巨噬细胞。实验过程中尽量剔除癌组织中的结缔组织成分，基本可保证肿瘤细胞的纯度。自1967年美国密执安州立大学教授Rosenberg B.和Camp V.发现顺铂具有抗癌活性以来,铂类金属抗癌药物的合成应用和研究得到了迅速的发展3。顺铂和卡铂已成为癌症化疗不可缺少的药物。铂类抗癌药物对于治疗肿瘤的广谱性和有效性引起了各国学者的浓厚兴趣,成为研究开
14、发铂抗癌药物的热点之一。卡铂为第二代铂类化合物，其生化物征与顺铂相似，但肾毒性、耳毒性、神经毒性尤其是胃肠道反应明显低于DDP，是近年来广泛受到重视的新药，与DDP一样同属细胞周期非特异性药物。它主要作用DNA的鸟嘌呤的N7和O6原子上，引起DNA链间及链内交联，破坏DNA分子，阻止其螺旋解链，干扰DNA合成，而产生细胞毒作用。卡铂的特点是:化学稳定性好,溶解度比顺铂高16倍;除造血系统外,其他毒副作用低于顺铂;作用机制与顺铂相同,可以替代顺铂用于某些癌瘤的治疗,但与顺铂交叉耐药(交叉度90%);与非铂类抗癌药物无交叉耐药性。故它同样可以与多种抗癌药物联合使用。铂类抗癌药物研究的前景是比较好的，铂类抗癌药物会越来越广泛的应用到癌症的治疗当中。参考文献1钱晓蕾,彭芝兰,胡敏,牛晓宇,陈悦悦, 顺铂与卡铂对宫颈癌化疗作用的对照研究J.现代预防医学2006.33:（71131-1132）.2 吕庆杰，马颖，宋继谒，董芳，宓贞，MTT比色分析法检测卵巢癌药物敏感性J . 中国医科大学学报2004.33 (6) :540-543.3 杨一昆，普绍平，高文桂，顺铂的应用及铂族金属抗癌药物的研究进展J .中国新药杂志1999.8 (12) :797 - 800 .
