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1、壳寡糖对铁皮石斛原球茎生长及多糖含量的影响 【摘要】以铁皮石斛原球茎为原材料，通过在含不同浓度壳寡糖的培养基中培养后，研究壳寡糖对铁皮石斛的原球茎增殖及其多糖含量的影响。结果表明在较低的壳寡糖浓度下，壳寡糖促进铁皮石斛多糖的含量的积累，则高浓度则抑制其多糖的增加。实验中，铁皮石斛的生长量随着壳寡糖浓度的升高而减少，在0.1mg/L的壳寡糖浓度下，其多糖含量最高达30.84%，超过0.1mg/L则多糖含量减少。【关键词】铁皮石斛；原球茎；壳寡糖；苯酚-硫酸法；多糖含量 铁皮石斛Dendrobium candidum Wall.ex Lindl 为兰科石斛属植物，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等
2、功能，用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明，是我国重要的出口药材之一。铁皮石斛主要成份是多糖，还含有少量的单糖，生物碱，氨基酸，酚类，挥发油等1-2。由于目前资源，价格昂贵，有许多的人已经开始了人工繁殖。历史上，已经有许多人对铁皮石斛多糖含量进行过测定，如黄民权从愈伤组织中提取多糖3。铁皮石斛有三种多糖，它们为一类O一乙酰葡萄甘露聚糖铁皮石斛多糖的药理作用广泛，主要有增强免疫力、抗肿瘤、降血糖等作用4。壳寡糖用大、生物活性高的低分子量产品，较壳聚糖具有更高的溶解度、更容易被生物体吸收等功能 5。壳寡糖可作为植物生长调节剂，增强植物对病虫害的防御能力6，促进次生代谢产物的积累,具
3、有杀菌菌活性（抗菌、抑菌）7，提高杀虫活性与趋避活性8等。本研究主要探讨在铁皮石斛原球茎组培过程中壳寡糖对原球茎生长以及多糖含量的影响，为石斛生物制药生产和积累次生代谢产物的配方优化提供依据。1 材料与仪器1.1 材料铁皮石斛原球茎：由组培室提供培养；壳寡糖：购于浙江金壳生物化学有限公司，产品批号为D120510097，分子量为100万；6-BA、NAA：国药集团化学试剂有限公司；石油醚、无水乙醇、丙酮、乙醇（95、80）、0.1活性炭、苯酚、铝片、NaHCO3、葡萄糖、浓硫酸1.2 仪器 无菌培养室，超净工作台，高压灭菌锅，培养瓶，培养皿，解剖刀及镊子，滤纸，容量瓶，移液管，烧杯，量筒，电子
4、天平，剪刀，棉线，报纸、索式提取器、蒸馏装置(蒸馏瓶、温度计、冷凝管、接收器）、容量瓶、移液管、漏斗、滤纸、水浴锅；紫外-可见分光光度计：福州精科仪器公司（日本岛津）UV-17502、方法2.1 铁皮石斛的培养 接种前，先将培养瓶称重，记录其重量。后将铁皮石斛原球茎分别接入含不同浓度壳寡糖的培养基中（表1），每个培养基接34个小原球茎，接20瓶。接种后，将培养瓶再次称量，算出接入铁皮石斛的接种量。40天后，取出铁皮石斛再次称量，比较不同浓度的壳寡糖对铁皮石斛原球茎生长的影响。表1 培养基的配方编号基本培养基6-BA(mg/L)NAA(mg/L)壳寡糖浓度(mg/L)12345MSMSMSMSM
5、S2.02.02.02.02.00.50.50.50.50.500.11.0101002.2 铁皮石斛多糖含量的比较 采用苯酚-硫酸法9测定多糖含量。2.2.1 对照品溶液的制备精密称取105 干燥至恒重的葡萄糖100mg，用蒸馏水溶解并定容到100mL。2.2.2 多糖提取取干燥样品，精密称定适量，经石油醚回流脱脂约1 h，过滤，挥去石油醚，以80乙醇回流提取1 h，乘热过滤，将滤渣加水回流提取1 h，乘热过滤，滤液浓缩，加入0.1活性炭脱色，过滤，加入95乙醇使溶液含醇80，静置过夜，过滤，以无水乙醇、丙酮依次洗涤8次，所得多糖于60烘干备用。2.2.3 苯酚溶液的配制5 %苯酚试剂的配制
6、：取苯酚100 g，加铝片01 g和NaHCO3 0.05 g，蒸馏，收集172182馏分，称取2.5 g，加水50 mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。2.2.4 测定波长的选择精密量取葡萄糖对照品溶液10mL、样品溶液1.0mL，各加新配制的5 苯酚液1.0mL，混匀，迅速滴加浓硫酸5mL，摇匀，置40水浴中放置15min，取出，冷却至室温。另取1.0mL蒸馏水同法平行操作作为空白对照，根据紫外-可见分光光度法10，于600400nm范围内扫描其吸收曲线。2.2.5 标准曲线制作精密称取干燥至恒重的葡萄糖50mg置烧杯中溶解后，于50ml容量瓶中定容，加蒸馏水适量使溶解，稀释至刻度，摇匀。精密
