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1、科类 农学 编号（学号） 20080463 本科生毕业论文 云南桑树病菌初步鉴定及其对咪酰胺的敏感性测定The Identification of Mulberry Fungus and The Sensitivity of Prochloraz in Yunnan 指导教师： 职称 讲师 云南农业大学 昆明 黑龙潭 650201 学 院： 园林园艺学院 专 业： 蚕学 年级： 2008 级 论文（设计）提交日期： 2012 年 5 月 答辩日期： 2012 年 6 月 答辩委员会主任： 云南农业大学 2010 年 5 月 云南桑树病菌初步鉴定及其对咪酰胺的敏感性测定 （云南农业大学园林园艺学
2、院昆明 650201） 摘 要 云南桑树病害的发生逐年严重，严重阻碍了蚕桑产业的可持续发展。本文以 8 株从云南主要桑树产区分离到的菌株为材料，采用菌落直径法对咪酰胺 EC50 进行测定。结果表明，咪酰胺对所分离的 8 个菌株中的三个菌株抑制率高：细极链格孢（3 号）、甘蓝长尾交链孢霉（4 号）和禾赤霉菌（5 号）的 EC50lt0.1，桑牙枯菌（6 号）的 0.1EC500.5，蔓枯病菌（7 号）0.5EC500.1，细极链格孢（8 号）的 1EC502，桑干枯病（2 号）和天竺葵链格孢9 号的 EC5017。说明咪酰胺对桑树病菌的抑制作用显著，可有效防治桑树真菌病害。 关键词：咪酰胺；桑树
3、病害；EC50；敏感性；抑制率。 The Identification of Mulberry Fungus and The Sensitivity of Prochloraz in Yunnan Chen wen zhi Yunnan agriculture university landscape gardening college ABSTRACT Mulberry Morus alba L. was always infected by many fungus which had embarrassedthe sustainable development of sericicultu
4、ral industry severely. In this paper there were 8isolates from the main mulberry growing areas in Yunnan for prochloraz was tested usingcolony diameter measurement. The EC50 were also determined. There were 3 isolates withhigher inhibition rare. EC50 for Alternaria tenuissima NO.3 Alternaria brassic
5、ae NO.4and Gibberella zeae NO.5 lower than 0.1 while Fusarium cerealis NO.6 from 0.1 to 0.5Didymella bryoniae NO.7 from 0.5 to 1 Alternaria tenuissima NO.8 from 1 to 2 ，Phomopsis sp No.2 and Alternaria porri No.9 higher than 17. The results showed thatprochloraz could inhibit mulberry diseases. Key
6、word: microphones amide mulberry disease EC50 sensitivity inhibition rate 云南桑树病菌初步鉴定及其对咪酰胺的敏感性测定1 前言1.1 桑树基本情况 我国是世界上种桑养蚕最早的国家，也是中华民族对人类文明的伟大贡献之一。桑树的栽培已有七千多年的历史。在商代，甲骨文中已出现桑、蚕、丝、帛等字形。到了周代，采桑养蚕已是常见农活。春秋战国时期，桑树已成片栽植。我国收集保存的桑树种质分属 15 个桑种 3 个变种，是世界上桑种最多的国家。其中栽培种有鲁桑、白桑、广东桑、瑞穗桑；野生桑种有长穗桑、长果桑、黑桑、华桑、细齿桑、蒙桑、山
