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1、资料四乳铁蛋白食品添加剂的质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或相关情况说明内蒙古伊利实业集团股份有限公司一、乳铁蛋白质量规格要求（一）感官指标项目标准检测方法色泽淡粉红色粉末。取5克被测样品置于一洁净的白色搪瓷皿中，在自然光线下用肉眼观察其色泽和外观形态及其滋气味。滋气味具本产品特有的味道，无异味组织状态均匀、细密粉末，无吸潮、无结块。正常视力下无可见杂质。（二）理化指标项目标准检测方法总蛋白质95.0GB 5009.5-2010乳铁蛋白占总蛋白的比例90%见本节“二、检验方法”水分8.00GB 5009.3-2010灰分5.00GB 5009.4-2010铁饱和度
2、5-20%见本节“二、检验方法”pH4.5-6.8检测2%水溶液在20下的pH颗粒度要求40目筛分通过率85%标准筛检测50目筛分通过率50%溶解度完全溶解，无肉眼溶物取0.2克乳粉，置于50、200 mL水中，充分搅拌2分钟以上，静止后观察。（三）微生物、污染物及真菌毒素指标项目标准检测方法菌落总数（cfu/g）1000GB 4789.2-2010 大肠菌群（cfu/g）10GB 4789.3-2010平板计数法金黄色葡萄球菌（cfu/g）10GB 4789.10-2010平板计数法酵母和霉菌（cfu/g）50GB 4789.15-2010阪崎肠杆菌（cfu/g）0/100gGB 4789.
3、40-2010沙门氏菌（cfu/g）0/25gGB 4789.4-2010铅（mg/kg）0.15GB 5009.12-2010砷（mg/kg）0.2GB/T 5009.11-2003黄曲霉毒素M1（g/kg）0.5GB 5009.24-2010二、检验方法（一）用反相高效液相层析法测定乳铁蛋白的纯度1. 样品准备对粉状乳铁蛋白，称出20 mg乳铁蛋白样品，用MilliQ水配成20 mL，1 mg/mL的乳铁蛋白溶液，再通过0.2 m的乙酸纤维素膜进行过滤。2. 材料和试剂（1）MilliQ水（超纯水18 megohm resistivity）（2）95%的乙腈(氰化甲烷)（HPLC 级）（3
4、）1%的三氟乙酸（TFA）2.1 缓冲液准备（1）缓冲液A：100% MilliQ水把1 L MilliQ水装在1 L 的SCHOTT瓶中。（2）缓冲液B：95%的乙腈分别量取50 mL MilliQ水和950ml乙腈。把二者混合，通过0.45 m的滤膜进行过滤。储存在1 L的SCHOTT瓶中。（3）缓冲液C：1%的三氟乙酸用移液管量取25 mL三氟乙酸放入200 mL MilliQ水中，用MilliQ水补至250 mL。转移到250 mL的SCHOTT瓶中储存。3. 仪器设备（1）水基线体系控制和获得数据的设备（Empower）（2）水2695分离组件和2487双吸收检测器（3）反相高效液相
5、层析柱-Alltech prosphere C4 300A 150mm 4.6mm, with Alltech All-guard Guard 7.5 4.6mm.4. 高效液相层析的测量方法4.1 注射体积50 L已过滤的乳铁蛋白样品或空白液注入柱中供分析。4.2 梯度表时间（min）流速（mL/min）成分曲线% A% B% C0.001.073.316.71010.001.0355510611.001.0187210613.001.0187210615.001.073.316.71064.3 温度柱子温度=35C样品温度=10C4.4 检测在波长280 nm处检测乳铁蛋白，乳铁蛋白的洗脱
6、时间大约9.7分钟。5. 过程与计算5.1 用Empower软件，用样品的层析谱减去空白溶液。5.2 结合整个样品的层析谱，算出全部蛋白的含量。然后结合乳铁蛋白的高峰区算出乳铁蛋白的百含量（以蛋白质为基数）。5.3 用下面的计算公式计算乳铁蛋白的百分含量（干重）：乳铁蛋白的百分含量(干重)=蛋白含量/(100 - 水分)乳铁蛋白的百分含量其中：蛋白含量是用凯氏定氮法测定的蛋白含量乳铁蛋白的百分含量是用高效液相层析法测定的乳铁蛋白含量（二）乳铁蛋白铁饱和度的测定1. 原理通过向乳铁蛋白水溶液中逐渐加入等分量的三价铁离子溶液直至乳铁蛋白铁饱和。该过程中乳铁蛋白铁饱和度的变化在465 nm分光光度计
