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1、应用超数排卵与胚胎冷冻技术保护马头山羊品种资源的研究张作仁，杨利国2，闻群英，熊金洲(执笔)，吴细波2，朱曾武3(1.湖北省十堰市畜牧局，湖北十堰442000；2.华中农业大学动物科技学院，湖北武汉430070；3.湖北省郧西县畜牧局，湖北郧西442600)摘要：马头山头具有生长快、繁殖率高、育肥性能好等特点，它与波尔山羊、努比山羊等良种山羊经济杂交、优势非常明显。随着市场经济的发展，马头山羊面临保种经费短缺，社会上无计划的引入其他品种山羊盲目杂交，致使马头山羊纯种数量减少，质量下降，马头山羊这一优良地方品种资源有被混杂灭绝的危险，良种保护迫在眉睫。本研究就是在马头山羊品种资源保护利用新技术中
2、试与示范这一国家科技部农业科技成果转化资金项目资助下试图通过马头山羊的超数排卵，胚胎冷冻，冷冻胚胎移植等技术的有机结合，构建马头山羊冷冻胚胎保种，为其胚胎移植的产业化、品种改良、新品系培育、遗传资源的保护利用等提供科学依据。关键词：马头山羊；超数排卵；胚胎冷冻；品种资源保护马头山羊是列入中国山羊品种志的优良地方品种，分布于湖北、湖南以及邻近四川、贵州的武陵山一带，陕西、河南、重庆、江苏、浙江、江西等十余个省市均有饲养，年饲养量约400万只，是国内山羊地方品种中生长速度较快、体型较大、肉用性能最好的品种。马头山羊在原产地的饲养历史已有千余年，郧西县是其核心产区。改革开放二十多年来，马头山羊的发展
3、得到了各级党委政府的高度重视，经过广大畜牧科技人员的长期不懈努力，先后多次开展品种资源普查和种质测定，不断理顺马头山羊的良种繁育体系，建立和完善选种选育方案和措施。1990年湖北省计委批准在郧西县投资218万元，建立了马头山羊种源基地，加大了品种选育力度和种群扩繁规模，使郧西县成为马头山羊品种繁育的核心产区。自上世纪九十年代开始，经湖北省质量技术监督局批准立项，由十堰市畜牧局、十堰市质量技术监督局共同承担，先后完成了马头山羊、马头山羊饲养与疫病防治技术规范等系列标准的研制工作，使种羊生产得到了进一步规范。马头山羊与波尔山头、努比山羊及其它品种良种山羊经济杂交，杂种优势非常明显。但是，由于马头山
4、羊过去一直是皮肉兼用型地方良种，尽管它与国内10多个地方品种比较具有生长快、个体大、肉质好、杂交亲和力强等特点，但与国际公认的肉用山羊波尔山羊比较，其生长速度远远赶不上，马头山羊纯种养殖与波马杂交一代羊生产相比，其比较效益较低，农民养羊有着强烈的杂交改良意识，不少地方已盲目引进外来良种山羊杂交改良本地马头山羊，这种无序杂交已严重冲击着马头山羊原始封闭的保种方式，马头山羊纯种繁育面临新的挑战。随着市场经济的发展，马头山羊作为优良地方品种，同样面临保种经费短缺，无计划地引入其它山羊品种盲目杂交，致使马头山羊品种资源有被混杂灭绝的危险，造成种群数量不断减少，质量不断降低，保种压力日益增大。因此，加大
5、马头山羊品种资源保护力度已势在必行。只有不断改革保种机制，丰富和发展保种理论，创新保种技术，才是保护好马头山羊品种资源的有效途径。2005年8月国家科技部下达了农业科技成果转化资金项目马头山羊品种资源保护利用新技术中试与示范。该项目是以前期已完成并制定的马头山羊、马头山羊饲养与疫病防治技术规范系列标准为核心技术，结合应用山羊超数排卵、胚胎冷冻保存、基因标识辅助选择、计算机辅助选择等高新技术，将保种与利用、育成杂交与经济杂交、开放式育种与封闭式育种进行科学结合，以此降低保种费用，提高保种效果，从而实现农民养羊效益的进一步提高。本试验旨在对应用超数排卵与胚胎冷冻保存技术保护马头山羊品种资源进行了比