7、桑、川桑、唐鬼桑、滇桑、鸡桑；变种有鬼桑蒙桑的变种、大叶桑白桑的变种、垂枝桑白桑的变种1。原产我国中部，有约四千年的栽培史，栽培范围广泛，东北自哈尔滨以南；西北从内蒙古南部至新疆、青海、甘肃、陕西；南至广东、广西，东至台湾；西至四川、云南；以长江中下游各地栽培最多。垂直分布大都在海拔 1200m 以下。1.2 云南省桑树主要病害 桑树的病害很多，按危害桑树的部位可分为全株性病害、桑叶病害、枝干病害和根部病害。云南省危害较多有以下几种。1.2.1 桑萎缩病 病原：由病毒引起。 症状：萎缩病有花叶型、黄化型和萎缩型三种。桑树发病，叶片缩小，叶色转黄，病叶变成圆形或半圆形。枝叶丛生矮化、细小，侧枝簇
8、生成团，病枝无花椹。黄化型叶缘向叶背卷曲；花叶型叶缘略向叶面卷缩；萎缩型皱缩，但叶不卷曲。叶肉部分斑块状 2褪绿，形成黄绿相间的花叶，叶脉有小瘤状突起 。1.2.2 桑白粉病 病原：为球针壳属的真菌。它利用附着器附着在叶子表皮上，部分组织能从气孔进入叶肉组织的细胞间隙，产生吸收器，摄取营养。 症状：本病多发生于枝条中下部的叶片。病叶背面产生白粉状圆形霉斑，后期病斑颜色由黄变黑，连成一片，最后出现小黑点。桑白粉病多发生在秋季湿润的环境中，病菌发芽适应的温度为 23，桑叶硬化早的品种更易发生。严重时布满叶背面3。1.2.3 桑褐斑病 病原：病原菌属黑盘孢科粘隔孢属，初生于叶表皮下，形成分生孢子盘，
9、分生孢子盘成熟后突破叶表皮。一般在未腐烂的病叶上越冬。 症状：初期为褐色病斑，水渍状，呈芝麻大小的斑点，后逐渐扩大成近圆形或三角形。病斑周围绿色减退变黄，同一病斑在正背面叶面均有，遇到阴湿连绵的天气，吸收膨胀，有烂叶情况4。严重时，病斑相互连接，叶片枯黄易脱落。1.2.4 桑赤锈病 病原：为锈孢属的真菌。往往在病组织皮下形成菌丝体团块，以后发育成球形的锈子器，隆起泡泡纱状。由淡黄转深，逐渐成熟，最后突破寄生表皮，露出皮面。 症状：本病在温度 13-18，湿度 80以上易发生，高干桑较多，发病后桑叶局部变得臃肿，弯曲表现为畸形，叶面出现橙黄色的病斑，病斑上密布桔红色的孢子，孢子 1随风雨传播，引
10、起再次侵染 。1.2.5 桑干枯病 病原：野村间座壳菌，球壳目，间座壳科，间座壳属，其无性世代是拟茎点属Phomopsis sp。 症状：35 月桑树发芽前后，距地面 4050cm 以下枝于上出现椭圆形至不规则形浅黄色病斑，后成赤褐色，病斑扩展环绕枝干一周后，病部以上枝条枯死。56 月份病健组织交界处稍凹陷，橙黄色，上生鲨鱼皮状小疹，6、7 月后小疹外皮破裂，露出黑点2 。1.2.6 桑紫纹羽病 病原：为卷担子纲的真菌，菌丝体寄生在细胞间或紧贴在根部细胞外面，靠渗透压的不同，吸取养分，真菌适应条件范围广，很易生长。 症状：发病后根部失去光泽，根外包一层紫色的细丝状菌丝，在靠近地面的根上有紫红色
11、的菌丝膜，严重时变成黑褐色而腐烂，仅剩下木质部，病株很容易拔起。栓部不腐烂象管套一样留在土中，地上部分生长缓慢，枝叶细小，叶色变黄，下部叶片脱落，枝梢停止生长，芽叶枯萎，最后整株枯死。苗圃发病严重时，短期内成片死亡5。1.3 咪酰胺防治作物病害的基本原理 咪酰胺是一种广谱性杀菌剂，其系抑制麦角甾醇生物合成，具有保护和铲除作用，对多种作物子囊菌和半知菌病害有显著防效。可用于防治禾谷类作物茎、叶、穗上的许多病害，如白粉病、叶斑病，叶面喷洒为 0.31.0 kg/hm。咪酰胺可用于果树、蔬菜、蘑菇、草皮和观赏植物的许多病原菌，可与多种杀菌剂、杀虫剂、除草剂混配6。1.4 咪酰胺对其他作物病害的防治情
