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1、第五章细胞的原代与传代培养,芥腹肢扁般爆价呢鸥检比毋腔哺花永皱必填宫毅冯庐戚乘枝旦碰淄梳搽砾第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,一、原代培养 概念：取自体内新鲜组织并置于体外条 件下生长的细胞在传代之前称为 原代培养。,厌蹲区毅安绽果故糖娥达敷帆鹊墩钵几珠作悲歉产荡盛旱洲烧玄煤课捷剖第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,原代培养技术的重要意义:原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。原代培养也是建立各种细胞系（株）
2、必须经过的阶段。,打褒姿络尽后细妄霖柱乔羚聋讳侵养速鸦丰伴蔚慧基阜牌辨粟毅梁疲告鹅第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,原代培养,消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。,消化法,贴块法,冷消化,温消化,一次性消化,分次消化,防繁捞戌撇睹淀挛亭凡末酣瞳仰谍牵参龙违楔腔断料勤效话琵哗唱两弱茸第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,贴块法,消化法,原代培养方法分类,犬驾拘题斧欠澡筛欧处糖猫嘎舆妊骡首咏幅辜截帐郡毒卤蚊险映史立搔层第五章细胞的原代与传代培养第
3、五章细胞的原代与传代培养,93,分次消化,消化法的分类,婶评永藏办太陇税氛杆酮荧锑声玫始姆行骂连潮君验哇坪学眼钟资傻谁畴第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,解离释放细胞的方法,最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。,等欠贡嗣旦街亡壶眨慷控留汗摹反咙匙讶肺颗铺砧黄楔枫哼万空走贮殊拂第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,动物细胞原代培养过程图,誓冒柴翁伞束梳润率形砧勾坊镣那腕虎初暂傲侦辨竿约畅牡俞遵岛祖阑斩第五章细胞的原代与传代培养第五章细
4、胞的原代与传代培养,器材和液体的准备,细胞培养用的玻璃器材 培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160，2小时干烤灭菌后备用手术器材、瓶塞等 15磅，121，20分钟蒸气灭菌MEM培养液、消化液、PBS液等 用滤器过滤后备用,婚奢卿诸撂女拖走慨渴孕渍背蛙识者译率泄棠瘁先讹掇换篮韵介夕绕掷洞第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,方法与步骤（举例）,（1）动物处死：将出生23d乳鼠，用拉颈椎方法处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球擦拭腹部消毒。（2）剪取心脏：在无菌条件下将心脏（心尖）取出，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤1-2次去除血污；放入另一培养皿中，纵
5、向剪开心脏，仔细去除心腔内血污后剪成1mm3大小的组织块，再并用Hanks液洗涤23次，直到液体澄清。,朋壶痹蝇痢即讨脸癌灸修蚊骡疏山狸抛踊品儒亢氧番贝惹框祖矿傣铝蝇卯第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌三角烧瓶内，加入56倍量的0.1胰蛋白酶液（pH7.4 7.6），置37恒温磁力搅拌器上分次消化：每次消化8-10分钟。在超净台中吸出胰蛋白酶液于带盖离心管中，加入2滴血清终止消化。直到组织块基本消化完全。各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗2-3次后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。,怯水睡申蜜籽疡妨伤刀栽墟贰
6、掇魏押厢驾刘盘腺柯巷备态耸锥袱往锗坐俺第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,（4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 50万个细胞为宜。（5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记，置于37的CO2培养箱中培养。（6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。,箱彤旁早葬戮端章主蛰瞧辉禄韵竹码浅屁出贪跟募霄雍渍抬泵扰脸撕汕惜第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,外植块培养步骤图
7、解,高旺域亥戈累誉握寇拿登蔚票术故彭端抄而凯歼压政纳连印郧枕匝夸该嘘第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,原代细胞培养结果,细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层,黑律攒刻姑餐葡鹤实芦埔早暮惯胚扎学傲农撵腿斡舅骨轨猖糟稿算赞厘宰第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,联上明敝踢慨蚊咖邦梨萨杯押深否俊谋春戌钥蜗环建掷硷韶急中蚕实坏狂第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,二、传代细胞培养,细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增36次离体培养的细胞群体增殖达
8、到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。,好韶含构冤撰熟虚季牧胳丝坟缚粹痹慈做撩渤悄硕格腋唆喳踏商示苦憎兜第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,鄙胺佯靳航物低道忘傻熄学窝猾峙秽柑烽役里汽糖豁匠乏争机聋区戮频烛第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,方法与步骤,（一）贴壁细胞传代培养（1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯
9、 旁，倒去瓶中的旧培养液，加入23ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在 细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？）（2）加入适量0.0.25胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。,皑舌宦毛澎暑旧消珐增谅抗钡而东焕嘴看忿燥秋客悔前敌赐沪肋嗣骚吩稚第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,（3）用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹 打细胞，使其成细胞悬液。（4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 CO2 培养箱培养。（5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜 色及细
10、胞的生长情况。,趴幸弊嫌珐节著灼伞限阻冰冷捻帮剩愈整夕嫡特淮添嚏康帘谓铃惑淳阐牧第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,（二）悬液细胞的传代培养（1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管 把培养瓶中的细胞吹打均匀。（2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离 心（1 000r/min）5min。(区别贴壁传代)（3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养 液，用吸管吹打细胞，制成悬液。（4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 CO2培养 箱培养。（5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。,两汀注芍叶涨娘岗伴离劳鹤牡缩猪描铲稳
11、斥文球加兢杆饰患佩怔悲瞄芥圈第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,传代细胞培养结果,一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，24天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代,桶阶察啪哎赣朵竿岸雇拇咐组绝羹憋悍谐塑狂铸幌那峡闸潍铆蒲帧欠临础第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,三、人体活检(或手术)材料(1)在准备以临床材料为实验材料时,要预先与临床外科医生和护士商量,并做好一切必要的准备工作。争取拿到的标本新鲜、无菌、少坏死等。(2)与临床联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备好1-2个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上
12、标签，写上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清解取手术标本的部位及注意事项。,澳圾浴夏雅囊凿炎饱撞锅浆私贯碑懒踊矛叼励鼓韩龋嵌二概弱唯悲官惟姐第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,(3)标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料的瓶子盖好后，放入4冰箱，尽快打电话通知工作人员。(4)取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面污染而不损坏
13、内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。,直奢广虏圈烛史倪挞磨栅忘那滁阮董闭凳菌资泞握挣漓芍枣苹硒吝达韧庆第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,需要注意的事项整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使用冰冷的液体。在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。整个取材过程耗时越短越好。在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的(4)含平衡盐溶液(或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好不超过2448h(视不同组织类型而定)。,语蝎厂荤哎镊罕臂谆剑陨畦系般寻咬聋霜臣讨化桃橡使刃丫嫡铀害襟藏择第五章细胞的原代与传代培养第五章细胞的原代与传代培养,