6、较系统的研究，目的就是通过马头山羊的超数排卵、胚胎的冷冻、冷冻胚胎的移植等技术的有机结合，构建马头山羊冷冻胚胎保种库，实现马头山羊的胚胎冷冻保种，为其胚胎移植的产业化、品种改良、新品种（品系）的培育、遗传资源的保护利用等提供科学依据。1材料与方法1.1材料1.1.1试验羊供体羊为年龄1.53.5周岁，具有正常发情周期的，空怀马头山羊母羊。配种公羊为纯种马头公羊，健康、生殖机能正常。供体羊及配种公羊均由中国郧西马头山羊原种繁育中心提供，配种前一个月加强饲养管理，提高营养水平。受体羊为育成或经产的地方板角山羊及部分马头山羊，健康、生殖机能正常。1.1.2主要仪器和设备鼓风干燥箱（重庆银河试验仪器有
7、限公司）、电子分析天平（德国产）、超纯水仪（法国产）、手提式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司）、恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）、羊用手术床（自制）、常用手术器械（国产）、检卵杯（丹麦）、检卵针（自制）、培养皿（国产）、体视显微镜（北京泰克仪器有限公司）、0.25mL塑料细管（法国卡苏公司）、超净工作台（苏州市电压调节器厂）、倒置显微镜（日本biometra公司）、CO2培养箱（HeraCeII）、冷冻离心机（德国eppendorf公司）、梯度PCR仪（德国Biometra公司）、电泳槽（北京六一仪器厂）、稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）、紫外分析仪（北京市新科技术应用研究所）。1.1
8、.3试验药品CIDR，新西兰产，每支含孕酮0.3g；注射用垂体促卵泡素（FSH），宁波市激素制品有限公司生产，100IU/支，批号051101；注射用氯前列醇钠（PG-CI），宁波市激素制品有限公司生产，0.2mg/支，批号0600302；黄体酮注射液（孕酮P4），宁波市激素制品有限公司生产，20mg/支，批号060302；注射用促黄体素释放激素A3（LRH-A3），宁波市激素制品有限公司生产，25g/支，批号060602；速眠新注射液，陆醒宁3号注射液，军事医学科学院军事兽医研究所生产，1.5mL/支。1.1.4主要操作液解冻液：DPBS+1.0mol/L蔗糖；DPBS+0.5mol/L蔗糖
9、；胚胎培养液：M199+20%FCS（V/V）+5.9575g/LHePeS+0.11g/L丙酮酸钠+2.2g/LNaHCO3+100IU/青枚素+80IU/mL链枚素；1.2超数排卵与胚胎冷冻时间安排该项目实施自2005年8月至2007年底，超数排卵与胚胎冷冻试验时间相对集中在春秋两个季节进行。本文所用数据只是2006年秋季试验的部分数据。1.3方法1.3.1供体羊的超排处理将供体羊第一次埋植CIDR时间计为第1d，第11d更换一次CIDR，处理的第1619d注射FSH，2次/d，每次间隔12h，总剂量为220IU/只，第7次注射FSH的同时撤出CIDR，并肌注PG0.1mg/支，第20d开
10、始早晚用试情公羊进行试情。供体羊发情后，以本交或人工授精的方式配种，直至发情结束为止。于配种后第67d手术法子宫角采胚，胚胎鉴定分级后，进行冷冻保存。具体的日程安排见下表：马头山羊超数排卵日程表发情周期操作方法第1d第一次埋植CIDR第11d更换一次CIDR第16d7:00注射FSH30IU，19:00FSH30IU第17d7:00注射FSH25IU，19:00FSH25IU第18d7:00注射FSH20IU，19:00FSH20IU第19d7:00注射FSH15IU，撤出CIDR，注射PG0.1mL/只，19:00注射FSH15IU第20d试情，发情后配种，注射LH100IU，配种23次/d
