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1、 食品科学与工程专题课程论文 题 目超临界萃取、反相微胶团萃取和双水相萃取技术的原理及特点姓 名费鹏学 号2013309010006专 业食品科学评 分指导教师谢笔钧职 称教授中国武汉二一三 年 十二 月超临界流体萃取、反相微胶团萃取和双水相萃取技术的原理及特点摘要：超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction, SFE）、反相微胶团萃取（Reverse-phase Micellar Extraction, RME）和双水相萃取（aqueous two-phase extraction, ATPE）技术是近年来得到国内外广泛关注的分离提取新技术，特别适用于生物物
2、质的分离和提纯，目前已广泛应用于化工、轻工、医药、生物、环保、食品等诸多领域，并取得了很好的效果。本文对这3种技术进行了介绍，并综述其原理及特点。关键词：超临界萃取；反相微胶团萃取；双水相萃取Abstract: Supercritical Fluid Extraction (SFE), Reverse-phase Micellar Extraction, (RME) and aqueous two-phase extraction (ATPE）were new technologies of separation and extraction, which have attracted wid
3、e attention both at home and abroad and widely applied in chemical engineering, light engineering, medicine, biology, environmental protection, food industry and so on with great effects. In this paper, theories and characteristics of the 3 new technologies were introduced.Key words: SFE; RME; ATPE传
4、统的分离方法，如液-液萃取技术，具有操作连续、多级分离、放大容易和便于控制等优点，在化学、化工、石化等领域得到广泛应用，但随着基因工程蛋白质工程细胞培养工程代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种生化新产品不断涌现，但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求及其苛刻，使得传统的萃取技术已不能适应分离要求， 对能够满足现代科学发展的新分离提取技术的需求已迫不及待1-2。近年来，得到迅速发展并得到广泛应用的分离提取新方法主要有超临界萃取、反相微胶团萃取和双水相萃取技术等，其他一些如分子蒸馏等技术也受到广泛关注，但目前仍然被局限于实验室中。SFE利用在临界温度以
5、上的高压气体作为溶剂，分离、萃取、精制有机成分；RME利用表面活性剂在有机相中形成的反相微胶团（Reversed Micelles, RM），从而在有机相内形成分散的亲水微环境来分离蛋白质等生物分子；ATPE是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。1. 超临界萃取1.1 SFE概述SFE是一种较新型的萃取分离技术，其起源于20世纪70年代。过去，分离天然的有机成分一直沿用水蒸汽蒸馏法、压榨法、有机溶剂萃取法等。水蒸汽蒸馏法需要将原料加热，不适用于化学性质不稳定成分的提取；压榨法得率低；有机溶剂萃取法在去除溶剂时会造成产品质量下降或有机溶剂残留；SFE则有效地克服了传统分离方法
6、的不足，它利用在临界温度以上的高压气体作为溶剂，分离、萃取、精制有机成分。1869年Andrews首先发现物质具有临界现象，并测量出了CO2的临界压力与临界温度，如图1所示：纯净物质要根据温度和压力的不同，呈现出液体、气体固体等状态变化。在温度高于某一数值时，任何大的压力均不能使该纯物质由气相转化为液相，此时的温度即被称之为临界温度Tc；而在临界温度下，气体能被液化的最低压力称为临界压力Pc。在临界点附近，会出现流体的密度、粘度、溶解度、热容量、介电常数等所有流体的物性发生急剧变化的现象。当物质所处的温度高于临界温度，压力大于临界压力时，该物质处于超临界状态，成为超临界流体（Supercrit
