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1、天然产物提取液中蛋白质和脂肪等杂质的去除试验Remove Test of Protein and Fat and other Impurities from natural product extraction目录摘要IAbstractII引 言1第一章绪论21.1天然产物的介绍21.2我国天然产物的研究和应用现状21.2.1天然产物的研究方法21.2.2天然产物的提取方法21.2.3我国天然产物的应用现状51.2.4天然产物的发展前景51.2.5我国天然产物的发展方针61.3天然产物提取液的精制方法71.3.1蛋白质分离纯化方法81.3.2冷冻脱脂的原理及影响因素111.4高速离心分离技术1
2、21.4.1离心分离简介121.4.2离心分离的基本原理121.4.3常用离心方法13第二章实验部分142.1实验材料142.2仪器和试剂142.2.1实验仪器142.2.2主要试剂142.3分析方法142.4实验方法142.4.1粗提取液纯化142.5提取液的高效液相色谱分析15第三章 结果与讨论163.1温度控制条件的确定163.2除杂前提取液吸收光谱的测定193.3提取液处理前后的紫外光谱分析223.4提取液的高效液相色谱谱图分析243.5除杂前后对有机玻璃的上色效果27结 论29致 谢30参考文献31天然产物提取液中蛋白质和脂肪等杂质的去除试验摘要：利用蛋白质分子的热变性和低温脱脂原理
3、对迎春花和连翘花提取液进行处理，根据提取液处理前后的紫外吸收光谱和高效液相色谱的不同以及对有机玻璃上色效果的对比；考察了除杂效果。实验结果表明对天然产物提取液进行冷冻、加热、离心处理能够有效除去提取液中的蛋白质和脂肪等大分子杂质。除杂的条件是，3 6小时，45 60分钟，2000转/分 离心15分钟。关键词：天然产物；加热；冷冻；除杂Remove Test of Protein and Fat and other Impurities from natural product extractionAbstract：The extraction of jasmine and forsythia
4、flower was treated by using protein molecule thermal denaturation and the principle of low temperature defatted, the effect of removing impurities was studied by the difference of the UV absorption spectroscopy between the untreated extraction and treated extraction and by the difference of High Per
5、formance Liquid Chromatography (HPLC) between the untreated extraction and treated extraction ,and also by the effect contrast of dyeing the organic glass. The experimental results show that the protein and fat and other macromolecule impurities in natural product extraction can be effectively remov
6、ed by being frozen, heated and centrifugally separated. The conditions of removing impurity are 3 for six hours, 45 for one hour, 2000 r/min for fifteen minutes.Key word：Natural products; Heating; Freezing; Impurity引 言天然产物广泛存在于多种生物特别是动植物体中，其安全性和营养价值高，有的兼有一定的药理作用。开发天然产物是世界食用色素业和医药等行业的发展趋势之一，以天然产物为主的保
7、健品和药物等具有相当大的市场前景，但由于天然产物分离纯化困难，很难达到和国际接轨的要求，因此解决天然产物研究中样品分离纯化的难题，得到除杂后的精制产品会使天然产物的开发利用具有更加广阔的前景，同时开发高效的天然产物的除杂方法对彻底改变中国天然产物开发层次低，生产方式粗放，技术落后有重要作用，对中国天然产物利用现状的转型与提升具有重要意义。本实验在查阅大量文献的基础上进行，得出除杂效果好、操作简便、经济、能耗低，适应实验室大多数相似天然产物的除杂需要的操作方法，为天然产物研究工作者提供参考。第一章 绪论1.1 天然产物的介绍天然产物是指动物、植物、昆虫、海洋生物和微生物体内的组成成分或其代谢产物