12、况 20咪酰胺三环唑可湿性粉剂对水稻穗瘟病具有较好的防效，且对水稻生长安全，具有一定的增产作用7。以 20戊唑醇井冈霉素咪酰胺 750g/h m2 处理增产效果最显著，达到 91，其增产作用主要通过增加稻谷结实率来实现8。防治器苗病的关键措施是搞好水稻种子药剂处理，咪酰胺对早稻恶苗病具有很好的防治效果。温度在 10l8 ，咪酰胺用量为 60 mlhm ，浸种 72 h，不淘洗直接播种，防效达 9889。咪酰胺不同用药量处理对水稻出芽进度和芽率都有一定的影响，咪酰胺浸种后淘洗与否，对种子出芽进度影响较大而对总体芽率影响小10。咪酰胺不同用药量对水稻最终成穗率、每穗实粒数、千粒重和水稻产量都有一定
13、的影响。随着用药量的增加和浸种时间的加长，成穗数呈减少趋势。综合考虑咪酰胺不同用药量的防病和增产效果，经济有效地使用咪酰胺以 60mlhm 浸种 72 h，不淘洗处理增产效果最好，咪酰胺的用药量过高反而导致水稻减产，降低经济效益11。 目前云南省的桑树病害的控制多用药剂，但是没有用到咪酰胺，而咪酰胺对其他作物的病害防治效果显著，因此我做这方面的实验，根据实验数据证明咪酰胺是否对桑树病害蟹乐涡?.5 目的意义 咪酰胺是目前新兴的一种农药6，把其应用在桑树病害上，观察其是否对桑树病害有防治效果，以期为云南省桑树病害的防治提供理论依据。1.6 试验流程 技术路线图 曲靖、保山采集新鲜带病桑叶 植物保
14、护学院何永红老师提供 编号为 SHB 的病原菌 5NaClo 处理 病原菌分离 病原菌活化2 材料与方法2.1 实验仪器 培养皿、500ml 锥形瓶、200ml 锥形瓶、酒精灯、接种针、打孔器、电子天平、培养箱、显微镜、PCR 仪、摇菌箱、烘菌箱、超净工作台。 药品：灭菌水、咪酰胺。2.2 供试培养基 PDA 培养基：马铃薯 220g；琼脂粉 22g；葡萄糖 22g；蒸馏水定容至 1L。2.3 病样 保山、曲靖桑树上采摘下病叶2.4 病菌分离与培养2.4.1 病菌分离 病叶置于超净工作台分离。取病部和没病部交界处组织，5次氯酸钠溶液消毒 3 分钟，无菌水冲洗 3 次后置于 PDA 平板上，常温
15、暗培养三到五天。2.4.2 病菌纯化 挑取单菌落置于 PDA 平板上，常温暗培养五天。2.4.3 单孢分离 病菌纯化后培养 5-7 天使其长出分生孢子；把显微镜置于超净工作台上，打开紫外灯灭菌 30 分钟左右；把枪头放在 PDA 平板的菌丝上挂一下，使其附着菌株的孢子；把带有孢子的枪头放到装有蒸馏水的小试管中稀释；取稀释好的孢子溶液滴 1 滴到载玻片的水琼脂上，把小液滴碾开放到显微镜载物台上；调好焦距左右移动载玻片找到菌株的孢子；若在水琼脂的小片区域内只有一个孢子，小心切下水琼脂放到 PDA 平板上培养。2.4.4 病菌活化 桑树病原菌的活化，按照以下步骤进行：培养皿准备：将培养皿灭菌备用；培
16、养皿平板制备：往熔化而冷至 45左右的马铃薯琼脂培养基（PDA）中加入一定量的青霉素，充分摇动混匀后，倒入灭菌后的培养皿中，静止冷却；用无菌操作法将保存的桑树病菌移至 PDA 平板上，放入 25恒温箱内培养 5 日，备用。2.5 病菌鉴定2.5.1 形态鉴定 将待测菌株分别接种于 PDA 培养基上，25黑暗条件培养 7 天后观察菌落性状。菌落颜色参照 Raynor 的方法进行划分。菌株产孢后用无菌水将孢子洗脱并配制成孢子悬浮液，于显微镜下随机挑选 20 个孢子测量孢子的长、宽、孢子和中间色孢的颜色、顶部附属丝和基部附属丝的多少及长度等指标。然后参照真菌志进行鉴定。2.6 分子鉴定2.6.1 摇
17、菌 摇菌按一下步骤进行：做液体培养基，在 200ml 的锥形瓶中装入 1/3 的液体培养基，放到高压灭菌锅中灭菌备用；把单胞分离培养后的菌株在超净工作台中接种到锥形瓶中；把锥形瓶放到摇菌箱中固定好，在常温条件下，设置好摇菌箱进行摇菌。5 到 7 天后取出锥形瓶。2.6.2 烘菌 把摇好的菌株从锥形瓶中倒入培养皿取出接种时的固体培养基，把菌落中的水吸干，放到培养皿中在烘菌箱中把菌丝烘干，用滤纸包好备用。2.6.3 制备 DNA 在液氮中把烘干的菌丝磨碎，把磨碎的菌丝放入小试管溶液中，放到离心机中离心。离心完以后提取含有 DNA 的上清液。把含有 DNA 的上清液放入小试管中并放到-4的冰箱中保存