7、ical fluid，SCF），其具有接近于液体的密度和类似于液体的溶解能力，同时还具有类似于气体的高扩散性、低粘度、低表面张力等特性3； 1882 年，Cagniard de la Tour 将液体封于炮筒中加热，发现敲击音响有不连续性，以后他在玻璃管中直接观察，首次在世界上作了有关超临界的报道。但SFE真正作为强溶解的萃取分离技术，是在近2030年的发展，1978年联邦德国建成了咖啡豆脱除咖啡因的超临界流体萃取工业化装置，是现代SFE技术开发的里程碑；同年在联邦德国Essen召开了首届国际超临界流体萃取技术专题会议，该技术才成为国际关注的新课题；20世纪80年代，超临界流体萃取技术得到了快
8、速发展，研究的范围进一步扩展，从过程原理、测试手段、基础数据及与之有关的超临界热力学、工艺学及高压设备等方面的研究相继展开。其应用范围涉及石油化工、食品、香料、医药、化工等多个方面；在中国，20世纪80年代SFE二氧化碳萃取技术更广泛的应用于香料的提取；进入90年代后，开始用于中草药的提取4。图1 CO2的温压图Fig. 1 The pressure-temperature phase diagram of CO21.1 SFE的原理是处于临界温度和临界压力以上的非凝缩性的高密度流体。超临界CO2流体萃取（SFE）分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与密度的关系，即利用压力和温度对超临界流
9、体溶解能力的影响而进行的5。流体处于超临界状态时，其密度接近于液体密度，并且随流体压力和温度的改变发生十分明显的变化，而溶质在超临界流体中的溶解度随超临界流体密度的增大而增大，如图2，3（图3为萘在CO2流体中的溶解度随压力变化曲线。当PPc时，萘的溶解度随压力增高迅速增大，当P=25MPa时，萘的溶解度可达70gL）所示。SFE正是利用这种性质，在较高压力下，在超临界状态下，将SCF与待分离的物质接触，将溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使超临界流体变成普通气体，被溶解的溶质因其密度下降、溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。所以SFE的过程是由萃取和分离过程
10、组合而成的，如图4所示6-7。图2 CO2压力与温度和密度的关系；图中直线为CO2密度Fig. 2 The The dependence of pressure and temperature on the density of CO2图3萘在CO2中的溶解度与压力的关系Fig. 3 The dependence of solubility of naphthalene in CO2 on CO2 pressure 分离原料萃取质循环萃取剂新鲜萃取剂萃取含萃取质的溶液萃取残质图4 SFE流程Fig. 4 The process of SFE1.2 SFE的特点 超临界流体技术在萃取和精馏过程中
11、，作为常规分离方法的替代，有许多优势特点，潜在的应用前景十分宽广8。 （1）萃取和分离合二为一。当饱含溶解物的二氧化碳超临界流体流经分离器时，由于压力下降使得CO2与萃取物迅速成为两相(气液分离)而立即分开，不存在物料的相变过程，不需回收溶剂，操作方便；不仅萃取效率高，而且能耗较少，节约成本。（2） 压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数。临界点附近，温度压力的微小变化都会引起CO2密度显著变化，从而引起待萃物的溶解度发生变化。可通过控制温度或压力的方法达到萃取目的。压力固定，改变温度可将物质分离；反之温度固定，降低压力使萃取物分离；因此工艺流程短、耗时少。对环境无污染，萃取流体可循环使用，真
12、正实现生产过程绿色化。（3）萃取温度低。最常用的SCFCO2的临界温度为31.16。临界压力为7.38MPa，可以有效地防止热敏性成分的氧化和逸散，完整保留生物活性，而且能把高沸点、低挥发度、易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来。（4）临界CO2流体常态下是气体，无毒，与萃取成分分离后，完全没有溶剂的残留，有效地避免了传统提取条件下溶剂毒性的残留。同时也防止了提取过程对人体的毒害和对环境的污染。（5）超临界流体的极性可以改变，一定温度条件下，只要改变压力或加入适宜的夹带剂，即可提取不同极性的物质，可选择范围广。 （6）但同时也存在需要成本较高的高压设备的问题。1.4 SCF的选择由于SCF在溶