8、以及人和动物体内许多内源性的化学成分。其中主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、各种酶类、单糖、寡糖、多糖、糖蛋白、树脂、胶体物、木质素、维生素、脂肪、油脂、蜡、生物碱、挥发油、黄酮、糖苷类、萜类、苯丙素类、有机酸、酚类、醌类、内酯、甾体化合物、鞣酸类、抗生素类等天然存在的化学成分，其中许多有效成分是预防和治疗疾病、调节身体的物质基础。并且天然产物由于其安全性高，已成为医药、食品和饲料等的重要来源1-2。1.2 我国天然产物的研究和应用现状1.2.1 天然产物的研究方法天然产物的获得和生产主要有三条途径：一是直接提取；二是人工合成；三是利用生物技术生产。目前绝大多数品种的天然产物是采用直接提取方
9、法生产的。由于生物合成代谢的复杂性，许多天然物质很难在人工控制下化学合成，人工合成的方法只能生产极个别的具有天然产物化学组成和分子结构的物质。近年来随着生物技术的发展，利用生物技术生产天然产物已为人们开阔了广泛的领域，如利用微生物发酵方法生产蓝色素、红曲色素等多种天然色素已成为现实3-4，利用微生物具有特定的优势，如不受资源、环境和空间的限制，以及生长迅速等，可快速大量的生产天然产物。对天然产物性质的研究，首先应考虑毒理学的评价或安全性，其次是天然产物的理化性，主要包括：pH值、光照、温度以及食品中金属离子、碳水化合物和添加剂的影响，天然产物的抑菌活性、光谱性质和抗氧化还原能力等5，同时随着近
10、代科学技术的发展，人们要从分子水平上去认识天然产物，包括它的结构和分子方面的性质，这样就能更好的了解天然产物的性质和应用范围。通过对天然产物分子性质的研究，人们就可以更好地指导其在工业生产中的应用，为天然产物工业的发展提供理论基础。1.2.2 天然产物的提取方法发展至今，天然产物的提取方法常见的有有机溶剂提取法、碱液提取法、超临界提取法、微波萃取法等几种方法。 (1)有机溶剂提取法 溶剂提取法是目前从动植物中提取色素的一种常用的方法。提取高梁红色素是用0.1%的盐酸水溶液浸泡2h，除去杂质和杂色后，再用7%的乙醇水溶液在40下浸提，然后过滤、浓缩、干燥而得6。利用有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、乙
11、酸乙酯等提取姜黄得姜黄色素7，将虾壳用盐酸浸泡24h 后过滤，滤渣用95%乙醇浸泡提取液经蒸馏后得到浓缩的粗制虾青素提取物。相对而言，有机溶剂提取法萃取剂便宜，设备简单，操作简单易行，提取率较高，但用其提取的某些产品质量较差，纯度较低，有异味或溶剂残留，影响产品的应用范围。(2)碱提取法 碱提法主要是应用碱对多种生物物质的影响作用，其提取效率虽不如有机溶剂提取率高，但从经济角度和安全性考虑仍有应用价值。虾壳中的虾青素大多与蛋白质结合，应用碱液脱蛋白的原理，当用热碱液煮虾壳时，蛋白质溶出，虾青素也随着溶出，从而达到提取虾青素的目的。辣椒红色素的碱提取是以15%- 40%的水溶液处理辣椒油树脂，使
12、辣椒红色素中的脂肪成分发生皂化反应， 从而将辣椒红色素游离释放出来，再分离精制可得到产品。由于碱提法加工过程需消耗大量酸碱，且废液较难回收，因此近几年来对碱提法的研究报道较少。(3)超临界流体萃取法 超临界二氧化碳流体萃取是近二十年发展起来的一种新型物质分离、精制技术。它兼备有气体低粘度、高扩散和流体的高密度、大溶解度两方面的特点8。由于超临界提取工艺简单，能耗低，萃取剂便宜，提取的产品具有纯度高， 溶剂残留少，无毒副作用等优点，越来越受到人们的重视。Tsunc 等的专利报道中，应用超临界从虾壳中提取虾青素，浓度可达到8.331%9。宿树兰等采用正交试验优化超临界流体萃取姜黄药材中姜黄素，得到
13、姜黄素占萃取物量高达8.91%。(4)微波萃取法微波萃取是在密闭容器中用微波加热样品及有机溶剂，将待测物质组分从样品基体中提取出来的一种方法，是由密闭容器中酸硝解样品和液固萃取有机物两种技术相结合演变出来的，其能在短时间内完成多种样品组分的萃取，溶剂用量少，结果重现性好10。微波萃取克服了超临界萃取和溶剂萃取方法的上述缺陷， 既降低了操作费用，又符合环境保护的要求，表现出良好的发展前景和巨大的应用潜力。(5)分子蒸馏技术分子蒸馏是一种特殊的液-液分离技术，其基本原理是基于不同物质分子在高真空下分子运动平均自由程的差别，在远低于物质常压沸点温度的条件下将其分离出来。该技术具有蒸馏温度低，蒸馏压力
14、低，分离程度高，受热时间短等特点，因而能大大降低高沸点物料的分离成本，极好地保护热敏性物料的品质，真正保持了纯天然的特性。钟耕等采用分子蒸馏法，以冷榨甜橙油为原料，提取其中的类胡萝卜素。结果表明，采用分子蒸馏法，从脱蜡的甜橙油中一步提取的色素，不含有机溶剂，纯度高，色价高。(6)双水相萃取技术(ATPE)双水相萃取技术是二十世纪60 年代以来研究开发的新型固-液分离技术。其基本原理是利用被提取物质在不同的两相系统间分配行为的差异进行分离。与传统的萃取方法相比，ATPE 技术所形成的两相大部分为水，两相界面张力很小， 为有效成分的溶解和萃取提供了适宜的环境， 相际间的质量传递快， 操作方便， 时