11、，至止发情结束。第26d手术法子宫角冲胚1.3.2胚胎的采集供体羊术前24h停食，手术前12h停水。手术时，由专人按顺序将供体羊牵至手术室，注射速眠新注射液1.53mL进行麻醉，羊倒地后，术部进行备皮，然后将羊抬上手术架，尾高头低保定后，术部消毒。于腹中线两侧离乳头2.5左右处切开皮肤，由预定切口起点至终点一次切开，创口长46，切口深度一致，边缘平直整齐。切开皮下组织后钝性分离肌肉，用镊子提起腹膜，在提取部位作一切口，然后用手术剪将腹膜剪开。食指和中指伸入腹腔，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫角，并用二指夹持牵引至创口表面，缝一侧子宫角至该侧输卵管，在输卵管末端找到该侧卵巢，观察卵巢表面排卵点
12、和卵泡发育情况，并作详细记录。将子宫角暴露于创口表面后，用套有胶管的肠钳夹住子宫角分叉处，用注射器吸入预热的冲卵液，冲卵针头从子宫角尖端插入，当确认针头在管腔内进退通畅时，将胶管连接于注射器上，推注冲卵液。当子宫角稍稍膨胀时，将回收卵针头从肠钳钳夹基部的上方迅速扎入，冲卵液经胶管收集于集卵杯内，最后用注射器推注20mL空气。进针时避免损伤血管，推注冲卵液时力量和速度适中。冲卵结束将子宫及输卵管还于腹腔内，注入青链霉素溶液防止感染。术后肌注陆醒宁1.53mL，PG0.1mg/只。1.3.3胚胎检查与鉴定每只冲卵供体羊准备3个培养皿，写好编号，放入培养箱预热待用，冲卵液经硅胶管收集于集卵杯内，在2
13、025检胚室打开集卵杯阀门，将冲卵液排除，留下杯底约8mL冲卵液，倒入15mL离心管中，用6mL预热的冲卵液冲洗集卵杯，并倒入15mL离心管中。装有胚胎的15mL离心管放入37的水浴锅中静置10min，用长巴氏吸管吸取离心底部6mL冲卵液，冲卵液放入表面皿，置于体视显微镜下检查胚胎，当发现胚胎后，用吸卵管顶端清除卵外的粘液和杂质。吸管先吸入少许冲卵液，再吸入胚胎，在培养皿的不同位置，冲洗胚胎3次，然后将胚胎逐个移至另一个小型培养皿内，使一只供体羊的胚胎放在一个皿内。胚胎鉴定：在2040倍体视显微镜下观察受精卵的形态，分裂球的大小、均匀度、透明带的间隙、变性情况等，并做记录。经形态学鉴定合格的胚
14、胎可用作胚胎冷冻。1.3.4胚胎玻璃化细管法冷冻及解冻将待冷冻的胚胎在DPBS+10%EG（V/V）中平衡5mim，然后将胚胎转移至预先装好EFS40的0.25mL塑料细管中，用封口粉封口后投入液氮中保存。胚胎从接触到EFS40至投入液氮的时间在2530s之内。解冻时，将细管从液氮中取出，先在空气中停留810s，然后放入37的温水中，待细管中蔗糖端变得透明后，取出细管，拭去管壁上的水珠，剪掉细管的两端，用注射器将胚胎从细管中冲入含有解冻液的表面皿中，停留5mim后，将胚胎转移至DPBS液中，洗3遍后，进行体外发育培养或移植。1.3.5胚胎体外发育培养胚胎解冻后，经过3次洗涤，然后选择形态正常的
15、桑椹胚和部分扩张囊胚，利用显微操作仪，对透明带作轻微的机械穿刺，然后每23枚置于含500mL胚胎培养液的四孔板，并覆盖石蜡油，培养的条件为38.5、5%CO2饱和湿度，经2448h培养，观察并详细记录胚胎发育情况。1.3.6受体羊同期发情处理方法山羊诱导发情分为孕激素和前列腺素类控制同期发情两类方法。孕酮海棉栓法是一种常用的方法。海棉栓在灭菌生理盐水中浸湿后塞入阴道深处，第18d取出，在取出海棉栓的同时注射PMSG200-300IU，48h前后受体羊可表现发情。1.3.7冷冻胚胎的移植采用手术子宫角移植，受体羊术前空腹24h，仰卧于手术保定台上，手术部位及手术要求与供体羊相同。术部剃毛、清洗和