7、下进行检测，当吸光值不再变化的时候说明乳铁蛋白已经完全饱和。2. 试剂2.1 FeCl3.6H2O2.2 NTA (氨三乙酸)2.3 NaH2PO4.H2O2.4 Na2HPO4.12H2O2.5 NaHCO32.6 NaOH 2.7 NaCl3. 溶液的配置3.1 配置含有10 mM氯化铁和 0.1 M HCl的溶液：（1）在100 mL容量瓶中分别加入：- 0.83 mL 37%的HCl- 0.270 g的FeCl3.6H2O (准确称量)（2）加蒸馏水至100 mL刻度处3.2 配置40 mM Na-NTA溶液：在100 mL容量瓶中分别加入:- 0.764 g的NTA- 加入大约20
8、mL去离子水- 缓慢加入1 M的NaOH溶液来溶解NTA粉末(以形成可溶的NTA钠盐)- 将1M的NaOH逐滴加入，每加入一滴并充分混合直至NTA完全溶解3.3 配置含有5mM FeCl3.6H2O和20 mM NaNTA的溶液 - 将等量（各20 mL）的3.1和3.2溶液混合- 用10 M的NaOH溶液将溶液的pH值调至4-6之间（例如：4.5），但要注意尽可能少的将溶液稀释）3.4 0.1M NaHCO3的配置将8.401 g的NaHCO3加入1升蒸馏水中。3.5 2%乳铁蛋白水溶液的配置- 将0.8 g乳铁蛋白粉末溶解于40 mL蒸馏水中- 搅动直至完全溶解4. 铁饱和度的测量可以用所
9、配置溶液来测定pH值和在600 nm时的透光率，溶液必须经过0.45 m millipore过滤器过滤- 将1mL乳铁蛋白溶液注入比色皿- 加入1.5 mL 0.15M NaCl和200 L的0.1 M的NaHCO3溶液- 在465 nm下测量溶液的吸光值- 加入10 L等量的溶液3.3。每加一次，充分混合并在465 nm下测量吸光值，直到吸光值变为恒定，也就是说乳铁蛋白趋于饱和。5. 结果的表达以纵坐标为吸光值，横坐标为等量三价铁离子浓度作图。直线(1)为当乳铁蛋白趋于饱和时的吸光值。直线(2)为以初始乳铁蛋白吸光值为原点到铁饱和时吸光值的连线。将直线(2)反向延长使其与横坐标交汇。乳铁蛋白
10、初始铁饱和度可以通过以下两种方法计算得出：（1）通过465 nm下最初的吸光值(b1)与饱和时溶液的吸光值(b2)的比值计算得出：（2）通过初始乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数(a1)和饱和乳铁蛋白中三价铁离子的微摩尔数(a)的比值得出：备注：一等份也就是每10 L的三价铁离子溶液=0.05 mol Fe3+6. 乳铁蛋白浓度测定考虑到1 mol的乳铁蛋白可以结合2摩尔的三价铁离子，因此溶液中乳铁蛋白的摩尔数应该是铁离子摩尔数的二分之一。mol乳铁蛋白= 0.5mol Fe3+乳铁蛋白分子量= 77,000因此，77,000mol乳铁蛋白10-6= 检测溶液中乳铁蛋白的质量（g）。（三）乳制品中
11、乳铁蛋白含量的检测第一部分 高效毛细管电泳测定乳制品中乳铁蛋白含量A.1 适用范围本方法适用于乳粉和乳铁蛋白原料中乳铁蛋白的定性和定量分析。A.2 原理试样经处理后进入毛细管中，在毛细管中充入缓冲溶液，两端加高电压，毛细管中形成电场。样品中带电粒子在电场中以不同速度运动，流经检测器被检测，得到分离谱图，根据峰面积和浓度成正比的关系，计算不同成分的含量。A.3 试剂A.3.1 实验配制所用水均为超纯水。A.3.2 乳铁蛋白标准品（Fluka）。A.3.3 氢氧化钠：1 moL/L溶液。A.3.4 硼酸（sigma）。A.3.5 CsOH（50 %水溶液，北京百灵威化学技术有限公司）。A.3.6
12、冰乙酸（优级纯）。A.3.7 十二烷基硫酸钠(SDS，Sigma-Aldrieh，货号:L3771)。A.3.8 羟乙基纤维素(HEC，Sigma-Aldrieh，货号:54290)。A.3.9 HEC储备液的配制： HEC是一种淡黄色粉末状固体，首先准确量取100 mL超纯水置于试剂瓶中，将其放置在60 水浴中加热，将准确称量的4 g HEC逐步加入，涡旋混匀，待其完全溶解即配制成40 g/L的HEC储备液，放入4 冰箱备用。A.3.10 运行缓冲液：0.3 moL/L硼酸，其中含20 mmoL/L SDS和8 g/L HEC。首先分别准确称取1.855 g硼酸和0.577 g SDS放入1
