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1、邯郸学院本科毕业论文题 目 三黄片HPLC指纹图谱的研究学 生 指导教师 年 级 2006 级专 业 化 学系 部 化学系 邯郸学院化学系2010年5月郑重声明本人的毕业论文是在指导教师刘妍老师的指导下独立撰写完成的。如有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权的行为，本人愿意承担由此产生的各种后果，直至法律责任，并愿意通过网络接受公众的监督。特此郑重声明。 毕业论文作者： 年 月 日摘 要 本论文初步建立了三黄片的HPLC指纹图谱，为三黄片生产过程质量控制的依据和方法提供了参考。采用甲醇-磷酸（100:1）为溶剂,35超声提取45min后微膜过滤，获得供试品溶液。选取如下色谱条件：色谱
2、柱为 VP ODS C18(4.6mm150mm，5m)，柱温为30，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，以甲醇和0.2%的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。结果显示10批三黄片有19个共有峰，根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得出其相似度98%。该方法简便可靠，可用于建立三黄片的指纹图谱，也可用于三黄片生产过程中的质量控制和对产品的质量评价。关键词 三黄片 高效液相色谱 指纹图谱Determination of the Fingerprint Chromatogram of SanHuang tablet by HPLCDu Yi Directed by Vice Prof.
3、Liu YanAbstract An effective and convenient method was established for HPLC fingerprints of SanHuang tablet which provided an approach for quality control in production. The chromatographic conditions are as follows: the column for the VP ODS C18 (4.6mm 150mm, 5m), the temperature for 30, a flow rat
4、e of 1.0ml/min, detection at 280nm, with acetonitrile and 0.2% phosphate acid aqueous solution for mobile phase gradient elution.The results showed that 19 peaks were indicated on the HPLC fingerprint of SanHuang tablet. According to the computer software-assisted analysis of similarity, the similar
5、ity of 10 batches of SanHuang tablet was not lower than 0.98. The method, which is simple and reliable, can be used to establish SanHuang tablet fingerprint and also be effectively used for quality evaluation and quality control in SanHuang tablets production. Key words SanHuang tablet HPLC Fingerpr
6、ints目 录摘要I外文页II1序言12 实验部分22.1 仪器和药品22.1.1实验仪器22.1.2实验试剂22.1.3实验用药品22.1.4标准品32.2三黄片HPLC指纹图谱色谱的建立32.2.1供试品的制备32.2.2色谱条件32.2.3方法学考察及相似度计算32.3批次药品的指纹图谱测定42.4特征峰的指认63讨论73.1色谱条件的选择73.1.1供试品制备条件的选择73.1.2流动相的选择73.1.3梯度的调整83.1.4波长的选择103.1.5柱温的选择113.2指纹图谱的相似度比较及差异分析114实验结果分析和展望11参考文献12致谢14三黄片HPLC指纹图谱的研究1序言中药由
