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1、硕士学位论文吸烟对牙周炎基础治疗前后龈沟液中C反应蛋白水平的影响 The impact of smoking on C-reactive protein levels in the gingival crevicular fluid before and after initial treatment in periodontitis 作者姓名： 专 业：口腔临床医学研究方向：牙周病学 指导教师： 培养单位：口腔医学院中文摘要吸烟对牙周炎基础治疗前后龈沟液中C反应蛋白水平的影响牙周炎是由多种牙周致病菌引起的牙周支持组织慢性感染性疾病，定居在牙颈部及龈沟内的牙菌斑微生物为其主要的感染源。尽管牙菌
2、斑为牙周病的始动因素，但其单独存在并不一定能引起牙周病。吸烟是人类许多疾病的一个重要危险因素，许多横向和纵向研究均证实，吸烟是牙周炎尤其是重度牙周炎的高危因素。龈沟液中含有来源于细菌和人体组织的多种成分，龈沟液的量及其成分的变化可作为评估牙周炎临床症状和预后的指标。C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）作为一种急性期反应蛋白，其在致炎过程中发挥着关键作用。因此，近年来CRP越来越受到学者们的关注。目的：1. 通过比较牙周基础治疗前，吸烟与非吸烟中重度牙周炎患者PLI、BI、PD、AL，以探讨吸烟对牙周组织破坏程度的影响；2. 通过测定牙周基础治疗前GCF的量和GCF中CRP
3、的水平，以探讨吸烟对牙周炎症状态下GCF量和其中CRP浓度的影响；3. 通过进一步比较牙周基础治疗前后吸烟与非吸烟中重度牙周炎患者PLI、BI、PD、AL以及GCF量和其中CRP浓度的变化，以探讨牙周基础治疗对吸烟和非吸烟中重度牙周炎患者的治疗效果，以及吸烟对牙周炎基础治疗效果的影响。方法：1. 病例选择：随机选取2011年3月至2011年10月就诊于吉林大学口腔医院牙周病科，被诊断为中重度牙周炎，年龄、性别相匹配的吸烟者和非吸烟患者各18例。2. 样本的采集和保存：利用吸潮纸尖采集牙周基础治疗前和基础治疗后4周受试牙的龈沟液于Eppendorf管中，并用电子天平称重后，-70冷冻保存，待检。
4、3. 临床指标的检查和记录：检查并记录牙周基础治疗前和基础治疗后4周的临床指标。其中，以Silness&Le菌斑指数，判断受试者治疗前后菌斑堆积的量；利用Mazza龈沟出血指数记分方法，观察治疗前后牙龈出血程度的变化。同时按照牙周病学（第3版）的标准，检测受试者治疗前后PD、AL的变化。4. 龈沟液中CRP的检测：利用CRP放射免疫试剂盒，采用放射免疫平衡法测定受试牙龈沟液中CRP的含量。5. 统计学分析：利用统计学软件包SPSS13.0对实验中所得数据进行统计学分析。结果：1. 在牙周基础治疗前，吸烟组PLI、PD以及AL明显高于非吸烟组；吸烟组BI低于非吸烟组。牙周基础治疗后4周，吸烟组和
5、非吸烟组PLI、BI、PD、AL均较治疗前明显降低。2. 在牙周基础治疗前，吸烟组GCF的量及其中CRP的浓度明显高于非吸烟组。牙周在基础治疗后4周，吸烟组与非吸烟组GCF的量及其中CRP的浓度较治疗前明显降低。3. 牙周炎吸烟组和牙周炎非吸烟组牙周基础治疗前后，临床指标（PLI、BI、PD、AL）的改善程度和GCF量及其中CRP浓度的变化存在着显著的不同。牙周炎吸烟组除了PLI变化较非吸烟组明显外，其他临床指标（BI、PD、AL）以及GCF量和其中CRP浓度的变化均明显低于非吸烟组。结论：1. 在牙周基础治疗前，牙周炎吸烟组PLI、PD以及AL明显高于牙周炎非吸烟组。结果表明：吸烟者菌斑堆积
6、量大于非吸烟者，牙周组织破坏程度也较非吸烟者严重。2. 在牙周基础治疗前，牙周炎吸烟组GCF的量以及GCF中CRP的浓度明显高于牙周炎非吸烟组。结果表明：吸烟牙周炎患者牙周炎症程度重于非吸烟牙周炎患者，这种炎症的加重与GCF中的CRP有关。3. 在牙周基础治疗后4周，吸烟组和非吸烟组PLI、BI、PD、AL、GCF的量以及GCF中CRP的浓度均较治疗前明显降低，但吸烟组降低的量小于非吸烟组。结果表明：无论是吸烟者，还是非吸烟者，牙周基础治疗均可明显改善其炎症状况；吸烟可能是牙周炎基础治疗的不利因素。关键词：吸烟，牙周炎，基础治疗，龈沟液， C反应蛋白AbstractThe impact of
7、smoking on C-reactive protein levels in the gingival crevicular fluid before and after initial treatment in periodontitisPeriodontitis is a chronic infection in periodontal support tissue caused by a variety of risk factors, chiefly when plaque micro-organisms settle in the cervical and gingival sul