13、00 mL容量瓶中，加入70 mL的超纯水，超声使其溶解，然后再加入20 mL质量浓度为40 g/LHEC储备液，涡旋混匀后用1 moL/L的CSOH调节pH值到8.80，最后用超纯水定容到刻度线，室温放置备用。A.3.11 样品缓冲液：0. 05 moL /L HAC。准确移取 1.437 mL冰醋酸置于500 mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，放入4 冰箱备用。A.4 仪器A.4.1 毛细管电泳仪（带有紫外检测器）。A.4.2 电子天平。A.4.3 pH计。A.4.4 超声振荡器。A.4.5 高速离心机A.5 操作步骤A.5.1 样品的前处理分别称取一定质量的的样品于10 mL容量瓶中，加
14、入适量样品缓冲液，涡旋混匀后，再用样品介质稀释定容到刻度，于9000 r/min离心10 min，取上清液分析。A.5.2 测定A.5.2.1 标准曲线的绘制准确称取10 mg乳铁蛋白标准品于l mL样品管中，加入1.5 mL样品介质涡旋混匀后，制得10000 mg/L的乳铁蛋白标准储备液，放入4 冰箱备用。工作液由储备液经0. 05 mol/L HAc 稀释后制得。准确移取10、20、40、80、160 mg/L质量浓度为 5000 mg/L的Lf标准储备液于l mL样品管中，再分别加入990、980、960、920、840 mg/L样品缓冲液，混匀后即得50、100、200、400、800
15、mg/L的工作液。峰面积(A)与质量浓度(C，mg/L)在50800 mg/L范围内具有良好线性关系，检出限(LOD)为15 mg/L。A.5.2.2 试样测定测定条件 毛细管(50 um57 cm，有效长度:50 cm，河北永年锐沣色谱配件有限公司)；分离电压:20kV；检测波长:214 nm；操作温度:25 ；进样压力：0.5 psi；进样时间:20 s。每次实验完毕后，用运行缓冲溶液洗3 min，用1 moL/L氢氧化钠洗10-30 min，水洗3 min，抬高盖板使冷凝液回流后，关机。使用新换的毛细管柱需要用水洗10 min，用1 moL/L氢氧化钠清洗30 min，水洗10 min，
16、进行柱子的活化。然后可以进行样品的测定。(清洗压力均为20 psi)A.6 分析结果的计算计算公式: X = C * N/m 式中：X样品中乳铁蛋白的含量mg/kg；C从标曲中查得相应乳铁蛋白的含量mg/L；M称取试样的质量g；N稀释倍数定容体积。第二部分 酶联免疫法A.7 原理本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被牛乳铁蛋白（LF）单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用
17、下变成黄色，颜色的深浅与样品中牛乳铁蛋白（LF）浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中牛乳铁蛋白（LF）含量。A.8 试剂盒组成及试剂配制A.8.1 酶联板：一块（96孔）A.8.2 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1 mL，盖好后静置10 min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成100 ng/mL,50 ng/mL,25 ng/mL,12.5 ng/mL,6.25 ng/mL,3.12 ng/mL,1.56 ng/mL其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 n
18、g/mL，临用前15 min内配制。如配制15 ng/mL标准品：取0.5 mL 100 ng/mL的上述标准品加入含有0.5 mL样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推.A.8.3 样品稀释液:120 mL/瓶。A.8.4 检测稀释液A：110 mL/瓶。A.8.5 检测稀释液B：110 mL/瓶。A.8.6 检测溶液A：1120 L/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100 L），实际配制时应多配制0.10.2 mL。如1 L检测溶液A 加99 L检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配