15、间短，条件温和，易于工程放大和连续操作。(7)高效液相色谱(HPLC) 技术HPLC是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析技术。该技术具有分离效率高，分析速度快，用样量少，灵敏度高，流出组分可收集，兼具分析和制备等优点，适应于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。对于热不稳定性或极性大的天然产物来说，HPLC是一种有效的分离分析方法。赵明波等建立了菊科植物红花中的主要有效成分羟基红花黄色素A的HPLC 定量分析方法。(8)酶法提取法纤维素酶可使纤维素、半纤维素等物质降解，引起细胞壁和细胞间质结构发生局部疏松、膨胀等变化，从而增大胞内有效成分向提取介质的扩散，促进天然产物提取效
16、率的提高。应用纤维素酶提取红花中的红花黄色素，与传统水浸提取工艺相比，提取率提高了9.40%-13.35%，具有提取条件温和，有效成分理化性质稳定等优点。应用酶促反应还可改变天然栀子黄色素中的栀子苷的结构， 生产出栀子红、蓝色素。(9)膜分离法膜分离法是用天然或人工合成的高分子膜，以外界能量或化学位差为推动力对混合物进行分离、分级、提纯和浓缩的方法。在色素分离中，利用色素与杂质分子大小的差异， 采用纤维超滤膜和反渗透膜，可阻留各种不溶性大分子如多糖、蛋白质等。该法工艺简单，效能高11。1.2.3 我国天然产物的应用现状我国疆域辽阔，有着天然产物生产所需的丰富植物资源，在发展天然产物方面具有一定
17、的优势。所以在开发利用天然产物时，既要充分利用我国丰富自然资源，但也要注意综合利用、环境的保护以及资源的可持续发展。目前已经开发出80余种不同原料来源的食用天然色素。云南的西双版纳、武陵山区、秦巴山及东北的长白山为天然色素植物资源较为集中的地区，玉米、红花、辣椒等品种为我国发展天然色素工业提供了充足的原料。我国还有一支庞大的天然色素研究开发队伍。我国食用色素的生产使用管理是改革开放以来食品工业快速发展而迅速发展壮大起来的。经过20多年的努力，我国的食用色素产业已初具规模，成为食品工业中的一个重要行业。目前，我国已推出品种繁多的天然食用色素，诸如，姜黄色素、叶绿素铜钠盐、红药子黄色素、玉米黄色素
18、、红曲色素粉、高粱红色素、枣红色素、桅子黄色素、辣椒红色素、红花黄色素等，均受到广大食品厂家的青睐。据1998年下半年统计，我国食用色素的年产量约2.5万吨。其中：焦糖每年产量约1.82万吨；红曲米及红曲米粉每年约产4000多吨；红曲红每年约产200多吨；辣椒油树脂及辣椒红每年约产250多吨；桅子黄色素每年约产10吨；高梁红色素每年约产45吨；可可壳棕每年约产10吨；甜菜红每年约产20吨；虫胶红每年约产20吨。这些食品天然色素产品除在国内销售外，还远销国外。焦糖色素是一种天然的食品着色剂和天然食用色素。在人们崇尚绿色天然食品的今天，用纯化学物质人工合成的食品着色剂和食用色素已不占食用色素市场的
19、主流。因此，用糖类、淀粉类制作的焦糖色素作为天然食品着色剂和天然食用色素，成为国际上的食品市场首选的食用色素，按比例计量，焦糖色素占所有食品色素量的90%以上，广泛应用于食品工业中的酱油、酱菜、食醋、烧腊、肉类罐头、糖果、烘烤食品、有色饮料、有色酒类等产品12。1.2.4 天然产物的发展前景随着我国食品、医药、轻工业的发展，天然产物的市场需求量将大幅度增加，新产品开发和应用范围的扩大，使得天然产物市场具有广阔的发展前景。中国天然产物的发展将为我国进人一日三餐的加工食品增加更多的色彩和安全感。同时由于人们对化学合成色素危害性认知的增加，天然产物具有的天然和健康属性，使天然色素的种类和市场需求量大
20、幅度增加，而且色素品种逐渐由合成色素转变为天然色素，但目前天然色素的开发生产远不能满足现代工业发展的需要，开发新品种的天然色素，探索新的天然色素来源，对原有天然色素的生产工艺进行改进，扩大天然色素的应用范围，降低天然色素的生产成本，已成为添加剂行业和研究者们非常迫切的问题。同时我国幅员辽阔，位处寒、温、亚热、热带地区，生物资源丰富，种类繁多，而且许多品种产地集中，如云南的西双版纳、武陵山区、秦巴山以及东北的长白山均是天然色素资源较为集中的地区，其他各地都有天然色素生产的原料，均可以因地制宜地开发利用。特别是一些农产品，如玉米、高粱、辣椒、萝卜等更是随处可见，这就为天然产物的开发利用提供了丰富的
21、原料，也为农副产品的深加工开辟了新的途径。1.2.5 我国天然产物的发展方针我国天然产物产业是改革开放以来，随着食品工业的蓬勃发展而发展壮大起来的。随着人民生活水平的提高和食品工业不断发展与壮大，食用色素发展在我国具有广阔的前景，以天然色素为例说明我国对天然产物发展的政策方针。(1)大力发展“天然、营养、多功能”的食用天然色素今后在我国化学合成着色剂与天然色素并用的情况下，应当大力发展“天然、营养、多功能”的天然色素，着力开发、研究、生产、使用既可以着色，又有某些生理功能的天然色素例如天然价胡萝卜素，作为食品黄色着色剂，进人人体后在加氧酶作用下能在肝脏或肠粘膜裂解成两个分子的维生素A，而维生素