8、cus. Although plaque is a periodontal disease initiating factor, the presence of plaque does not necessarily cause periodontal disease. Smoking is an major cause of many human diseases, and several lateral and longitudinal studies have confirmed that smoking is a risk factors for periodontitis, in p
9、articular for severe periodontitis. Gingival crevicular fluid contains a variety of ingredients derived from bacteria and human tissue. The amount of gingival crevicular fluid and the changes in its composition can be used as indicators to judge periodontitis clinical symptoms and prognosis. CRP, as
10、 an acute phase response proteins, plays a key role in the proinflammatory process. Therefore, CRP is drawing more and more scholars attention in recent years.Objective:1. Explore the impact of smoking on periodontal tissue destruction, by comparing of the PLI, BI, PD, AL of smoking and non-smoking
11、periodontitis patients before initial treatment.2. Explore the impact of smoking on GCF volume and CRP concentration in GCF in the periodontal disease status, by detecting the GCF volume and CRP levels in GCF before initial treatment.3. Explore the effect of periodontal initial treatment on smoking
12、and non-smoking periodontitis patients, and the effect of smoking on periodontal initial treatment, by comparing of the PLI, BI, PD, AL, GCF volume and CRP concentration in GCF of smoking and non-smoking periodontitis patients before and after initial treatment.Methods:1. Choice of cases: Randomly s
13、elected age, sex matched smokers and non-smokers 18 cases, treated in Stomatology Hospital of Jilin University in March 2011 to October 2011 and diagnosed with severe periodontitis.2. Sample collection and preservation: obtain gingival crevicular fluid by using absorbent paper point, and weigh with