13、解能力、传递能力和溶剂回收等方面具有特殊的优点，而且所用溶剂多为无毒气体，避免了常用有机溶剂的污染问题，目前得到十分广泛的应用但并非所有溶剂都适宜用作超临界萃取，超临界萃取对溶剂有以下要求：有较高的溶解能力且有一定的亲水亲油平衡；能容易地与溶质分离，无残留，不影响溶质品质；无毒，化学上为惰性，且稳定；来源丰富，价格便宜；纯度高。常用的SCF有二氧化碳、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷和氨等，常用萃取介质的临界条件如表1所示。其中，其中二氧化碳是最理想的溶剂，几乎目前所有的超临界萃取操作均以二氧化碳为溶剂，它几乎满足上述所有要求， 临界温度为31.4，接近于常温，对热敏性原料无破坏性。 临界压力为7.4M
14、Pa，容易达到。 化学性质稳定，不燃烧、不爆炸、无腐蚀性。 无色、无臭、无毒，符合食品和医药等行业无污染要求。 具有防氧化和抑制好气性微生物活动作用，分离过程中不易发生腐变。 容易得到较纯产品，来源方便，价格便宜。表1 常用流体的临界条件流体种类临界温度()临界压力(101.33 kPa) 临界密度(g/cm3)乙烷 -88.748.80.203丙烷-42.142.60.226丁烷10.038.00.228戊烷36.733.80.232乙烯9.951.20.227氨132.4112.80.236 二氧化碳31.173.80.460二氧化硫157.678.80.525水374.3221.10.3
15、26一氧化二氮36.571.70.451氟里昂28.839.00.578甲醇240.581.00.272物质在CO2中溶解度的大小决定着其能否通过超临界CO2萃取。除压力、温度对超临界流体溶解性有影响外，溶质性质，特别是分子量与极性，是影响超临界流体溶解性的决定性因素，它决定了该物质能否用超临界来萃取。Dandge测定了有机化合物在超临界CO2中的溶解度，结合前人研究，提出溶质分子结构与其溶解性的经验规律：烃类：12碳以下正烷烃能在超临界CO2中全部互溶，超过12个碳原子，溶解度将锐减。与正烷烃相比，异烷烃有更大的溶解度。醇类：6碳以下正醇能在超临界CO2中互溶，进一步增加碳原子数，溶解度将明
16、显下降。正醇中增加侧链可适当增加溶解度。酚类：苯酚溶解度3，当甲基取代苯酚时能增加溶解度。醚化的酚羟基将显著增加溶解度。羧酸：9碳以下脂肪酸能在超临界CO2中互溶，而十二烷酸(月桂酸)仅仅有1的溶解度。卤素、羟基和芳香基的存在会降低脂肪酸的溶解度。酯类：酯化将明显增加化合物在超临界CO2中的溶解度。醛类：简单的脂肪族醛类能在超临界CO2中互溶。脂肪族醛不饱和度对其溶解度没有明显影响，然而苯取代基将降低不饱和醛在超临界CO2中的溶解度。萜类（天然香料关键成分）：随萜烯类分子量的增加在超临界CO2中的溶解度逐步降低，萜烯分子每增加5个碳原子，溶解度下降5倍左右。与分子量影响相比，极性对其在超临界C
17、O2中的溶解度影响更大。随着萜类化合物中含氧取代基增多，萜类化合物极性增大，其在超临界CO2中的溶解度急剧下降。单萜化合物如樟脑、柠檬醛、香茅醇和1,8-萜二醇有不同的取代基和极性，尽管分子量差异不大，但溶解度差别很大。2. 反相微胶团萃取2.1 RME概述2.1.1 RME的发展传统的分离方法，如液-液萃取技术，具有操作连续、多级分离、放大容易和便于控制等优点，在化学、化工、石化等领域得到广泛应用，但如蛋白质类成分大多不溶于有机溶剂,而且与有机溶剂接触后会引起蛋白质的变性和失活，故无法直接应用有机溶剂液-液萃取等传统分离手段，其他盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析，疏水层析、亲和层析和电泳
18、等手段则存在连续操作和规模化较困难，从而影响这些方法产业化推广。因此，寻找高效且保持蛋白质高活性分离方法是人们长期探索目标，RME便是在这一背景下发展起来的。RME的研究始于20世纪70年代，瑞典伦德大学Albertsson 在1977年首先提出。RME是一种发展中的生物分离技术，其本质仍是液-液有机溶剂萃取，但与一般有机溶剂萃取所不同的是，反胶团萃取利用表面活性剂在有机相中形成的反相微胶团（Reversed Micelles, RM），从而在有机相内形成分散的亲水微环境，使生物分子在有机相（萃取相）内存在于反胶团的亲水微环境中，消除了生物分子特别是蛋白质类生物活性物质难于溶解在有机相中或在有