16、消毒后，盖以创布，于腹中线两侧离乳头2.5cm左右切口，用手指伸进腹腔，摸到子宫角，引至切口处，确定排卵侧黄体发育状况，用钝形针头在黄体侧子宫角扎孔，将移植顺子宫角方向插入宫腔，推入胚胎，随即子宫复位。切口部位缝合和消毒。1.3.8受体羊饲养管理术后受体羊单圈饲养，地面垫干净麦秸。术后继续注射青链霉素5d，2次/d。受体羊术后12个情期内要注意观察返情情况，若返情则应进行配种。对没有返情的羊应加强饲养管理，妊娠前应满足母羊对热量的摄取，防止胚胎因营养不良而引起早期死亡。在妊娠后期应保证母羊营养的全面需要，尤其是对蛋白质的需要，以满足胎儿的充分发育。受体羊产羔期需精心管理，做好助产，双羔羊哺乳及
17、保姆羊带乳，并要保证母羊哺乳期营养需要。1.3.9数据统计记录供体羊的黄体数、采胚数、可用胚及冷冻胚胎情况等。2试验结果2.1超数排卵及胚胎冷冻情况自2005年下半年国家科技部下达马头山羊品种资源保护利用新技术中试与示范项目的中试研究以来，马头山羊的超数排卵与冷冻胚胎技术研究与应用进展顺利，现已完成有效胚胎冷冻6300余枚，平均每只供体羊采集胚胎14枚，最高达26枚。2006年秋季马头山羊超数排卵与胚胎冷冻情况统计表批次时间试验羊采胚羊黄体数采胚数冻胚数第一批次2006.9.5-2006.9.303532465416395第二批次2006.10.10-2006.11.5504867867057
18、5第三批次2006.11.24-2006.12.196056791785674合计145136193419161644上表为2006年秋季马头山羊超数排与胚胎冷冻情况的部分统计数据。从表中数据显示，马头山羊供羊只平均数为14.08枚，只平冷冻胚胎数为12.08枚，冷冻胚胎保存率为85.80%。2.2胚胎体外发育培养情况2007年5月20日，用2006年秋季超排并冷冻保存的马头山羊不同批次的冷冻胚胎，在胚胎解冻后，用CO2培养箱进行体外发育培养，培养条件为：38.5、5%CO2饱和湿度，复苏率达100%，其中桑椹胚占60%。2.3冷冻胚胎移植情况2007年5月至10月，我们先后将2006年超数排
19、卵获得不同批次经细管玻璃化冷冻贮存的马头山羊胚胎，解冻后选择形态正常的桑椹胚分三批移植到100只受体羊体内，每只羊移植2枚冻胚，有31只受体羊妊娠，妊娠率达31%。3小结与讨论3.1本研究通过马头山羊的超数排卵、超排胚胎的冷冻，冷冻胚胎移植技术的有机结合，运用于生产实践，实现了马头山羊的胚胎冷冻保种，相对活体保种更加经济实用。同时，可有效规避重大动物疫病对马头山羊带来的危害和风险，使马头山羊优良地方品种得到有效的保护和永续利用，马头山羊原产地不再担心品种资源灭绝，也不必再划定保护区强调纯种繁育，广大养羊户可以利用优良肉用品种波尔山羊开展有计划经济杂交，促进农民养羊增收。3.2利用马头山羊同期发情、超数排卵、胚胎冷冻和冷冻胚胎移植技术应用于马头山羊品种资源的保护利用是一套系统生物工程，技术难度大，操作性强，目前该技术的运用仅处于起步阶段，超排及胚胎移植水平有待于提高，大面积推广应用还尚待一个过程。各级政府和省市业务主管部门，尤其是马头山羊原产地人民政府应将其列入重大科技成果项目加以推广应用，要给予一定的政策倾斜和资金扶持，广为宣传，加大力度，为加快马头山羊胚胎移植产业化发展，打下坚实的基础。3.3本研究未能就马头山羊冷冻胚胎保存年限，冷冻胚胎显微结构和遗传特性的影响等问题进行深入的研究，今后有必要对该领域进行更加深入的研究与探讨，使该技术的推广应用日趋完善。