7、于其成分的复杂性和作用的整体性、系统性1，而难以通过指标成分的测定进行有效地鉴别和评价。要实现中药研究“基本讲清药效成分，基本讲清作用机理”2的目标，就需要对中药的整体性进行评价。中药指纹图谱具有整体、宏观和半定量分析等特点，能够反应中药复杂成分内在质量的均一性和稳定性，成为目前国内外所广泛接受的一种中药评价技术1。尤其对一些有效成分尚不明确,或即使已知其成分但仍无法与构效一致时,中药指纹图谱是目前最能反映药材性质,并得到国际上认可的方法之一3。中药指纹图谱的评价系统4是指将样品指纹图谱与建立起来的对照指纹图谱进行相似性比较，从而对药品质量进行评价和控制。中药指纹图谱的评价5不同于定量分析，它
8、强调的是相似性（Similarity），而不是相同性（Identity），分析比较的结果是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出的评价。相似性的比较可以用相似度表达，相似度就是借助国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”计算，一般情况下4相似度在0.91.0之间即认为符合要求。高效液相色谱(HPLC)具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、稳定性和重现性好、流动相选择广、检测器种类多、色谱柱可反复使用等特点，且HPLC不受样品挥发度和热稳定性的限制，适用范围广。利用HPLC非常适合构建中药指纹图谱。三黄片的处方源于东汉时期医圣张仲景所著金匮要略中“泻心汤”一方，历经千年而不衰。该方
9、由大黄、黄芩、黄连三药组成，故名“三黄”6。河北邯郸制药厂于1958年在大量研究的基础上将该方由传统的汤剂改为片剂，名“三黄片”7。该药为中国药典2005年版一部所收载8。三黄片9主要由大黄(radix et rhizome rhei)、盐酸小檗碱（berberine hydrochloride）和黄芩浸膏（extractum scutellariae）组成。辅料为淀粉、糊精、蔗糖、柠檬黄、明胶、桃胶、虫白蜡、二甲硅油。具有清热解毒、泻火通便的功效，用于三焦热盛所致的目赤肿痛、口鼻生疮、咽喉肿痛、牙龈出血、心烦口渴、尿赤便秘，急性胃肠炎，痢疾等。目前检索到的关于三黄片HPLC的研究大多为对成分
10、含量的分析。如冯看等10，建立了四季三黄片中大黄素、大黄酚的含量测定方法；何军等11 ，建立了三黄片中盐酸小檗碱含量的HPLC测定方法；金玉12， 应用改进HPLC法测定了三黄片中黄芩苷的含量；祝忠民等13，采用HPLC法同时测定了三黄片中的盐酸小檗碱、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量；毛泉明等14，建立了RPHPLC法同时测定三黄片中黄芩苷、小檗碱、大黄素和大黄酚的含量。对于三黄片的HPLC指纹图谱的研究，目前仅检索到一篇，张艳菊等15，用甲醇超声提取后残渣再用甲醇溶解得供试液，采用Grace-C18(4.5mm250mm,5m) 色谱柱，乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，在254nm检测波长下，
11、分析时间1 10min，进行了不同厂家三黄片HPLC指纹图谱的比较。得到了16个共有峰，相似度较好。关于三黄片主要成分的HPLC指纹图谱的研究很多，如刘欣等16，研究了大黄的HPLC指纹图谱；王龙虎等17，以盐酸小檗碱为参照测定了黄柏药材及中药饮片的HPLC指纹图谱；肖丽和等18，对黄芩属四种药材的HPLC指纹图谱进行了初步研究。三黄片指纹图谱的研究有助于更好的评价其内在质量，提高中成药质量评价的技术水平和科技含量，有一定的必要性。该研究可为进行药材植物资源的进一步开发利用提供参考数据，为中药的规范化、标准化、产业化和国际化提供科学的技术平台，对中药现代化的战略行动具有科学的指导意义。三黄片价
12、格便宜，疗效显著，应用广泛。目前，全国有近200家企业生产三黄片19,但尤为邯郸制药厂（现名邯郸摩罗丹药业股份公司）生产的的华山牌三黄片最地道，不但采用原料上成地道，而且工艺精湛，是唯一获得过国家银质奖的优质产品20。作为邯郸市地方院校，对于邯药三黄片进行指纹图谱的研究，具有很强的必要性和可行性。本论文主要从以下方面进行三黄片HPLC指纹图谱的研究：三黄片供试品的制备，选定检测波长和柱温，以一定配比的流动相进行梯度洗脱，确定最佳色谱条件，从而建立三黄片的HPLC指纹图谱。并在此基础上利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度计算。2实验部分2.1 仪器和药品2.1.1实验仪器LC-2010A