19、机相中发生不可逆变性的现象9。其研究的历史较短，技术尚不成熟。2.1.2 RM的形成表面活性剂的表面活性源于其分子的两亲结构，亲水基团使分子有进入水中的趋势，而憎水基团则竭力阻止其在水中溶解而从水的内部向外迁移，有逃逸水相的倾向。这两种倾向平衡的结果使表面活性剂在水表富集，亲水基伸向水中，憎水基伸向空气，其结果是水表面好像被一层非极性的碳氢链所覆盖，从而导致水的表面张力下降。随着表面活性剂浓度增加到一定程度，这个浓度称为临界胶束浓度(critical micelle concentration, CMC)，表面活性剂分子发生缔合并转入溶液中，但因其亲油基团的存在，水分子与表面活性剂分子相互间的
20、排斥力远大于吸引力，导致表面活性剂分子自身依赖范德华力相互聚集，形成亲油基向内，亲水基向外，在水中稳定分散，大小在胶体级别的粒子，通常称为微胶团，如图5所示。此时溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。微胶团形成均是表面活性剂分子自发形成的纳米尺度的聚集体，是热力学稳定体系10。图5 微胶团示意图 Fig. 5 Sketch map of micelles若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，当其浓度超过 (CMC)时，也会在在有机溶剂内形成微胶团，但在这种聚集体中，表面活性剂的憎水的非极性尾向外，与在水相中所形成的胶团反相，故称为反相微胶团。 图6 反相微胶团示意图Fig. 6 Sk
21、etch map of reversed micelles2.2 RME的基本原理2.2.1 基本原理反微胶团是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成的聚集体。其中, 表面活性剂分子的亲水基向内、非极性的疏水基朝外, 形成球状的极性核, 核内溶解一定数量的水后，形成了宏观上透明均一的热力学稳定的微乳状液, 微观上恰似纳米级大小的微型水池。当含有此种反微胶团的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质、核酸、氨基酸等生物活性成分及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”，使其与周围的有机溶剂隔离, 从而避免蛋白质、氨基酸等的失活。反胶团的内核可以不断溶解某些极性物质, 而且还可以溶解一些原来不能溶解
22、的物质, 因此具有二次增溶作用。通过改变操作条件，又可使溶解于水池中的蛋白质、核酸等转移到水相中，这样就实现了不同性质蛋白质间的分离或浓缩。在RM的形成过程中，其大小含水率(W0)的一个重要参数，即“水池”中溶入的水与表面活性剂的摩尔比，其直接影响反胶团的大小和RM内微水相的物理化学性质。当W0较小时，水池中的水与表面活性剂发生水合化，粘度大、 流动性差, 而且形成反胶团的半径较小，不适合萃取蛋白质；只有W0较大时，才存在自由水。含反胶团的有机溶剂与蛋白质水溶液接触时，反胶团依靠静电相互作用或疏水相互作用使蛋白质进入“水池”中，水和表面活性剂分子在蛋白质周围形成一个保护层，避免蛋白质等和有机溶
23、剂接触导致的失活；但当 W0太大时, 微水相就会与水相的粘度相当, 而且反胶团的半径也会很大，反胶团就不稳定, 容易破碎。同时，含水率也会影响被萃取物质的活性。在姚传义的研究中7，检测了脂肪酶在不同 W0 时的活性。结果发现，脂肪酶活性随水含率的增大呈钟形曲线。在W0为10时脂肪酶的活性达到最大，随着W0 的增大或减小, 脂肪酶的活性依次降低。这可能是由于 W0 取最适值时，反胶团内腔尺寸与酶分子大小一致, 因此酶活最高。此外，也可能是此时酶在反胶团界面处呈现酶活最高的构像11。2.2.2 蛋白质进入RM溶液的途径目前, 关于蛋白质进入RM溶液的途径，一般认为这是一个协同过程。在有机溶剂相和水