18、备用。2.6.4 PCR 测定 把配置好的 DNA 上清液放到明胶上在电泳槽中跑胶，把跑好的胶放到 PCR 仪中观察菌株的 DNA 含量。2.7 农药测定2.7.1 供试杀菌剂 咪酰胺，浓度设置：10ug/ml30ug/ml50ug/ml100ug/ml150ug/ml2.7.2 杀菌剂的配制 配制 5103ug/ml 母液： 用电子天平各称取 0.05g 的咪酰胺杀菌剂，然后各加入 10ml的丙酮溶解，即配成的药剂母液；配制 103ug/ml 母液：取上述母液 1ml，加入 4ml 丙酮溶解，即配成 103ug/ml 的药剂母液； 配制咪酰胺不同浓度浓度的稀释液： （终体积 5ml因需 50
19、0mlPDA，溶剂中 PDA 含量1）150ug/ml:取 103ug/ml 的溶液 750ul加入 4250ml丙酮；100ug/ml:取 103ug/ml 的溶液 500ul加入 4500ul 丙酮；50ug/ml:取 103ug/ml 的溶液 250ul加入 4750ul 丙酮；30ug/ml 取 103ug/ml 的溶液 150ul加入 4850ul 丙酮 310ug/ml 取 10 ug/ml 的溶液 50ul加入 4950ul 丙酮。将（3）中各浓度溶液 5ml 加入到500mlPDA 中，制得浓度分别为 1.5ug/ml1.0ug/ml0.5ug/ml0.3ug/ml0.1ug/
20、ml 的 PDA平板（3 次重复的量）。对照 PDA 平板制备：取 5ml 丙酮加入到 500mlPDA 中 3 次重复的量。桑树病菌接种：将培养 5 天后的桑树病菌在无菌条件下用灭菌后的 5mm 打孔器在菌落边缘切下菌饼，用接种针将菌饼接种于上述各含药剂的和对照的培养皿中央，菌丝朝下。每皿接 4 个菌，每个菌重复三次。培养菌株：将所有培养皿放入 25恒温培养箱中培养 3-4 天后，用十字交叉法测量菌落直径，取平均值。依据下式计算不同浓度药剂对桑树病菌的菌丝生长抑制率： 对照菌落增长直径（mm）处理菌落增长直径（mm） 抑制率（） 100 对照菌落增长直径（mm） （菌落增长直径菌落直径-菌饼
21、直径） 根据“反应率-几率值”转换表将抑制生长率转换成抑制率几率值。然后以杀菌剂浓度的对数值为横轴 ，以抑制率几率值为纵轴，做出 LP-D 线性方程式 yaxb。由线性公式计算各种药剂对桑树病菌各菌株的 EC50抑制中浓度及相关系数 r。3 结果与分析3.1 桑树病菌的鉴定3.1.1 菌株分离 2010 年 6 月至 10 月间自云南曲靖、保山等桑树种植区的叶子和枝条上采集病样。 于所有菌株均采用 PDA 培养基进行分离， 25黑暗条件下培养，待产孢后挑取单孢进行纯化。菌种在 PDA 斜面上于 4冰箱中保存。 1 号菌株从保山地区桑叶上采集得到，病斑为黑褐色大斑点状。2、3、4、5、6、7、8
22、、9 号菌株采样地为曲靖，2、3、4、5 号菌株从桑树叶片上分离得到，2、4、5 号菌株病斑形状为斑点状，3 号菌株病斑形状为条状，病斑颜色都为黑褐色，6、7 号菌株从桑树枝条上分离得到，病斑都为黑褐色斑点状，8、9 号菌株从桑树叶柄上分离得到，8 号菌株病斑为条状，9 号菌株病斑为斑点状，颜色都为黑褐色。 表 1 桑树病菌采集地点、分离部位和病症 Table 1 mulberry germs collecting site separate parts and disease 菌株编号 名称 采集地点 分离部位 病斑形状 病斑颜色 1 保 2-2 保山 叶片 斑点状 黑褐色 2 曲 4-1-
23、1 曲靖 枝条 斑点状 黑褐色 3 曲 6-2-1 曲靖 叶片 条状 黑褐色 4 曲 5-1-1 曲靖 叶片 斑点状 黑褐色 5 曲 5-1-2 曲靖 叶片 斑点状 黑褐色 6 曲 2-2-2 曲靖 叶片 斑点状 黑褐色 7 曲 2-1-2 曲靖 枝条 斑点状 黑褐色 8 曲 5-2-1 曲靖 叶片 条状 黑褐色 9 曲 3-1-1 曲靖 叶片 斑点状 黑褐色3.1.2 形态鉴定结果 ，在 PDA 平板上培养 1 号菌株菌落正面为粉红 菌落形态观察结果表明（表 2，图 1）色，菌丝丝状，背面粉红色，孢子堆黑色较少，生长过程中产生红色色素。2 号菌株菌落正面白色，丝状菌丝，背面白色，孢子堆黑色较