13、 HT高效液相色谱仪（岛津国际贸易有限公司）；SHZ-D()循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；KW5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHS-3C型PH计（上海精密科学仪器有限公司）；AE240S型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）2.1.2实验试剂表1 实验试剂试剂纯度含量厂名甲醇分析纯99.5%天津市红岩化学试剂厂甲醇分析纯99.5%西陇化工股份有限公司乙腈分析纯99.9%天津市光复精细化工研究所纯净水食用级杭州哇哈哈集团有限公司冰乙酸分析纯99.5%天津市瑞金特化学品有限公司磷酸分析纯85%天津市瑞金特化学品有限公司乙醇分析纯99.7%天
14、津市红岩化学试剂厂丙酮分析纯99.5%天津市红岩化学试剂厂2.1.3实验用药品本实验选用邯郸摩罗丹药业股份公司（原邯郸制药有限公司）生产的华山牌三黄片，对10个不同批次的药品进行分析，药品均购自邯郸市各零售药店。药品批号如下：1512；109286；109486；109488；109606；109609；109557；110003；110012；110048。2.1.4标准品大黄酸，大黄素，大黄酚，大黄素甲醚，盐酸小檗碱，均为自制。2.2三黄片HPLC指纹图谱色谱的建立2.2.1供试品的制备取三黄片两粒，除去包衣，研细，精称0.25g于10ml容量瓶中，用甲醇-磷酸（100:1）溶解并定容至刻
15、度，在35下超声提取45min，超声后补足溶液至刻度，过0.45um微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。2.2.2色谱条件色谱柱：VP ODS C18(150mm4.6mm,5um)；体积流量：1.0ml/min；柱温：30；检测波长280nm；进样量：10ul；流动相：甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱。梯度洗脱条件见表2。表2 甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱条件时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水（%）057222431334450606570515304343505058788590909585705757505042221510102.2.3方法学考察及相似度计算2.2.3.1精密度实
16、验取同一批号（1512）供试品在上述色谱条件和测定方法下，连续进样5次，用相似度软件进行相似度计算。结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于97%，符合指纹图谱研究技术的要求，实验的精密度良好。相似度见表3。表3 精密度相似度批号S1S2S3S4S5相似度0.9750.9991.0000.9990.9982.2.3.2重复性实验取同一批号（1512）的五个不同样品，制成供试品溶液5份，在上述色谱条件和测定方法下分别进样检测，并用相似度软件进行相似度计算。结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于98%，符合指纹图谱研究技术的要求，实
17、验的重复性良好。相似度见表4。表4 重复性相似度批号S1S2S3S4S5相似度0.9990.9850.9840.9980.9822.2.3.3稳定性实验同一批号（1512）药品，制成供试品溶液，在上述色谱条件和测定方法下分别在0h、2h、4h、8h、10h、15h、20h、24h、36h进样检测，并用相似度软件进行相似度计算。结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于97%，符合指纹图谱研究技术的要求，样品稳定性良好。相似度见表5。表5 稳定性相似度时间/h024815202436相似度0.9990.9980.9970.9980.9980.9760.9780.99
18、62.3批次药品的指纹图谱测定按照选定的色谱条件对10个批次的三黄片供试品溶液进行指纹图谱检测。用中药指纹图谱相似度计算软件进行相似度计算，对各个峰进行对比分析，确定19个共有峰，见图1。各共有峰的保留时间和峰面积见表6。相似度见表7。 图1 10批三黄片供试液HPLC指纹图谱共有模式图2 三黄片供试液HPLC对照指纹图谱表6 共有峰的保留时间与峰面积编号12345S1239474.1165007.92191663140203.82570132S2289120.1238247.320352251533173909388S3305924.8160390.520920312318413379555
19、S4249707.8168204.822574151689523727018S5271967.910950692163534195250.33759341S6272309.3200665.12167681199914.63803043S7273653.1398954.4188369860019.983493397S8320867.32402302334137202555.13886898S9268556.4228670.61992027147176.83759109S10394411.8747930.1286794506188142保留时间2.2275.3776.5057.35210.67对照