24、相两宏观相界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形，接着两界面形成含有蛋白质的RM，然后扩散到有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。然后改变水相条件 (如pH值、离子种类或离子强度 ) ,又可使蛋白质从有机相中返回到水相中，实现反萃取过程。 其推动力主要有： 静电作用：理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中。 空间相互作用：盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, 含水率W0随盐浓度的增大而降低，反胶团直径减小，空间排阻作用增大, 蛋白质溶解下降。 疏水性相互作用：氨基酸的疏水性各不相同, 研究
25、表明, 氨基酸或肽的溶解度随氨基酸疏水性的增大而增大。蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式，因而影响其分配系数。疏水性较大的pro可能以“半岛式”形式溶解。2.2.3 RM溶解于蛋白质的形式目前RM溶解于蛋白质的形式有4种模型，如图7所示 ：(a) “水壳”模型: 蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与RM壁（表面活性剂隔开），这是目前普遍认同的模型。(b) 蛋白质分子表面存在强烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触(c) 蛋白质吸附于反胶团内壁。(d) 蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。图7 蛋白质在RM中溶解的4种模型Fig. 7
26、The 4 models of pretein dissolving in RM 2.3 RME的特点及理论研究进展2.3.1 RME的特点 其萃取率和选择性很高； 分离浓缩可同时进行； 解决蛋白质、胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题； 破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白； 成本低。2.3.2热力学研究根据热力学基本理论，蛋白质从水相萃入反胶团相中达到平衡状态时所对应的系统的Gibbs自由能变化应为最小。由于对引起蛋白质萃取前后系统自由能变化的认识不同，从而有不同的热力学模型。Bratko等12采用所谓的“壳-核”模型研究蛋白质萃取过程的热力学，假设反胶团为球形，反胶团内表面光滑且电荷沿内表面均
27、匀分布。考虑了静电作用及蛋白质由水相进入反胶团相中的理想混合引起的自由能变化。其中静电作用自由能一项通过分别求解未萃人蛋白质前的“空”反胶团与含蛋白质的“实”反胶团及水相蛋白质胶体溶液Poisson-Boltzmann方程获得。该模型的缺点是假设“空”和“实”的反胶团具有相同的大小，且不随离子强度及pH 的变化而改变。但是许多实验表明，正是反胶团的大小随离子强度等的变化才导致了蛋白质分配平衡特性的改变。Beuno等13提出了一个简化的热力学模型来预测“空”和“实”的反胶团的大小。该模型假设系统的自由能的贡献主要来自于蛋白质和反胶团的内表面的静电作用及由蛋白质进入反胶团中引起的反胶团体积变化而致
28、的熵变及自由离子的重新分配引起的熵变。根据该模型能够较好的解释离子强度及pH对萃取过程的影响，但模型中用到的一些特性参数目前无法获得。Rahaman等14也提出了一个热力学模型，研究了萃人蛋白质前后反胶团的大小与离子强度，蛋白质的净电荷及尺寸，蛋白质的浓度及含水量等因素的关系。模型假设系统的自由能变化由三部分组成：蛋白质与表面活性剂及表面活性剂与表面活性剂之间的静电作用；“空”和“实”的反胶团在有机介质的理想混合；相邻的表面活性剂尾部的空间相互作用。根据该模型，反胶团在萃入蛋白质前后其体积可能变大或变小，这要根据二者间的相互作用情况而定。反胶团内部及蛋白质与反胶团间的静电作用是使蛋白质溶解的主
29、要推动力；由于处于反胶团中的蛋白质的屏蔽作用可有效地降低静电作用自由能，从而使带有与反胶团内表面同种电荷的蛋白质也有可能被溶入反胶团中。以上这些热力学模型都是在假设反胶团呈球形，每个反胶团内只能包埋一个蛋白质分子的前提下推导的。由于反胶团的细微结构及蛋白质与反胶团间相互作用的复杂性，至今为止，还没有一个一致公认的较为准确的热力学模型。根据现有模型，只能对蛋白质的萃取/反萃过程的行为给予定性的或半定量的预测。2.3.3 动力学研究Dekker等15以三辛基甲基氯化铵(TOMAC)/异辛烷反胶团体系反萃取-淀粉酶为例，研究了反胶团萃 反萃取蛋白质过程的动力学。结果表明，蛋白质的萃取与反萃取过程的动
