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1、MTT法测定卡铂对Hela细胞增殖的抑制效果摘要：本实验采用不同浓度的卡铂，作用于体外培养的Hela细胞，用MTT法检测其对Hela细胞的抑制率。实验结果表明卡铂对Hela细胞的增殖抑制作用呈现出剂量-效应关系。关键词：卡铂，Hela细胞，MTT法卡铂(Carboplatin，CBP)，又名碳铂。化学名为顺式-1、1-环丁烷二羧酸二氨铂，分子式：C6H12N2O4Pt。卡铂是继顺铂后上市的另一个铂类抗肿瘤药，属于第二代铂复合物抗肿瘤药物1。其药理作用机理与顺铂相似，属于金属配位剂；它与DNA配位结合生成交叉链，改变了DNA的化学结构，从而影响细胞的复制；它也与烷化剂的作用相似，抑制肿瘤生长，属
2、时相周期非特异性的抗癌药2。卡铂作为一种抗肿瘤药物，对宫颈癌的治疗效果已得到肯定，通常与其它抗癌药物联合使用3。由于患者对不同剂量化疗药物的敏感性差异较大，且化疗药物均具有毒副作用4。因此，筛选出药物治疗肿瘤的敏感剂量，对指导临床用药，提高疗效，减轻毒副作用等具有重要意义。在多种体外抗癌药物筛选方法中，MTT法是备受推崇的检测方法，具有简单，快捷，经济等优点。本实验通过不同浓度的卡铂作用于体外培养的宫颈癌Hela细胞，用MTT法检测其对Hela细胞的抑制率，并对实验结果进行分析，为敏感剂量的进一步筛选提供参考。1.材料与方法1.1细胞与试剂Hela细胞：即人宫颈癌上皮细胞，因为具有增殖迅速等特
3、点，被广泛用于生物学与医学研究。卡铂：铂类抗肿瘤药，100 mg/支。分别设置5组不同的浓度梯度(表1)。表1不同梯度卡铂的浓度设置组别 浓度梯度(ug/ml)125501002002501503006003102040804612244852040801601.2方法1.2.1接种：消化Hela细胞成悬液，并调整浓度，使其处于23104/ml之间。用移液枪向96孔板中加细胞悬液，每孔200l。1.2.2培养与药物处理：培养箱内培养2436h后，吸出培养液，加入不同浓度梯度的卡铂溶液各200l，每个浓度接种4孔作为重复实验。同时设置空白对照孔和不加药物对照孔。置于培养箱内继续培养3天。1.2.
4、3呈色：加5 mg/ml的MTT溶液，每孔20 l，继续培养。4 h后弃去孔内培养上清液，然后加入DMSO，每孔150l，振荡30min。1.2.4比色：在波长为490nm下，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。1.2.5计算与分析：按如下公式计算各浓度梯度对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率(未加药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值)/未加药物处理的对照组吸光值。若该值为正，说明药物对细胞增殖具有抑制作用；为零表明药物对细胞增殖无影响；为负说明药物对细胞增殖具有促进作用。2.结果与分析2.1五组不同浓度梯度的卡铂作用于Hela细胞48h后，均出现了不同程度对Hela细胞增殖活性的抑制。随着
5、药物浓度的增加，细胞的抑制率也有增加的趋势(表2)。当卡铂浓度为最高的600 ug/ml时(第二组)，细胞的抑制率也达到最高，为93.84%，此时基本上所有的Hela均已被抑制，丧失生理活性。2.2卡铂能明显抑制Hela细胞的增殖，对Hela细胞的增殖抑制作用基本上能呈现出剂量-效应关系。表2 不同浓度梯度的卡铂对Hela细胞的抑制率组别 剂量(ug/ml) 抑制率(%)1255010020019.25%35.29%52.58%79.68%25015030060047.08%74.25%76.30%93.84%31020408043.97%31.47%44.82%40.16%461224482
6、6.36%38.89%46.38%49.61%52040801609.72%26.30%21.44%49.92%3.讨论3.1实验证明不同浓度的卡铂对Hela细胞增殖的抑制作用呈现出量效关系，可以推测，卡铂对生物体内的宫颈癌细胞的抑制作用也同样会呈现出这样的关系，但线性应该有所改变。同时，卡铂对Hela细胞的抑制率也与药物作用的时间有关，作用时间越长，抑制率越高5。3.2研究表明卡铂主要通过肾脏排泄，50%75%在4小时内排泄完毕，90%在24小时内排泄。与顺铂不同相比，肾小管不参与卡铂的排泄，所以卡铂对肾脏的毒性较小3。作为抗癌药物的筛选，应当选择抑制率最高而浓度最低的药物剂量，以减少对机体
7、的伤害。在本实验中，当药物浓度为100 ug/ml时，对细胞的抑制率仅略大于50%，有较优抑制率的浓度在150200之间。这是否可以说明使用卡铂可以使用较大的剂量，这需要作进一步信息的临床研究。3.3毒性检测有多种不同方法，可能会产生不同的检测结果。对正确判断药物作用效果，选择适合的检测方法就显得尤其重要。在较大的剂量范围及较宽的细胞密度内，SRB法比MIT法准确稳定5。本实验的结果误差均比较大，若需要更为准确的数据，建议使用SRB法重复本实验。参考文献：1. 宋红英，刘放. 卡铂的药理作用及分析方法J. 浙江省医学科学院学报.2005，30(3)：36-392. 陈启蒙. 抗癌药卡铂的临床应用进展J. 中国医师杂志.2000，2(9)：540-5413. 朱滔，楼洪坤. 卡铂在宫颈癌化疗中的应用J.肿瘤学杂志.2005，11(1)：66-684. 王玉萍，邵斌，楚天骄，等. MTT法检测Hela细胞对化疗药物敏感性的研究J. 中国妇幼保健.2006，21(24)：3428-34295. 郭莉霞，刘建辉，陈刚，等. 两种方法检测TETA与卡铂联用对肿瘤细胞作用的比较J.2007，21(3)：207-209