22、A有使上皮细胞健全、保持正常视觉、提高免疫力等多种生理功能。红曲米中含有降血脂物质酪伐它汀，作为着色剂用于食品中，可以有效地使人体内血脂达到正常平衡不少以类黄酮为天然色素的物质有抗氧化功能或软化血管功能。我国天然色素资源丰富，进一步开发、研究、生产、应用功能性天然色素大有潜力。(2)提高技术与装备水平，促进天然色素的生产天然色素的生产应当采用高新技术，不断提高装备水平，提高产品的产量和质量，降低成本，从而提高产品在国内外市场的竞争力。我国产物生产行业虽有少数工厂拥有较好的生产技术、工艺和装备，但大多数企业在技术、工艺方面比较落后，设备陈旧或简陋，必须不断创新提高，才能使产品上档次，行业才有发展
23、。在天然色素的生产过程中，可以采用的高新技术有：基因工程、细胞工程、发酵工程、吸附色谱、凝胶过滤、微孔过滤、超滤、电渗析、反渗透、膜分离技术、超临界流体萃取分离技术(、丙烷)、冷冻干燥等技术。采用了高新技术，就是提高设备的装备水平，这是提高天然色素的收率，提高产量，保证优质的基础。(3)实现产品的标准化、系列化、实用化，开拓国内外市场。近年来，我国天然色素产业的管理水平和规范化方面虽然有长足的进步，但还应当进一步加强。我国各天然色素生产企业一般规模都偏小，产品单一，在小量、低质量、高损耗中徘徊，经济效益不明显，抗风险能力差。多数工厂所生产的是原料型的天然色素，一般不能直接使用，因而价格低，经济
24、效益不高。就某一个天然色素而言，一个企业也没有完全做到标准化、系列化，缺欠实用技术的开发。欧洲、美国、日本等国天然色素产业的发展早于我国，这些国家在管理水平、规范化、标准化、系列化、实用化等方面日臻完善。我们应当奋进直追，迎头赶上。在天然色素的发展方面，应当进一步加强天然色素实用技术的研究、开发，这个课题并不亚于天然色素本身的研究、开发和生产，是我国天然色素打开国内外市场的关键。(4)进行原料的综合利用在原料上应当走综合利用，变废为宝的道路。一个原料多出好几个产品，物尽其用，提高经济效益。许多天然色素生产的原料是野生植物、农作物副产品或废弃物。目前许多天然红色素，如红高粱、酸枣色、葡萄皮红等，
25、都是从农产品的废弃物中提取的。用高粱壳生产高粱红；用葡萄皮渣生产葡萄色素等，原料低廉。又例如生产辣椒红色素的工厂，用辣椒作为原料。辣椒的种子可以提取辣椒碱及辣椒油，残渣含高蛋白；辣椒种皮可以提取辣椒红色素、辣椒碱，残渣再配上面酱、油、鲜味剂，可精制辣酱。一个姜黄原料可以生产出姜黄油、姜黄素、姜黄油树脂、姜黄粉、乳化姜黄色素等多种产品，这对于农产品的深加工以及废弃物的处理，不失为一个好方法。这种综合利用的开发，可以大大提高经济效益。(5)立足国内市场、开拓国际市场我国天然色素产品应当立足于国内巨大的市场，开拓国际市场。我国是一个占世界人口四分之一的、具有13亿人口的大国，因此，这样多的人口，要进
26、入一日三餐的加工食品时代，需要的食用天然色素是很大的。一些外国的有识之士也十分重视这个市场。只要我们能把自己的天然色素做到标准化、系列化、实用化，一定能培养出中国这个大市场，这已经为火腿肠使用红曲红和饼干喷涂辣椒红的中国市场所证明。当今国际经济一体化要求我们将中国的天然色素打人世界其它国家，特别是西方发达国家，它除了要开拓中国天然色素的国际市场外，还有一个东方饮食文化的交流和交融的重要意义12。1.3 天然产物提取液的精制方法随着科技的发展和生活水平的提高，天然产物以其健康、安全的特点，将越来越受人们的欢迎，但天然产物大多不能直接使用，而只需要其中的某些物质，因此需要对天然产物进行提取分离，提
27、取后所得提取液大多数是混合物，需利用体系中各组分物性的差别，使用不同的方法使混合物得到分离提纯。1.3.1 蛋白质分离纯化方法(1)根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质，并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐
28、为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜，也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离13。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有
29、蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析，是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之，比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和