30、力学有非常显著的差异；水相pH值和离子强度的变化都会影响萃取和反萃取过程的速率，相对而言，对萃取过程的影响更为强烈；萃取速率一般要比反萃取速率大好几个数量级。在萃取过程中，传质阻力主要集中在靠近油一水界面的水相边界层，界面阻力通常可以忽略。而在反萃取过程中，传质阻力主要集中在油水界面上。他们推测，反胶团在界面的凝结过程可能是反萃取过程的速率控制步骤，也包含着蛋白质与其周围的表面活性剂带电层的静电作用对于凝结过程有强烈的影响这样一个观点。2.3.4 平衡模型根据反胶团萃取机理和萃取过程特性，做如下假设： 蛋白质与盐离子均不溶于有机溶剂，表面活性剂存在于有机相中反胶团的界面处； 反胶团微水相与主体
31、水相性质相同； 蛋白质的存在对盐离子的分配平衡没有显著影响，可以忽略； 反胶团浓度足够大，蛋白质分配平衡呈线性(分配系数为常数)，一个反胶团至多包含一个蛋白质分子16。目前所见的萃取热力学模型多采用上述假设，因为这些假设基本与实际过程相符，并且利用这些假设既可简化模型的处理过程，同时对计算结果不产生明显影响。若蛋白质分子从水相转移到反胶团相所需能量为 ，则平衡时的分配系数为根据假设(2)，蛋白质在主体水相和反胶团微水相中的能量相同，故 代表蛋白质在水相和有机相中与反胶团之间相互作用能的差又由于水相不含反胶团，故 即为有机相中蛋白质与反胶团之间相互作用能当该相互作用能为零时，式(1)简化为如下形
32、式此时蛋白质的相转移只是熵增效应的结果。反胶团与蛋白质的相互作用包括静电作用和疏水性作用，所以以下对静电相互作用能 和疏水性相互作用能e 和疏水性相互作用h分别加以阐述。（一）静电相互作用能e为了表达静电相互作用能，需引入Stern紧密双电层理论。由于AOT的存在，反胶团内界面带有负电荷，热力学电势为0 。水溶液中的异电离子受到带电界面静电力、van der Waals力及其他形式的吸引力作用，从而吸附在此界面上吸附离子后，反胶团内界面的电势为s ，称为Stern电势。由于异电离子所带电荷部分抵消了反胶团内界面上的电荷，使电势在Stem层内急剧下降，故在数值上小于0 。因为AOT不溶解在水溶液
33、中，所以主体水相中的电势为零，两相的电势差即为s 。根据静电学理论，有下式Stern双电层中存在3个电荷密度：反胶团内界面电荷密度0，Stern层内电荷密度1和扩散层内电荷密度2 。根据电中性原理将这3个电荷密度的表达式代人式(6)，得到利用式(7)可计算电势s ，将s代人式(5)中则可计算静电相互作用能及其对蛋白质分配平衡的贡献。（二）疏水性相互作用能在pH值等于蛋白质等电点的溶液中，蛋白质的净电荷数为零，静电相互作用能e为零，根据式(4)，有借鉴双水相萃取研究中描述疏水性相互作用的方法，疏水性相互作用能可用下式表示混合反胶团中包含AOT和PNE4两种表面活性剂，它们的疏水性因子不同。因此，
34、反胶团的疏水性因子HF表示为将式(9)和式(10)代人式(8)，得式(11)即为疏水性相互作用能模型将式(5)和式(11)代人式(4)得到蛋白质分配平衡模型方程该分配平衡模型中，各疏水性因子HFAOT，HFpNE4和HFS以及吸附能式(7)需实验确定。其他模型参数可从文献中获得(表2)。表2 相关模型参数3. 双水相萃取技术（aqueous two-phase extraction, ATPE）3.1 ATPE概述 ATPE是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术，由于双水相萃取分离过程条件温和可调节因素多易于放大和操作并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验不存在有机溶剂残留问题
35、，特别适用于生物物质的分离和提纯。把两种或两种以上具有一定浓度的亲水性聚合物溶液混合后静置，这些亲水性的高分子聚合物并不混为一相，而是分成多个液相，这种现象称之为聚合物的不相容性。由于这些聚合物都是以水作为溶剂，因此形成上述的两个相体系就称为双水相体系。利用双水相的成相现象及待分离组分在两相间分配系数的差异，进行组分分离和提纯的技术就叫做ATPE。ATPE技术起源于19世纪90年代，真正应用是在20世纪50年代。Beijeronck在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象；1956 年瑞典伦德大学的Albertsson将双水相体系成功用于分离叶绿素，这解决了蛋白质