7、量取5 ml溶液置50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，为标准品溶液。精密量取标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分别置试管中，各加蒸馏水至20 ml，再加5%苯酚试液10 ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 ml，迅速摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出，冷水迅速冷却至室温，以蒸馏水作为空白对照。于2.2.4中测出的波长处测定吸光度，然后绘制标准曲线。2.2.6 石斛多糖与葡萄糖换算因素的确定精密称取干燥至恒重的多糖样品25 mg，置于25 ml容量瓶，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，作贮备液。精密吸取该贮备液1.0ml按标准曲线项下操作。求得的回归方程，算出
8、对应浓度，再按下式计算换算因素：f=多糖重量/多糖液的葡萄糖浓度(mgmL)x多糖的稀释倍数2.2.7 待测样品石斛多糖的测定精密称取铁皮石斛原球茎的干燥粉末，各加80乙醇100 ml，回流提取1 h，稀释过滤，药渣用8 ml80热乙醇洗涤3次，加蒸馏水80 m1，回流1 h，乘热过滤，再用5 ml热水洗涤烧瓶和药渣，一并置于100 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀置冰箱中备用。精密吸取1.0 ml按标准曲线项下操作，求出各多糖液中葡萄糖浓度。多糖含量=（Cs.D.f/w）100式中Cs为供试品溶液葡萄糖浓度(mg mL)，D为供试品溶液的稀释因素，f为换算因素，w为供试品重量(mg)。
9、3 结果与分析3.1不同浓度壳寡糖对铁皮石斛生长的影响表2 不同浓度壳寡糖对中铁皮石斛生长的影响编号壳寡糖浓度(mg/L)平均增长倍数健壮度颜色增殖效果1234500.11.0101006.1247B6.7010A5.9324C2.3197D2.1479E+深绿伴浅绿深绿伴浅绿浅绿浅绿浅绿+注：“+”表明程度。培养40天后，测定其增长倍数，用LSD法测定定差异显著性（p=0.05）。字母相同者表示差异不显著，字母不相同者差异显著，以下表格相同。经表1中不同浓度壳寡糖培养的铁皮石斛，如下图所示： 图1 壳寡糖浓度由小到大所对应的铁皮石斛的生长情况由以上数据可得，随着壳寡糖少量的加入，铁皮石斛的生
10、长量增加，而对照培养的原球茎生长较好，表明少量壳寡糖促进铁皮石斛的生长,当壳寡糖浓度超过0.1mg/L时,铁皮石斛原球茎比对照培养的原球茎生长越来越差,说明壳寡糖浓度超过一定的限度,抑制铁皮石斛的生长.3.2不同浓度的壳寡糖对铁皮石斛多糖的含量的影响3.2.1 波长的选择图2 葡萄糖溶液在400-600nm波长处与其吸光度的对应关系 图3 葡萄糖溶液在485-495nm波长处与其吸光度的对应关系（为图2中485-495nm处的放大）待添加的隐藏文字内容2由以上图表可以看出，相同葡萄糖浓度的溶液的吸光度在波长为491nm之前随着波长的增加而增加，在491nm处最高，当波长大于491nm之后随着波
11、长的增加而减少，选波长为491nm测量多糖吸光度较为合理，提高测量精度。3.2.2 标准曲线表3 葡萄糖浓度及吸光光度值葡萄糖溶液体积mL反应时葡萄糖浓度(mg/L)吸光度00.20.40.60.81.000.0220.0440.0660.0880.1100.10690.22030.31480.41980.5771以反应时葡萄糖浓度为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，得标准曲线为：y=5.0892x-0.0068，R0.9941，二者相关性良好。由标准曲线可知，随着葡萄糖浓度的升高，溶液吸光度也随之升高。由此看出，葡萄糖浓度与其所对应的吸光度是呈线性相关关系，所以只要知道铁皮石斛多糖吸光度与葡
12、萄糖吸光度的关系，就可以换算出其多糖含量。3.2.3 不同浓度的壳寡糖培养的铁皮石斛原球茎多糖含量的比较由于铁皮石斛多糖成分复杂，难以准确测量，故而将其分解成单糖后，根据单糖含量换算出铁皮石斛多糖的含量。根据实验数据可得：f1.6463。表4 不同浓度的壳寡糖培养的铁皮石斛原球茎所对应的多糖含量壳寡糖浓度mg/L葡萄糖浓度g/L吸光度多糖含量00.11.0101000.09500.13580.12430.15640.13660.47660.68420.72590.78910.688228.40B30.84A26.94C26.78D18.74E注：培养40天后，测定其多糖含量，用LSD法测定定差