14、an electronic balance. Store the gingival crevicular fluid in a -70 C temperature refrigerator.3. Inspect and record the clinical indicators: determine the amount of subjects plaque accumulation by using Silness & Le plaque index; observe the degree of bleeding gums by using Mazza sulcus bleeding in
15、dex scoring method; At the same time, detect subjects PD, AL in accordance with the standard of Periodontology (3rd edition).4. Detect CRP concentration in GCF: radioimmunoassay balance method will be used to determine CRP levels in the samples.5. Statistical analysis: All data obtained from the exp
16、eriment were analyzed by the Statistical Package SPSS13.0.Results:1. Before the initial periodontal therapy, the PLI, PD and AL of the smoking group were significantly higher than non-smoking group, while the smoking groups BI was lower than non-smoking group. After initial periodontal therapy over
17、4 weeks, the PLI, BI, PD, AL of the smoking and non-smoking groups were significantly reduced compared with pre-treatment.2. Before the initial periodontal therapy, GCF volume and CRP concentration in GCF of the smoking group was significantly higher than the non-smoking group. After initial periodo
18、ntal therapy 4 weeks, GCF volume and CRP concentration in GCF of the smoking group and non-smoking group were significantly lower than before treatment.3. Before and after the initial treatment, there were significantly differences in the changes of PLI, BI, PD, AL, GCF volume and CRP concentration
19、in GCF of the smoking and non-smoking periodontitis patients. The PLI change of the smoking group was more significant than that of the non-smoking group, but the changes of other clinical indicators were less significant than those for the non-smoking group.Conclusion:1. The amount of plaque accumu
20、lation in smokers is greater than non-smokers and the smokers periodontal tissue destruction was more serious than non-smokers. 2. The degree of periodontal disease of smokers are more serious than non-smokers, and that is related with CRP concentration in GCF.3. The initial periodontal therapy coul