36、变性和沉淀的问题17；Kula教授研究小组对双水相的应用、工艺流程、操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研究，在应用上获得成功，并于1978年首先将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工业装置，达到20kg/h的处理能力，分离纯化了几十种酶，也应用于基因工程产品的分离18。迄今为止，ATPE被成功应用于生物医药工程，天然产物分离纯化，金属离子分离等方面19-21。因其广泛的应用性，已经发展成为一种相对成熟的技术，但仍有很大潜在的价值等待去开发。3.2 ATPE的基本原理3.2.1 双水相系统的形成将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互
37、不相溶的两相，这就是双水相体系。这种含有不同聚合物分子的溶液发生分相的现象叫聚合物的不相容性。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。两种聚合物混合是否形成双水相，取决于两种因素：一为体系熵的增加；二为分子间作用力。熵的增加与分子数量有关，与分子大小无关。当分子的物质的量相同时，大分子与小分子间的混合，熵的增加是相同的；分子间的作用力看做分子中各基团间相互作用力之和，分子量越大，分子间的作用力也越大，故大分子间的混合，分子间的作用力与熵相比占据主导地位，决定混合效果。一种聚合物分子的周
38、围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相，表2为研究最多的几种典型双水相系统表2 研究最多的几种典型双水相系统A聚丙二醇(PPG)聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚蔗糖(Ficoll)羟丙基葡聚糖聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇(PVA)葡聚糖(Dex)聚乙烯吡咯烷酮B硫酸葡聚糖酸钠羧甲基葡聚糖酸钠聚丙烯乙二醇甲基纤维素C羧甲基葡聚糖酸钠羧甲基纤维素钠盐D聚乙二醇硫酸钾，硫酸铵，硫酸钠，硫酸镁，磷酸盐酒石酸钠琥珀酸钠，柠檬酸纳E聚乙二醇葡聚糖乙二醇单丁酯丙醇A：两者均为非离子性聚合物；B：一种非离子性聚合物，另一种为带电荷的聚电解质；C：两者均
39、为聚电解质；D：一种聚合物，另一种为盐；E：一种聚合物，另一种为有机小分子。3.2.2 ATPE的原理ATPE与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同，当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同分配系数K等于物质在两相的浓度比，各种物质的K值不同（例如各种类型的细胞粒子噬菌体等分配系数都大于100或小于0.01，酶蛋白质等生物大分子的分配系数大致在0.1-10之间，而小分子盐的分配系数在1.0左右），因而双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。物质的分配规律服从Ne
40、rnst分配定律，即K=ct/cb，式中ct，cb分别代表上相、下相中的溶质（分子或粒子）的浓度。研究表明，在相体系固定时，预分离物质在相当大的浓度范围内，分配系数K为常数，与溶质的浓度无关，只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系的性质22。根据两相平衡时化学位相等的原则，从Brownstedt方程式求得分配系数K： （13）式中M物质分子量；系统的表面特性系数；k波尔兹曼常数；T温度；水溶性两相的形成条件和定量关系常用相图来表示，以PEG/ Dextran体系的相图（图8）为例，这两种聚合物都能与水无限混合，当它们的组成在图8曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组
41、成和密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B表示C为临界点，曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线，结线上方是两相区，下方是单相区所有组成在系统上的点，分成两相后，其上下相组成分别为T和BM点时两相T和B的量之间的关系服从杠杆定律，即T和B相重量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。图8 PEG/ Dextran体系的相图Fig. 8 Phase diagram of PEG/Dextran但在实际单元操作中，由于无法固定整个双水相体系，也很难确切地知道被分离的原液含有多少其他物质，这些因素共同作用和影响，使整个体系变得相当复杂，因而目前尚没有定量的关联模型能预测整个体