13、异显著性（p=0.05）。字母相同者表示差异不显著，字母不相同者差异显著。由以上数据可得，在低浓度的壳寡糖浓度下，石斛多糖的含量随着壳寡糖加入而升高，而超过0.1mg/L时，其多糖含量则减少。说明低浓度的壳寡糖促进多糖的生成，而高浓度的壳寡糖则抑制多糖的生成，含壳寡糖0.1mg/L的培养基较有利于铁皮石斛糖分的吸收与转化，为石斛生物制药生产和积累次生代谢产物的配方优化提供了依据。4 讨论 目前，有多人曾对铁皮石斛多糖进行过测定，多糖含量的测定方法有苯酚一硫酸法6、3，5 硝基水杨酸法11、分子光谱法12等本实验通过苯酚硫酸法测得石斛的多糖含量，其中当壳寡糖的浓度为10mg/L时，其多糖含量最多
14、，从含量比较可看出壳寡糖浓度为0.1mg/L的培养基所培育的铁皮石斛最具有价值。多糖所具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的。何铁光13等研究了铁皮石斛原球茎的多糖DCPP3c一1后发现其主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。杨虹等14研究铁皮石解多糖DT2、DT3，将这两个多糖酸水解并进行薄层层析得出其中的单糖主要有有葡萄糖、半乳糖、木糖及少量阿拉伯糖和甘露糖。实验数据表明，加入壳寡糖可能与细胞原生质膜上的特定受体相互作用，促进基因的转录与表达15，影响某些器官的活性，如促进叶绿体的活性，使之加速光合作用，产生更多的多糖，而过量的壳寡糖则可能对细
15、胞膜上的特定受体产生屏蔽作用，阻碍或阻止了信号的传导，从而表现出一定的抑制作用，使多糖含量减少。参考文献1 包雪声,顺庆生,叶愈青.石斛类药材枫斗的历史及现状.中药材，1999，22（10）:540-542.2 邵华,张玲琪,李俊梅,铁皮石斛研究进展.中草药,2004,35（1）;109-202.3 黄民权,等,石斛愈伤组织培养物的药用前景探讨,中药材,1998,21（11）:543.4 王世林,郑光植,何静波,等黑节草多糖的研究J云南植物研究,1988，10(4)：3893955 孙小静,石纯,许世远,等.上海北部郊区土壤多环芳烃含量及来源分析J.环境科学研究，2008，21f4)：1401
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19、nd Chemistry Engineering Specialty of biological technology 【Abstract】 The protocorms of Dendrobium candidum Wall.ex Lindl as raw material, The cultured in medium containing different concentrations of chitosan oligosaccharide in, research Effects of Chitooligosaccharides on Dendrobium candidum prot
20、ocorms growth and polysaccharide content. The results show that In the lower concentration of chitosan oligosaccharide, Chitosan oligosaccharide promotes the polysaccharides content of Dendrobium candidum accumulation., while increase the high concentrations inhibit the polysaccharide. In experiment
21、 , Growth of Dendrobium candidum decreased with increasing concentration of chitosan oligosaccharide. In the chitosan concentration under0.1mg/L, the polysaccharide content of up to 30.84%. The reduction of more than 0.1 mg/L polysaccharide content.【Key word】 Dendrobium candidum Wall.ex Lindl; Protocorm; Chitosan oligosaccharide; Phenol - sulfuric acid method; The content of polysaccharide