21、d significantly improve the inflammatory condition for both smokers and non-smokers, and smoking may be unfavorable factors of the initial periodontal therapy in periodontitis.Keyword:Smoking, periodontitis, initial periodontal treatment, gingival crevicular fluid, C-reactive protein目 录第1章 绪 论11.1 吸
22、烟对牙周炎的影响11.1.1 吸烟与牙周炎相关性研究进展11.1.2 吸烟对牙周炎影响的机制21.2 龈沟液在牙周炎发病和诊断中的作用21.2.1 龈沟液在牙周炎发病过程中的作用21.2.2 龈沟液在牙周炎诊断中的作用31.3 CRP与牙周炎的相互关系31.4 立题意义4第2章 实验材料和方法62.1 实验材料62.1.1 主要仪器与设备62.1.2 试剂盒62.2研究对象62.2.1 牙周炎吸烟组62.2.2 牙周炎非吸烟组72.2.3 受试对象纳入标准72.2.4 受试对象排除标准72.3 治疗方法72.4 样本的采集和保存82.4.1 试管准备82.4.2 取样牙位准备82.4.3 取样
23、82.4.4 样品保存82.5 临床指标的检查和记录82.5.1 菌斑指数（PLI）82.5.2 出血指数（BI）92.5.3 探诊深度（PD）102.5.4 附着丧失（AL）102.6 龈沟液中CRP的检测102.6.1 CRP放射免疫试剂盒102.6.2 检测原理102.6.3 测定方法102.6.4 数值计算112.7 统计学处理12第3章 实验结果133.1 牙周基础治疗前后各项临床指标的比较133.2 牙周基础治疗前后GCF量的变化153.3 牙周基础治疗前后GCF中CRP水平的变化163.4 吸烟与非吸烟组治疗前后临床指标及CRP差值的比较17第4章 讨 论194.1 吸烟对牙周炎
24、临床指标的影响194.2 吸烟对牙周炎患者GCF量的影响204.3 吸烟对牙周炎患者GCF中CRP水平的影响214.4 吸烟对牙周炎基础治疗效果的影响22第5章 结 论25参考文献26作者简介及在攻读学位期间发表的学术论文及其他成果30致 谢31英文缩略词缩写英文全称中文全称AaActinobacillus actinomycetemcomitans伴放线放线杆菌PgPorphyromonas gingivalis牙龈卟啉单胞菌BfBcteroides forsythus福赛坦氏菌GCFgingival crevicular fluid龈沟液IL-1interleukin 1白细胞介素-1PG
25、E2prostaglandin E2前列腺素E2APPAcute phase protein急性期反应蛋白CRPC-reactive proteinC反应蛋白PLIplaque index菌斑指数BIbleeding index出血指数PDprobing depth探诊深度ALattachment loss附着丧失MCP-1monocyte chemoattractant protein-1单核细胞趋化蛋白-1MMP-1matrix metallo-proteinase-1基质金属蛋白酶-1MAPKmitogen-activated protein kinase促分裂原活化蛋白激酶OHIora
26、l hygiene instruction口腔卫生指导第1章 绪 论牙周炎是由多种牙周致病菌所引起的牙周支持组织慢性感染性疾病，定居在牙颈部及龈沟内的牙菌斑微生物为其主要的感染源。尽管牙菌斑为牙周病的始动因素，但是其单独存在并不一定能引起牙周病。牙周疾病的发生、发展以及预后与众多的全身危险因素有关。大量研究证实，吸烟是牙周炎发生和发展的重要危险因素1, 2，并可影响牙周手术治疗的远期疗效3。1.1 吸烟对牙周炎的影响吸烟是人类许多疾病的重要危险因子之一。研究表明，吸烟与许多心脑血管疾病及消化系统疾病有关，是慢性阻塞性肺病的主要病因。许多横向和纵向研究均证实，吸烟是牙周炎尤其是重度牙周炎的高危因
27、素。1.1.1 吸烟与牙周炎相关性研究进展在过去的几十年中，人们对吸烟与牙周病的关系做了大量的研究。吸烟作为牙周病的重要危险因素之一，其与牙周病的发病率、发展过程以及严重程度密切相关。已有的研究表明，吸烟者牙周炎的发病率高，病情重4。许多实验均证实，吸烟可影响牙周炎的发生和发展，随着吸烟量的增加牙周炎患者的附着丧失水平和根分叉病变的发生率均明显上升。吸烟除了影响牙周组织之外，还可导致口腔黏膜的过度角化和增生，被认为是口腔黏膜白斑和口腔癌发生的重要危险因素5,6。Tomar等7 在对美国第三次全国健康营养状况调查的数据分析后发现，成年人牙周病患者中，41.9%的患者与当前吸烟有关，而10.9%的