24、多。3 号菌株菌落正面米黄色，有同心轮纹，絮状菌丝，背面枯黄色有同心轮纹，孢子堆黑色较多，生长过程中产生黄色色素。4 号菌株菌落正面米白色，有同心轮纹，菌丝丝状，背面白色，孢子堆黑色较多。5号菌株菌落正面白色，菌丝丝状，背面枯黄色，有同心轮纹，孢子堆黑色较少。6 号菌株菌落正面白色，有同心轮纹，菌丝丝状，背面黑黄相间没有同心轮纹，孢子堆黑色较多。7 号菌株菌落正面黑白相间，有同心轮纹，菌丝絮状，背面黑黄相间，有同心轮纹，孢子堆黑色较多。8 号菌株菌落黑白相间，有同心轮纹，丝状，背面黑黄相间，孢子堆黑色较多。9 号菌株菌落黑白相间，有同心轮纹，菌丝丝状，背面黑黄相间，有同心轮纹，孢子堆黑色较多。
25、 表 2 9 种菌株在 PDA 平板上的形态特征 Table 2 nine in the PDA plating strains the morphological characteristics 编号 名称 正面形态 背面形态 孢子堆 1 保 2-2 粉红色 丝状 粉红色 黑色 较少 2 曲 4-1-1 白色 丝状 白色 黑色 丰富 3 曲 6-2-1 米白色 有轮纹 絮状 桔黄色 有轮纹 黑色 丰富 4 曲 5-1-1 米白色 有轮纹 丝状 白色 黑色 丰富 5 曲 5-1-2 白色 丝状 桔黄色 有轮纹 黑色 较少 6 曲 2-2-2 白色 有轮纹 丝状 黑黄相间 有轮纹 黑色 丰富 7
26、 曲 2-1-2 黑白相间 有轮纹 絮状 黑黄相间 有轮纹 黑色 丰富 8 曲 5-2-1 黑白相间 有轮纹 丝状 黑黄相间 黑色 丰富 9 曲 3-1-1 黑白相间 有轮纹 丝状 黑黄相间 有轮纹 黑色 丰富 A B 图 1 菌株在 PDA 平板上的形态 A、菌株在 PDA 平板上的正面形态 B、菌株在 PDA 平板上的背面形态 Figure 1 straince on the PDA plating in formA. Strains on the PDA plating in positive form B. Strains on the back of the PDA plating
27、form ，1 孢子形态观察结果表明（表 3，图 2） 号菌株孢子很小形状为椭圆形，光滑，近无色，成堆时绿色，长在 1.64um-2.30um 之间，宽在 0.84um-1.38um 之间，初步鉴定为亚木霉（Trichoderma koningii） 号菌株子囊壳扁球形生于分生孢子器的周围，子囊 。2孢子纺锤形或椭圆形，有 1 个隔膜，无性世代的分生孢子器扁球形，分生孢子纺锤形，长椭圆形或卵形，无色，9142.54um，初步鉴定为桑干枯病（Phomopsis sp）。3、 98、 号菌株桑树病菌孢子形状为棒状，有尾和须。本体被隔膜隔开成 4 个黑褐色的细胞，本体长在 11.83um-15.11
28、um 之间，须长在 5.43um-9.84um 之间，尾长在 2.02um-4.93um之间，孢子宽在 2.30um-3.63um 之间，初步鉴定为拟盘多毛孢（Pestalotiopsis）。4号菌株分生孢子梗榄褐色，不常分枝，有隔膜 07 个，上部屈曲，有显著孢子痕，1448613um；分生孢子单生或形成 4 个孢子的短链，长卵形或倒棍棒形，33147933um，有横隔膜和纵隔膜，初步鉴定为甘蓝长尾交链孢霉（Alternaria brassicae）。5号菌株子囊壳散生，壁深蓝色或深紫色，子囊棍棒形，无侧丝，子囊孢子梭形，无色，有 3 个隔膜，无性阶段为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，大型分生孢子聚集时呈淡红色，镰刀形或梭形，有性态为玉蜀黍赤霉Gibberella zeae Schw. Petch. 属于子囊菌亚门球壳菌目赤霉属，多有 3 个隔膜，孢子长在 9.55um-15.19um 之间，宽在1.89um-2.69um 之间，初步鉴定为禾赤霉菌（Gibberella zeae） 号菌株子囊.