30、琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果，纯度鉴定证明产品为分子量约为32kDa、成分是多糖蛋白质(8812)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白14。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质。(2)根据溶解度不同进行分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下，不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度，根据蛋白质分子结构的特点，适当地改变外部条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐
31、析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点，而且在等电点时溶解度最低；相反，有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等15研究茶叶蛋白质提取过程发现，pH值为4时茶叶蛋白提取效果最好，提取率达到36.8%，初步纯化得率为91.0%。李殿宝在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到34，使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等测得葡萄籽蛋白质的等电点为3.8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质，得到了最佳的提取工艺为：以的溶液，按15的料液
32、比，在40搅拌40 min，葡萄籽蛋白质提取率达73.78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白，蛋白质产率高达90%。蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象，其中，增加蛋白质溶解度的现象称盐溶，反之为盐析。应当指出，同样浓度的二价离子中性盐，如、对蛋白质溶解度影响的效果，要比一价离子中性盐如、大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质，其最佳提取工艺是：以10%溶液，按125的料液比，在30搅拌提取30min，蛋白质提取率为57.25%。盐析是提取血液中
33、免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法，其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性，为防止其对蛋白质的破坏，应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象，蛋白质样品的含量一般控制在0.2%2.0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后，通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐。有机溶剂提取法的原理是：与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低；而且在一定温度、pH值和离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如，在冰浴中磁力搅拌下，在4预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25)，可以
34、使冰核蛋白析出，从而纯化冰核蛋白。由于在室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀，而且伴随着变性。因此，通常要将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高，蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质，可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取，它们有一定的亲水性和较强的亲脂性，是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出，用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法，不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分，而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。萃取是分离和提纯有机