28、患者则与以前吸烟有关，其相对危险度(relative risk) 分别为：当前吸烟者3.97，以前吸烟者1.68。此外，牙周炎的患病率与吸烟剂量相关，每天吸烟在9支以下的受试者，其牙周炎的患病比值比（OR）为2.79，而每天吸烟31支以上的受试者，其OR值可增加到5.88。Haffajee等8研究发现，吸烟者的牙周袋深度、附着丧失水平及牙槽骨破坏程度都比非吸烟者更为严重。同时，吸烟者牙齿松动度明显增加，失牙率明显增高。1.1.2 吸烟对牙周炎影响的机制吸烟在牙周炎发病过程中的机制尚未完全明了，但是学者们普遍认为吸烟可影响局部的血液循环（小血管收缩）、体液免疫、细胞免疫和炎症过程，尤其可以削弱口
29、腔中性多形核白细胞的趋势和吞噬功能。有关吸烟对牙周炎影响的具体机制可概况为以下四点9：（1）吸烟不仅对中性多形核白细胞和单核吞噬细胞产生了直接的抑制作用，而且还明显减少了血清IgG、IgM和IgA的量；（2）吸烟可通过降低局部氧张力促进某些致病菌的生长，有研究显示，吸烟者龈下菌斑中伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)、福赛坦氏菌(Bcteroides forsythus, Bf)检出率明显增加；（3）长期吸烟者，牙面可有大量焦油沉积，形成烟斑，使牙面呈黄色、
30、褐色或黑色。大而厚的烟斑沉积物能够提供菌斑聚集的粗糙表面，继而在牙周组织炎症的发生和发展过程中产生促进作用；（4）吸烟能够抑制成纤维细胞的生长，并使之不易附着于根面，从而影响创口愈合；此外，吸烟还可以抑制成骨细胞的生长，导致骨质疏松和骨吸收。1.2 龈沟液在牙周炎发病和诊断中的作用龈沟液（gingival crevicular fluid, GCF）是指通过沟内上皮和结合上皮从牙龈结缔组织渗入到牙龈沟内的液体。有关龈沟液的研究最早可追溯到20世纪50年代，近年来的研究发现龈沟液在牙周炎发病和诊断过程中具有重要作用，已成为牙周病相关研究的基础。1.2.1 龈沟液在牙周炎发病过程中的作用正常情况下
31、，龈沟液对牙周组织具有较好的保护作用，可通过机械冲洗清除外来有害物质，同时其含有的血浆蛋白可促进牙龈上皮对牙面的附着。在牙龈防御机制中，龈沟液同时具有抗微生物的特异性抗体和促进抗体活化的补体成分，补体可以直接或与抗体结合而发挥杀菌作用，但也可通过趋化作用吸引更多的白细胞，使其释放溶酶体酶，进而造成组织损伤。补体介导的组织细胞溶解和肥大细胞脱颗粒也是引起组织损伤的重要机制之一。龈沟液中除了含有血浆蛋白和补体-抗体系统成分外，还含有较多的蛋白质、葡萄糖和酶等，因此能够给龈下细菌提供丰富的营养成分，从而促进细菌的生长繁殖。此外，龈沟液还能提供牙石矿化所需物质。龈沟液中含有的酶成分，如碱性磷酸酶、胶原
32、酶等也与牙周病的严重程度和活跃性存在一定的关系。牙周炎患者牙周结缔组织和龈沟液中的胶原酶较牙龈炎和健康者明显增高。1.2.2 龈沟液在牙周炎诊断中的作用在牙龈健康的情况下，龈沟液的量极少。龈沟液量的增多是牙龈炎症早期的主要表现之一，且早于其他牙周炎症的临床表征。牙龈炎症时，牙龈组织脆性增加，毛细血管通透性增加，进而导致龈沟液量的明显增多。此时的龈沟液并不是一种单纯的漏出液，而是一种炎症性渗出液。而且龈沟液的流出量，与该部位的炎症程度呈正相关。因此，龈沟液量的多少可作为判断牙龈炎症程度的一个较敏感的客观指标。由于龈沟液来自牙周组织，并通过龈沟向外流出。因此，可以通过分析龈沟液成分得到的早期生化指
33、征来说明牙周组织的变化。龈沟液内许多内容物的含量与牙龈组织的炎症有关，如白细胞介素-1（interleukin 1, IL-1）、多种酶和前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）等的水平随炎症加重而增高。在组织受到致病微生物、细菌毒素的刺激或损伤时，宿主细胞可产生IL-1，它是炎症反应过程中的主要介质之一。慢性牙周炎患者炎症牙龈中IL-1的水平较健康牙龈和单纯性牙龈炎明显增高，且在炎症活跃性部位其水平更高。前列腺素同样由多种宿主细胞合成，牙龈炎症时，其水平同样会明显增高。它能够扩张血管，引起骨吸收并影响胶原的合成。牙周炎患者龈沟液中的PGE2浓度显著高于牙龈炎患者，此外PG