19、制。A.8.7 检测溶液B：1120 L/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释方法同检测溶液A。A.8.8 底物溶液: 110 mL/瓶.A.8.9 浓洗涤液:130 mL/瓶。使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。A.8.10 终止液：110 mL/瓶（1 moL/L H2SO4）。A.9 仪器和设备A.9.1 37 恒温箱。A.9.2 酶标仪。A.9.3 精密移液器及一次性吸头。A.9.4 蒸馏水。A.9.5 一次性试管。A.9.6 吸水纸。A.9.7 pH计。A.9.8 离心机。A.9.9 冰箱。A.10 分析步骤A.10.1 试样处理称取10 g乳粉与三角瓶中，先用40 左
20、右温水30 mL溶剂样品后调pH4.6后转入50 mL容量瓶中定容。将容量瓶放入4 冰箱中1 h，取出于4000 r/min 离心10 min，取上清液备用。A.10.2 试剂盒操作步骤A.10.2.1 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30 min。A.10.2.2 配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。A.10.2.3 加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50 L；待测样本孔中先加入待测样本10 L，再加样本稀释液40 L（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。A.10.2.4
21、温育：37 水浴锅或恒温箱温育30 min。A.10.2.5 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。A.10.2.6 加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50 L，空白对照孔不加。A.10.2.7 温育：37 水浴锅或恒温箱温育30 min。A.10.2.8 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。A.10.2.9 显色：每孔先加入显色剂A 液50 L，再加入显色剂B液 50 L，平板混匀器混匀30 s
22、（或用手轻轻震荡混匀30 s），37 避光显色15 min。A.10.2.10 测定：以空白孔调零，在终止后15 min内，用450 nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。A.11 计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。A.12 试剂盒注意事项A.12.1 实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。A.12.2 酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。A.12.3 建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测
23、，取平均值，以减小实验误差。A.12.4 牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。A.12.5 本试剂盒定量范围为5-160 g/L，超过此范围，为标准曲线延伸计算所得，不做为准确定量结果，请用特殊稀释液稀释后测定准确结果（5-160 g/L范围内），乘以总稀释倍数即为样本最终浓度。A.12.6 若显色过浅，可适当延长底物温育时间。A.12.7 为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。A.12.8 试剂盒保质期内使用，不同批号的试剂不得混用。A.12.9 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。三、乳铁蛋白生产工艺全脂牛奶离心分离，巴氏杀菌脱脂牛奶10离子交换吸收10洗提浓缩乳铁蛋白过滤冷冻干燥磨粉包装 四、调制乳粉产品工艺流程图均 质预 热净乳分离销 售 巴氏杀菌冷 却贮 存贮 存冷 却湿 混过 滤巴氏杀菌原奶接收冷 却原奶检验预 热原奶称重上闪蒸杀 菌效体蒸发下闪蒸浓奶缸预 热过 滤喷 粉流化床乳铁蛋白粉添加集粉箱干 混包 装运 输销 售