20、指纹图谱288599.3364336.92198536149923.13847602峰面积RSD（%）15.3485.7612.2447.223.71(表6续表)编号678910S1867184.3634299.31604508331418016989190S2100189711366661244325306962918278680S3868636.1676182.41608663300638017881530S4853243.2661042.11738212179698620439130S51311566984296.62101357369963417593250S6983288.16971
21、59.41849649342760219023990S72230515941147.91953562126367919358460S81171916719330.61803071328490720462630S9952516.9765529.91587870436378517927400S10265953311888852402226313407217136880保留时间12.07613.83714.93116.7718.897对照指纹图谱1290030840453.81789344303608518509114峰面积RSD（%）49.1124.5317.7829.436.82(表6续表)编号
22、1112131415S1537328.44587648264449.9458643401258777S2250393.24796268361387.247409510980007.7S3176440.74287078197097.443252020907736.3S4237020.24761597308457.346659740889882.4S511619317040948612886.7456353601622805S6235363.35161355324365.946979150961153.1S7313918.24819292382945.8500107401107828S822240
23、3.24906296369427.945289120944284.1S9233074.94546649310979.144501430916664.3S10329037.16998212578739.4487916602285600保留时间22.09924.28226.81929.19932.471对照指纹图谱3696915190534371073.7464393061187474峰面积RSD（%）80.0419.135.164.2937.66(表6续表)编号16171819S14290070144264218436001406053S25330834165047820277831284971
24、S33799947131774418534361328499S43822604144813318089921249110S57345790174080923222701486247S64084955151278818834812107991S74093036127290614734671067599S84959238149093322968441300189S96371736149292319330071151951S1010364190214146625427801182937保留时间35.22939.13549.80952.423对照指纹图谱544624015510821998566135
25、6555峰面积RSD（%）38.3516.0415.5121.42表7 10批样品的相似度批号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10相似度0.9900.9930.9920.9920.9870.9910.9930.9930.9870.9842.4特征峰的指认经过标准品的指认，其中9号峰为盐酸小檗碱成分的特征峰，在本色谱条件下，经过标准品进样，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚均为未开，在55min时出峰，由于峰的重叠导致出峰时间不尽相同，中药相似性软件对此处的峰并未按照共有峰处理。经过指认，三黄片中大黄的主要存在成分是大黄素和大黄酸。3 讨论3.1色谱条件的选择3.1.1供试品制备条件的选择