35、化合物常用的一种方法，而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction，ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相，由于被分离物在两相中分配的不同，便可实现分离，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行，双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性，收率较高。对于细胞内的蛋白质，需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩，细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白，受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响16。反胶团萃取
36、法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。(3)根据电荷不同进行分离纯化根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。在外电场的作用下，带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳，常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白
37、质分离技术，也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。孙臣忠17等研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现，聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低，加样量不高；等电聚焦电泳分辨率最高，可以分离同种蛋白的亚成分，加样量最小；等速提纯电泳区带分辨率较高，可将样品分成单一成分，加样量最大。离子交换层析(Ion exchange chromatography ，IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可
38、逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂；反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，被留在层析柱上，通过提高洗脱液中的盐浓度，将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来，其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。李全宏等18将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外，离子交换层析还用于抗凝血蛋
39、白的提取。(4)利用对配体的特异亲和力进行分离纯化亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性，以便设计出最好的分离条件。近年来，亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化，特别是在融合蛋白的分离纯化上，亲和层析更是起到了举足轻重的作用，因为融合蛋白具有特异性结合能力19。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛20。范继业等利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428，纯化回收率达到62.5
40、%。该方法成本较低，吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广，产品质量稳定。1.3.2 冷冻脱脂的原理及影响因素1.3.2.1 冷冻脱脂原理天然脂类中不同类型的甘三酯的熔点有一定的差异，随着温度的降低固体脂在有机溶剂中的溶度降低，因此通过降温冷却能促使固体脂结晶，然后进行固液分离即可达到脱脂的目的。固体脂的结晶可分为3个阶段：一是油脂的冷却、过饱和；二是晶核的形成；三是脂晶的成长。1.3.2.2 影响冷冻脱脂的因素影响冷冻脱脂的因素主要有4个方面。一是结晶温度和冷却速率。某种油脂最稳定晶型的获得是由冷却速度和结晶温度决定的，温差过大的急骤冷却易形成无法
41、分离的玻璃质体，只有缓慢冷却至一定的结晶温度，才能获得相应的晶型，冷却速率取决于冷却介质与油脂的温差和传热面积。脱脂效果主要取决于晶粒的数量与大小，在冷冻脱脂过程中晶核的生成及晶粒的生长速率与冷却速率有着极大的相关性。二是结晶时间。达到稳定晶型需要足够的时间，延长结晶时间有利于稳定晶型的形成和成长。三是搅拌速度。适当的搅拌，可使油脂中各处冷却均匀，使已经析出的脂晶与将要析出的脂分子碰撞，有利于晶粒的形成和长大。但搅拌速度过大，则会打碎已经形成的晶粒，也不利于结晶。故搅拌速度要适宜，要根据冷冻结晶操作的不同阶段而调节，以有利于晶粒的形成与成长为度。四是溶液品质。天然提取液中的某些杂质对结晶及其分