42、系的分配关系。最佳的操作条件须依靠实验得到。3.3 ATPE的特点23-24 整个体系的含水量高萃取是在接近生物物质生理环境的条件下进行，故而不会引起生物活性物质失活或变性； 单级分离提纯效率高。通过选择适当的双水相体系一般可获得较大的分配系数，也可调节被分离组分在两相中的分配系数，使目标产物有较高的收率； 传质速率快分相时间短。双水相体系中，两相的含水量一般都在80%左右，界面张力远低于水-有机溶剂两相体系，故传质过程和平衡过程快速； 操作条件温和，所需设备简单。整个操作过程在室温下进行，相分离过程非常温和，分相时间短。大量杂质能与所有固体物质一起去掉大大，简化分离操作过程； 过程易于放大和
43、进行连续化操作。双水相萃取易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低，易于与后续提纯工序直接相连接，无需进行特殊处理，这对于工业生产来说尤其有利； 不存在有机溶剂残留问题。高聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体无害； 但ATPE成本较高，虽然ATPE处理容量大能耗低，主要成本消耗在聚合物的使用上，而聚合物可以循环使用，不过聚合物却很难回收。 双水相系统含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会带到产物中，去除需要辅助处理方法。 选择性较低，分离纯化倍数低，一般只适用于粗分离。4. 结语目前，SFE、RME和ATPE技术已被研究用于众多生物产品的分离提纯并显示出众多其他传统分离技术不具备的优
44、点，是应用前景广阔的新型生物分离技术，但是也要同时看到这些方法在某种程度上的局限性，要将这一技术开发应用到大规模生产过程，还有许多理论和实践方面的技术问题有待解决，如SFE设备一次性投资较大，操作成本比传统的水汽蒸馏法和有机溶剂萃取法高, 萃取釜无法连续操作，造成装置的时空产率比较低等；RME中反相胶团的微结构与蛋白质萃取的选择性之间的规律、蛋白质与表面活性剂的相互作用、萃取机理等尚需进一步的探讨；聚合物/聚合物构成的双水相体系具有良好的分离性能 但用于构造双水相体系的成相聚合物的价格都比较昂贵对于一般的生物产品分离成本过高从经济上是不合理的。随着生物技术的发展，必将促进SFE、RME和ATP
45、E体系的完善包括新萃取体系的开发、工艺优化、萃取剂回收、体系分相技术、萃取设备和基础理论研究等，从而更显示出这3种分离技术在生物物质分离的独特优点。参考文献1 徐长波, 王巍杰. 双水相萃取技术研究进展J. 化学中间体, 2009, (03), 14-18.2 廖传华, 黄振仁. 超临界CO2 流体萃取技术M. 北京: 化学工业出版社, 20043 方立. 超临界萃取技术及其应用. 化学推进剂与高分子材料, 2009, 7(4), 34-36.4 陈岚. 超临界萃取技术及其应用研究. 医药工程设计, 2006, 27(3), 65-68.5 周强, 张富新. 超临界萃取技术及其在食品工业中的应
46、用进展, 现代生物医学进展, 2006, 6(5), 49-51.6 丁一刚, 霍旭明. 超临界流体的技术与应用. 医药工程设计, 2002, 23(4): 1-4.7 郝常明, 黄雪菊. 浅谈超临界流体萃取技术及其应用. 医药工程设计，2003, 24(2): 1-4.8 陈文伟, 王震宙. 超临界萃取技术的应用研究进展. 西部粮油科技, 2003(6), 38-40.9 赵喜红, 何小维, 杨连生, 王继华, 彭运平. 反胶团萃取蛋白质研究进展, 2009, 30(2): 326-329.10 沈忠耀. 表面活性剂在生物工程中的应用之反胶团萃取. 日用化学工业, 2001, 1: 24-2711 彭运平, 何小维. 生物物质的分离新技术-反胶团萃取, 生物技术报, 2003, 6:37-41.12 Bratko D, Luzar A, Chen SH. Electrostatic model for protein/reve