26、根据三黄片中中药成分的性质21，并参考相关文献10-15，本实验采用超声提取的方法制备供试品溶液。提取溶剂考察了：甲醇、甲醇-水（70-30）、甲醇-水（50-50）、甲醇-磷酸（100:1），乙醇、乙醇-水（70:30）、乙醇-磷酸（100:1），丙酮、丙酮-水(70:30)，丙酮-磷酸（100:1），其中以甲醇-磷酸（100:1）提取的供试品溶液出峰数目最多且峰高较大，故采用甲醇-磷酸（100:1）为提取试剂。提取时间考察了：35min、45min、60min，其中45min和60min的供试品图谱相差不大，峰数和峰高均大于35min的，考虑到在不影响实验结果的前提下节约时间和能源，选用4
27、5min的提取时间。 3.1.2流动相的选择预设色谱条件：色谱柱：VP ODS C18(150mm4.6mm,5um)；体积流量：1.0ml/min；柱温：30；检测波长：1=280nm,2=254nm；进样量：10ul；梯度：流动相一从5%到95%在100min进样时间内等梯度。流动相的预处理：0.45um微孔滤膜抽滤。考察的流动相：（1）甲醇-磷酸表8 甲醇-磷酸流动相的考察流动相1流动相2图谱情况描述甲醇磷酸水溶液0.05%0.1%0.2%5%峰高较小，75min后基线出现明显漂移30min之前没有明显的峰出现，峰个数少基线基本平稳，峰个数较多，峰形较尖基线平稳，但峰高和峰个数减少（注：
28、图谱情况描述均以1=280nm为准）（2）甲醇-冰乙酸表9 甲醇-冰乙酸流动相的考察流动相1流动相2图谱情况描述甲醇冰乙酸水溶液0.05%0.1%0.2%3%峰宽较大，峰分离不明显，后期基线漂移严重峰宽较大，峰分离不明显峰宽较大，峰分离不明显，后期基线漂移显著峰个数较多，峰形较尖，70min后出现基线漂移（3）乙腈-磷酸表10 乙腈-磷酸流动相的考察流动相1流动相2图谱情况描述乙腈磷酸水溶液0.1%0.2%峰宽较大，后期基线漂移严重、峰无法达到分离峰宽较大，峰无法达到分离，后期尤为显著 （4）乙腈-冰乙酸表11 乙腈-冰乙酸流动相的考察流动相1流动相2图谱情况描述乙腈冰乙酸水溶液0.1%0.2
29、%3%峰宽较大，峰分离不明显峰宽较大，峰高较小，后期基线漂移严重峰形较尖，但后期基线漂移严重综上分析，甲醇-0.2%磷酸流动相的色谱图基线基本平稳，峰个数较多，峰形较尖，供试品溶液在此条件下吸收较明显、分离程度较好，故选择该流动相。3.1.3梯度的调整根据梯度条件一（5%95%等梯度）的图谱情况，对洗脱梯度进行调整，调整尝试情况如下：（）梯度条件一： 表12 梯度条件一时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水（%）0110595955色谱图描述：基线平稳，10min内有两个小峰出现，10-30min内基本没有峰出现，30-60min出现多个分离程度较好的尖峰，65-75min内基本没有峰出现，7
30、5-85min内有一峰没分开，85min后基本不再出峰。根据以上图谱情况对梯度条件进行调整。（）梯度条件二：表13 梯度条件二时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水（%）01015708595100515307585100100958570251500色谱图描述：基线平稳，10min内有两个小峰出现，10-15min内基本没有峰出现，15-40min出现多个分离程度较好的尖峰，40-55min内峰分离程度不好，60-70min内基本没有峰出现，最后一个尖峰提前至70min出现且峰高降低。根据以上图谱情况对梯度条件进行调整。（）梯度条件三：表14 梯度条件三时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水
31、（%）051050556570755153565758090909585653525201010色谱图描述：基线平稳，峰高普遍降低，7min内有两个小峰出现，10-20min内峰分离程度不好，20-40min出现两个分离程度较好的尖峰，50-60min内只有一个小峰出现，最后一个尖峰提前至60min出现，分离程度不好。根据以上图谱情况对梯度条件进行调整。（）梯度条件四：表15 梯度条件四时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水（%）0510204045505560651020404565777785909090806055352323151010色谱图描述：基线平稳，总体分离效果较好， 6min
32、内有两个小峰出现，10-15min内的峰分的不开，最后一个尖峰的峰高降低。根据以上图谱情况对梯度条件进行调整。（）梯度条件五：表16 梯度条件五时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水（%）057454755606510203270788090909080683022201010色谱图描述：基线平稳，总体分离效果较好，40-50min内只有一个小峰出现，最后一个尖峰的峰高较低。根据以上图谱情况对梯度条件进行调整。（）梯度条件六：表17 梯度条件六时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水（%）057222535385355606570515302225353853556065709585707875