34、E2在龈沟液中的水平大大超过血清，这说明龈沟液中的PGE2至少其中的一部分来自局部牙周组织。因此，通过对龈沟液中IL-1和PGE2的测定，可作为监测牙龈炎和牙周炎进展的有效而非侵入性方法。1.3 CRP与牙周炎的相互关系牙周感染可以引起血清急性期反应蛋白（Acute phase protein，APP）水平显著升高，C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）为目前研究最多的APP，主要由肝脏产生。由于CRP在致炎过程中的关键作用，因此越来越受到学者们的关注。CRP是非特异性免疫反应的穿透素家族成员，是反映机体炎症状态的一个可靠而敏感的指标10。它不仅能够在免疫反应中激活其他细胞
35、因子，而且还能直接参与白细胞聚集和血管壁细胞凋亡等炎症过程，从而促进疾病发展11。研究表明牙周炎患者的血清CRP水平较牙周健康者明显增高，此外慢性牙周炎患者病情的严重程度与血清CRP水平呈正相关12,13,14。Fredriksson等15对40例牙周炎患者和43例正常对照组进行了血细胞和急性期蛋白的检测，结果发现牙周炎患者外周血CRP水平比非牙周炎明显增高。牙周组织炎症时，在牙周袋内各种致病微生物长期的刺激下，宿主组织可不断的产生CRP，从而促进机体的炎症反应16。Slade等17分析发现：Pg感染与机体CRP水平呈明显的正相关。牙周炎患者血清CRP水平可在一定程度上反映牙周组织的炎症程度，
36、其水平可随临床附着丧失程度的加重而递增18。Doi等19研究发现：在将所有重度牙周炎患牙拔除后，其CRP水平可出现明显的降低。由此可见，牙周组织感染可导致CRP水平的升高，而CRP水平的增加又可反映牙周组织的炎症程度。1.4 立题意义吸烟是牙周炎重要的促进因素之一，大量的实验表明吸烟是牙周病尤其是重度牙周病的高危因素。与非吸烟者相比，吸烟者发生牙周炎的年龄更早，累及的牙数更多，波及的范围更广。同时吸烟的牙周炎患者牙周袋更深，附着丧失更重，病情发展速度更快，治疗起来也更加困难。而且吸烟量越大，牙周组织的破坏就越明显。目前有关吸烟对牙周炎发病和预后的影响仍有许多尚未解决的问题，仍需要我们做进一步的
37、研究。龈沟液中含有来源于细菌和人体组织的多种成分，龈沟液的量及其成分的变化可作为评估牙周炎临床症状和预后的指标。CRP作为一种急性相反应蛋白，其在致炎过程中发挥着关键作用。因此，近年来CRP越来越受到学者们的关注。CRP是非特异性免疫反应的穿透素家族成员，是反映机体炎症状态的一个可靠而敏感的指标。本研究通过比较牙周基础治疗前，吸烟与非吸烟中重度牙周炎患者菌斑指数（plaque index, PLI）、龈沟出血指数（bleeding index, BI）、探诊深度（probing depth, PD）、附着丧失（attachment loss, AL），以探讨吸烟对牙周组织破坏程度的影响；通过测
38、定牙周基础治疗前龈沟液（gingival crevicular fluid, GCF）的量及其CRP水平，以探讨吸烟对牙周炎症状态下GCF量和其中CRP浓度的影响；我们通过进一步比较牙周基础治疗前后吸烟与非吸烟中重度牙周炎患者PLI、BI、PD、AL以及GCF量和其中CRP浓度，以探讨牙周基础治疗对吸烟和非吸烟牙周炎患者治疗效果的影响，以及吸烟对牙周炎基础治疗效果的影响。第2章 实验材料和方法2.1 实验材料2.1.1 主要仪器与设备超声龈上洁治机瑞士EMS超声龈上洁治机超声龈下刮治机瑞士EMS超声龈下刮治机吸潮纸尖（Whatman型）英国Whatman公司电子天平德国SARTORIUS公司超
39、低温冰箱美国GENERAL公司0.5ml及1.5ml Eppendorf管德国EPPENDORF公司移液器日本NICHIRYO公司台式高速离心机美国Beckman公司125I计数器北京核仪器厂2.1.2 试剂盒125I-CRP放射免疫试剂盒北京原子高科股份有限公司2.2研究对象2.2.1 牙周炎吸烟组随机选取2011年3月至2011年10月就诊于吉林大学口腔医院牙周病科，被诊断为中重度牙周炎的吸烟者18人，其中男性16例，女性2例，年龄3055岁，平均41.72.3岁。2.2.2 牙周炎非吸烟组在同期来吉林大学口腔医院牙周病科就诊的中重度牙周炎患者中，随机选择与牙周炎吸烟组年龄、性别比例相匹配
40、（男性16例，女性2例）的牙周炎非吸烟患者18例，年龄3055岁，平均年龄42.5士2.6岁。2.2.3 受试对象纳入标准每位患者选取2颗牙齿作为受试牙，受试牙应满足：（1） 牙龈处于炎症状态，探诊出血；（2） 牙周袋的深度大于4mm；（3） 附着丧失超过2mm；（4） X线片显示牙槽骨吸收超过根长的1/3其中，对牙周炎吸烟患者的判断应依据WHO对吸烟人群的界定标准：每日吸烟量为10支以上，且持续吸烟在2年以上。2.2.4 受试对象排除标准（1） 口内天然牙少于20颗者；（2） 近6个月接受过牙周治疗者；（3） 近3个月内服用抗生素者；（4） 存在系统性疾病，传染病，肿瘤及其他慢性炎症者；2.