42、离也有很大影响，如过氧化物的存在不仅会降低油脂的固体脂指数，而且会增大油脂的黏度，对结晶和分离均有不良影响，须将其预先脱除21。1.4 高速离心分离技术1.4.1 离心分离简介离心分离(centrifugal separation)：借助于离心力，使比重不同的物质进行分离的方法。 由于离心机等设备可产生相当高的角速度，使离心力远大于重力，于是溶液中的悬浮物便易于沉淀析出：又由于比重不同的物质所受到的离心力不同，从而沉降速度不同，能使比重不同的物质达到分离。离心分离生物分子是最常用的生化分离方法，因为不同的生物分子有不同的体积和密度，可在不同离心力的作用下沉降分离。随着生命科学技术的发展，离心分
43、离技术已成为生物化学与分子生物学中不可缺少的分离技术手段。对于两相密度相差较小，黏度较大，颗粒粒度较细的非均相体系，在重力场中分离需要很长时间，甚至不能完全分离。若改用离心分离，由于转鼓高速旋转产生的离心力远远大于重力，可大大提高沉降速率，因此离心分离只需较短的时间即能获得大于重力沉降的效果。1.4.2 离心分离的基本原理当非均相体系围绕一中心轴做旋转运动时，运动物体会受到离心力的作用，旋转速率越高，运动物体所受到的离心力越大。在相同的转速下，容器中不同大小密度的物质会以不同的速率沉降。如果颗粒密度大于液体密度，则颗粒将沿离心力的方向而逐渐远离中心轴。经过一段时间的离心操作，就可以实现密度不同
44、物质的有效分离。1.4.3 常用离心方法根据离心方式的不同，可分为差速离心法和密度梯度离心等。(1)差速离心：又叫分级离心法，是生化分离中最为常用的离心分离方法。它指采用低速和高速两种离心方式交替使用，用不同强度的离心力使具有不同密度的物质分级分离的方法。离心后把上清液与沉淀分开，然后再将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。(2)密度梯度离心：也叫区带离心，即离心是在具有连续密度梯度的介质中进行。将试样铺放在一个密度变化范围较小、梯度斜度变化比较平缓的密度梯度介质表面，在离心力场作用下试样中的颗粒按照各自的沉降速率移动到梯度介质中的不同位置，而形成
45、一系列试样组分区带，使不同沉降速率的颗粒得以分离。第二章 实验部分2.1 实验材料连翘花提取液，总黄酮含量8.2%；迎春花提取液：总黄酮含量7.5%；均为本实验室自备，于低温冷藏备用。 2.2 仪器和试剂2.2.1 实验仪器BCD-271SDJ冰箱 (青岛海尔股份有限公司)SUY-22-600DT超声清洗机 （郑州生元仪器有限公司）玻璃仪器气流烘干器 （河南智城科技发展有限公司） HH-501超级恒温水浴 （常州国华电器有限公司）FA 1004B电子分析天平 （上海佑科仪器仪表有限公司）85-2A双数显恒温磁力搅拌器 （金坛市杰瑞尔电器有限公司）电子温度计 （南京好又多电器有限公司）TDL80
46、-2B台式离心机 （上海安亭科学仪器厂）T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）Agilent 1200LC高效液相色谱仪 （美国安捷伦科技有限公司）2.2.2 主要试剂高纯水（Water） 408制备无水乙醇（Ethanol absolute） AR(天津市富宇精细化工有限公司)氢氧化钠（Sodium hydroxide） AR(天津市登科化学试剂有限公司)乙腈（Acetonitrile） 色谱纯（天津市大茂化学试剂厂）有机玻璃(PMMA) 市售2.3 分析方法用紫外分光光度计扫描迎春花、连翘提取液稀释100倍后的吸收光谱。2.4 实验方法2.4.1 粗提取液纯化(1)冷
47、冻脱脂分别取迎春花、连翘花粗取液各50ml于两个烧杯中，贴上标签置于冰箱中按设定温度3进行低温处理，低温处理完成以2000转速高速离心得到除去脂肪后的提取液，分别将离心后所得提取液与固体残渣分离，观察处理后的提取液的色泽及澄清度，取适量上层清液用紫外分光光度计测其在190nm-900nm波长范围内的光谱。(2)高温脱去蛋白质将脱脂后的提取液分别用恒温水浴加热至45，并保温1h，高温处理完成后以2000高速离心得到去除蛋白质的提取液，将提取液和固体残渣分离，静置一夜观察处理后的提取液的色泽及澄清度，取适量上层清液用紫外分光光度计测其在190nm-900nm波长范围内的光谱。2.5 提取液的高效液相色谱分析用高效液相色谱对纯化后的溶液进行分析，流动相为乙腈：水(0.4：0.6)，流速为1.0，柱温为室温，分离柱为C18；进样量20，检测波长为：迎春花；连翘花。第三章 结果与讨论3.1 温度控制条件的确定图3.1和图3.2为水的冷冻和加热曲线。回归方程为： Y=A+exp(-x/t1)+Y0 （3-1）图3.1水的降温曲线A=16.65 t1=1.15 Y0=3.70图3.2 水45升温曲线A=-27.29 t1=10.04 Y0=45.42根据上述分析的结果，确定控温温度与要