33、65624745403530色谱图描述：基线平稳，总体分离效果较好， 40-60min内出峰较少，最后一个尖峰的峰高仍较低。根据以上图谱情况对梯度条件进行调整。（）梯度条件七：表18 梯度条件七时间（min）甲醇（%）0.2%磷酸水（%）05722243133445060657051530434350505878859090958570575750504222151010色谱图描述：基线平稳，峰宽较小，峰形较尖，峰分布均匀，总体分离效果较好。故采用此梯度为指纹图谱的洗脱梯度。3.1.4波长的选择考虑到三黄片中主要成分均为有色物质6，检测波长在紫外和可见光区均进行了考察。考察的波长分别为254n
34、m、260nm、270nm、276nm、280nm、347nm、375nm、420nm、440nm、526nm。可见光区波长下的图谱均不同程度的出现了峰高小、峰数目较少的问题，且波长越大越明显，故选吸收强度较大的的紫外光。比较各图谱的出峰数目、峰高及图谱整体形状特点，其中波长为280nm时的色谱图最为理想，三黄片各主要成分在此波长处有最大吸收，故选择波长为280nm。3.1.5柱温的选择柱温分别考察了30、35、40，柱温在35、40时峰高均有减小，且40时的减小更为显著，故本实验选择柱温为30。3.2指纹图谱的相似度比较及差异分析在本实验色谱条件下获得的三黄片指纹图谱色谱峰数目最多，峰形较尖
35、，分离度较理想。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以10批三黄片供试液的指纹图谱综合平均作为对照模板，计算10批样品共有峰的相似度，结果均大于98%，说明该厂家不同时间生产的三黄片质量稳定。此外从指纹图谱中还可以看出，峰面积比值不尽相同，说明不同批号的药品在含量上存在差异，原因可能为所使用的原料来源不够稳定，如产地、生长环境和采集时间等的差异，也可能是原料相同而在生产过程中存在差异，所以必须在固定原料药材产地及提取工艺和生产条件的前提下，才可能保证中成药的质量稳定可控。由此可见，通过指纹图谱可以控制生产流程，可以及时、全面地对生产过程中的药材、中间产物及其成品进行质量监控，从而为提高药品的内
36、在质量提供了保证。4 实验结果分析和展望由于条件和水平有限，本实验存在以下不足：首先由于标准品有限，本实验并未对三黄片的另一主要成分黄芩苷的特征峰进行指认；其次，大黄的主要成分（包括大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚等）的峰在该色谱条件下没有分开；第三，洗脱梯度过于复杂；第四，分析时间较长，不能达到快速分析的要求。对于本实验的改进和进一步研究计划在以下方面展开：首先对三黄片各主要成分的特征峰一一进行指认，以确定各主要成分的保留时间和含量，为药品的生产和质量控制提供更为全面的信息；其次，选择更合适的提取条件和流动相以达到对大黄主要成分的特征峰全部进行分离；第三，精炼洗脱梯度、缩短分析时间，使该分
37、析方法更简单高效、便于应用。另外，由于时间有限，本实验仅对一个生产厂家的三黄片进行了分析，下一阶段应对不同厂家的药品进行分析以达到对三黄片全面、整体的评价和分析。方法学考察显示本实验方法稳定、可靠，对三黄片的内在质量的评价仍有一定的实用价值。对指纹图谱的进一步研究也能起到一定的参考作用。中药指纹图谱研究一般分为初级和高级两个阶段22, 初级阶段是确立指纹图谱的建立方法及相似度判定, 得到相对完备的中药指纹图谱后应进入研究的高级阶段，即指纹图谱特征和药效相关性研究、指纹图谱的生物等效性研究。本文对三黄片的指纹图谱研究，只是其指纹图谱研究初级阶段的一部分，建立相对完备的三黄片指纹图谱还需要进一步更
38、深层次地研究。中药指纹图谱的研究经过数十年的研究和发展23，积累了大量数据，在一定程度上，为中药的整体性说明打下了较好的基础。但是，要实现有效的反映和控制中药的整体质量和指纹性描述的作用，使指纹图谱技术成为被国际上广泛承认和采用的质量控制标准方法，实现中药的现代化和国际化24，还需要进一步深入的研究。 参考文献1 王勇, 梁琼麟, 胡坪, 王义明, 罗国安. 色谱及相关技术在中药质量评价中的作用J,色谱, 2008, 26(2):136-1412 罗国安, 王义明. 世界科学技术J. 中药现代化, 1999, 1(1):113 金杰, 董鸿晔, 张洵. 中药指纹图谱专家系统推理机理的构建J,
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