41、3 治疗方法首先对患者进行口腔卫生宣教，教育并指导患者自我控制菌斑的方法，如建立正确的刷牙方法和习惯，使用牙线、牙间隙刷等辅助工具保持口腔卫生等。在治疗开始之前，采集每位患者每颗受试牙的龈沟液样本，并进行相关临床指标的检测，作为治疗前牙周炎症程度和CRP水平的评价。两组患者均由同一个操作者行完善的超声波龈上洁治术和超声波龈下刮治术，两种治疗之间的间隔时间相同。要求受试者在观察期内不接受其它牙科治疗，不使用抗生素。治疗结束4周后复诊，再次采集同一受试牙的龈沟液样本，检查和记录受试牙同一部位的牙周临床指标，作为治疗后的评价。2.4 样本的采集和保存2.4.1 试管准备将144个1ml的Eppend
42、orf管置于高温高压下消毒，标号为1-72（治疗前）和1-72（治疗后）。将吸潮纸尖在无菌操作台上分装，每个EP管装4根，用电子天平称重并记录待用。2.4.2 取样牙位准备每位患者均选取2颗牙周袋大于4mm，且牙颈部无龋坏和充填体的患牙作为受试牙。用灭菌的洁治器械去除观察牙的龈上菌斑，以棉卷隔湿取样牙位，温空气轻吹受试牙10秒钟，以吹干受试牙面及周围牙龈粘膜。2.4.3 取样将吸潮纸尖轻轻插入牙周袋内，每课牙齿的颊舌侧各插入一根吸潮纸尖，至有轻微阻力为止。并将纸尖于牙周袋内留置1分钟后取出（若吸潮纸尖上有血则弃去重取）。2.4.4 样品保存取出吸潮纸尖后，置于上述准备好的Eppendorf管中
43、。并立即称重，密封，-70超低温冰箱，冷冻保存，待检。收集龈沟液之后所称量的重量减去收集龈沟液之前记录的重量，即为所收集的龈沟液的重量。按龈沟液的比重（约1mg/l）将龈沟液的量换算成体积（l）。2.5 临床指标的检查和记录2.5.1 菌斑指数（PLI）利用Silness&Le菌斑指数判断受试者菌斑堆积的量不需要菌斑显示剂，而且可采用目测加探查相结合的方法，比较适合于一般的临床检查或流行病学调查。本实验中采用Silness&Le标准将菌斑指数分为0、1、2、3四个等级，以判断吸烟和非吸烟受试者菌斑堆积的量（表2.1）。表2.1 Silness&Le菌斑指数记分方法Tab 2.1 Silness
44、 & Le plaque index scoring method记分标准临床表现0龈缘区无菌斑1龈缘区的牙面有薄的菌斑，但视诊不易见，若用探针尖的侧面可刮出菌斑2在龈缘或邻面可见中等量菌斑3龈沟内或龈缘区及邻面有大量软垢2.5.2 出血指数（BI）此指数是由Mazza于1981年提出，它分级更细，更为客观，适用于牙龈炎症较严重的人群，以观察其治疗前后的效果。在检查过程中，用钝头牙周探针轻轻探入龈沟或袋内，取出探针30秒后，观察牙龈有无出血以及出血程度，并根据出血程度将此指数分为0、1、2、3、4、5六级（表2.2）。表2.2 龈沟出血指数记分方法Tab 2.2 Sulcus bleeding
45、 index scoring method记分标准临床表现0牙龈健康，无炎症及出血1牙龈颜色有炎症性改变，探针不出血2探针后有点状出血3探针出血沿牙龈缘扩散4出血流满并溢出龈沟5自动出血2.5.3 探诊深度（PD）按照牙周病学（第3版）的标准检查，记录龈缘到袋底的距离，即为探诊深度，以毫米为单位。2.5.4 附着丧失（AL）按照牙周病学（第3版）的标准检查，将探诊深度减去釉牙骨质界至龈缘的距离，以毫米为单位。如有牙龈退缩，则是将探诊深度加上牙龈退缩的距离。为防止临床检查对龈沟液质和量的影响，临床指标的检测和记录均在完成龈沟液的采集后进行，均由本人完成。2.6 龈沟液中CRP的检测2.6.1 C
46、RP放射免疫试剂盒（1）CRP标准品7瓶，7瓶标准品的浓度分别为0g/m, 1g/m, 2g/m, 5g/m, 10g/m, 20g/m, 50g/ml，每瓶0.5ml。（2）125I-CRP 1瓶，每瓶11ml（红色）。（3）CRP 抗体1瓶，每瓶11ml。（4）温育液1瓶，每瓶45ml。（5）分离试剂（PR）1瓶，每瓶55ml。2.6.2 检测原理本试剂盒采用放射免疫平衡法测定样品中CRP的含量，先将标准品（或待检测的样品）、标记物和抗体按照操作程序依次加入试管中，使标记抗原和限量抗体发生竞争性结合，待反应平衡后，加入免疫分离剂，离心沉淀，使游离抗原与抗原抗体复合物分离，测量沉淀中放射性强度。2.6.3 测定方法（1）将样品从冰箱取出，室温静置半小时，每管加入100l生理盐水，待用。（2） 将保存在冰箱内的C反应蛋白放射免疫分析试剂取出，平衡至室温（20-25oC）。（3）将试管编号，按下表程序加样（单位l）： 表2.3 C反应蛋白放射免疫试剂盒加样顺序Tab 2.3 C-reactive protein radioimmunoassay kit plus sample order试 剂T管非特异NSB管“0”标准B0管标准管样品管“0”标准15050标准品50样品50125I-CRP100100100100100CRP抗体100100100分
