细胞生物学实验设计(王金发).docx

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1、实验设计第一章细胞概述1. Miller 证明地球上的有机分子自动合成的装置(图 E1-1)答: Miller 推测,大气层中含有甲烷和氨,也含有氢和水蒸气。他把这些气体一起放入实验装置中（图 E1-1） ,然后一直与电火花接触,在这一装置中靠沸水提供水蒸气。反应一个星期后分析产物。令人惊讶的是,产物中有大量的有机物, 包括尿素、生物和非生物的氨基酸等,实验证明了在雷电作用下能够利用大气中的分子合成有机分子。也就是说在进化的某一过程中地球上有了构成细胞生命物质的基本元件:氨基酸、碱基、单糖等,为细胞的起源作好了物质准备。图 E1-1 Mi l l er 证明地球上的 有机 分子 自动 合成 的

2、装置 1第二章细胞生物学研究方法1. 1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 发明的单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique) 的实验原理和技术细节有哪些?答:1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 发明了单克隆抗体技术,因此获得 1984 年诺贝尔医学奖。它是将产生抗体的单个 B 淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术， 其原理是: B 淋巴细胞能够产生抗体,但在体外不能无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代,但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性,既 能 产生抗体,又能无限增殖。图 E2

3、-1 所示是单克隆抗体制备流程。首先用一种抗原注射小鼠，引起产生特异抗体的细胞大量增殖,取出小鼠的脾, 分离产生抗体的淋巴细胞，同骨髓瘤细胞进行融合，在 HAT 培养基上进行初步筛选后，经过进一步鉴定,得到生产单克隆抗体的细胞。2图 E2-1 单 克隆抗体 技术 筛选用的 HAT 培养基是选择性培养基， 含有氨基喋呤(aminopterin,A)、次黄嘌呤(hypoxanthine,H)和胸腺嘧啶(thymidine,T)。在 HAT 培养基中，只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存，而未融合的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡。因为，正常的未融合细胞具

4、有核酸合成主要通路和旁路所必需的酶但不能在体外长期生长；突变后的肿瘤细胞只具有RNA 和DNA 合成所必需的主通路的酶，而缺乏利用胸腺嘧3啶核苷合成DNA 的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)或缺乏利用次黄嘌呤合成RNA 的磷酸核糖转移酶(HGPRT)。当这些细胞的核酸合成主通路被培养基中氨基喋呤阻断后，则因核酸合成障碍而死亡。只有肿瘤细胞和具有合成旁路酶的正常细胞形成的融合细胞，才能在氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下利用其中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核 酸而得以生存。由于融合细胞具有肿瘤细胞和抗体分泌细胞双重特征，所以在去除氨基喋呤这一核酸阻断剂后即可在正常培养基中长期传代增殖， 并分泌

5、抗体。在HAT 培养基中生存下来的细胞，可以是各种正常细胞与瘤细胞的融合体， 还可能是多克隆杂交瘤细胞的混合群体，因此须进一步用稀释法分离出单克隆的杂交瘤细胞和筛选出识别特异性抗原的抗体分泌克隆，才能最终得到特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株。第三章细胞质膜与跨膜运输1. Irving Langmuir 如何通过实验提出脂单层的设想？这一设想对膜结构的研究有何特长意义？答:关于细胞质膜膜的化学组成和结构，Irving Langmuir 通过展层实验，提出脂单层(lipid monolayer)的设想。他将提取的膜脂铺展在 Langmuir 水盘( Langmuir Trough)的水面上, 研究了脂

6、的展层行为,发现脂在水面上形成一薄层。他用苯将4脂溶解,然后将苯-脂溶液放在水面上展层,当苯挥发后,留下的脂在水面上形成单脂层(图 E3-1),亲水的头朝向水面,疏水尾背离水面。脂单层概念是 20 世纪初膜结构研究的基础,导致后来脂双层的发现。图 E3-1 脂 在 Langmui r 水盘 中展现单 脂层水盘有一个浅盘和一个可移动的挡板组成。移动挡板可将磷脂单层向固定挡板端挤压,形成致密的单脂层。1925 年两位荷兰科学家 E.Gorter 和 F. Grendel 根据对红细胞质膜的研究首次提出质膜的基本结构是双脂分子层。他们看到了 Langmuir 的研究论文,认为可以用展层方法研究红细胞

7、膜脂的结构,因为 Overton 已经提出在细胞的外层有脂的包被,推测红细胞的表面也有脂的存在。在红细胞的外侧包被中有多少脂?尚不清楚。但是,他们在显微镜下观察到人的红细胞是扁平状,直径约为 7m。根据红细胞的体积,推测红细胞的表面积约为 100 m2。他们分离纯化了红细胞,并从一定数量的红细胞中抽提脂类,按 Langmuir 的方法进行展层,5并比较展层后脂单层的面积和根据体积所推算的总面积。比较的结果, Gorter 和 Grendel 发现脂铺展的面积同实际测量的红细胞的表面积之比约为 1.8 2.2 1，为了解释这一结果， 他们提出红细胞膜的基本结构是脂双层(lipid bilayer

8、)。同时，推测脂双层具有热力学的特点,认为极性的亲水基团朝向外侧的水性环境。他们的实验和依据实验所得出的结论具有非常重要的意义,这是人类第一次从分子水平研究细胞膜的结构。2. 细胞膜上有很多蛋白,如何鉴定膜运输蛋白?答:目前有两种鉴定方法(图 E3-2),一种是亲和标记法(affinity labeling),另一种是膜重建(membrane reconstitution)。图 E3-2 鉴 定膜 运输 蛋白 的两种方 法上 : 亲 和 标记法 , 在 此法 中常常用 到特 异的 运输 系统 的抑 制剂 。下 : 膜重 建 法。在亲和标记法中,主要是用放射性标记的分子抑制某种物质的运输.这种抑

9、制作用是由抑制剂同膜运输蛋白的结合引起的,然后分离膜蛋白,鉴定同抑制剂结合的膜蛋白。例如6细胞松弛素 B 是葡萄糖运输蛋白的抑制剂,因此将放射性标记的细胞松弛素加入到细胞液中,就可同膜中葡萄糖运输蛋白结合,然后从膜中分离蛋白,通过放射性分析鉴定膜运输蛋白。在膜重建法中,首先要分离纯化膜蛋白,然后将分离纯化的蛋白质同磷脂混合,构建人工脂质体，然后检测脂质体的运输能力。3. 请设计一种方法检测跨膜蛋白的哪一部分位于膜的外侧,哪一部分位于膜的内侧?答: 用相对分子质量大而不能透过细胞质膜的胰蛋白酶处理胰蛋白酶完整的细胞:这种处理可以将跨膜蛋白的朝向外侧的肽水解,而位于脂双层和细胞质面的部分则不受影响

10、。 用非离子去垢剂或渗透休克提高膜的渗透性,让膜失去了对蛋白水解酶渗透的障碍作用, 结果使膜蛋白的细胞质部分被蛋白酶水解。处理的结果可以通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。同时设置对照细胞。 实验过程示于图 E3-3。7图 E3-3 测 定膜 蛋白 在膜 中定 位的 实验 过程 第四章细胞环境与互作1. 证明细胞具有识别能力的经典实验是什么?8图 E4-1 细胞识别的 实验 证明 2. 如何通过基因工程的方法证明钙粘着蛋白的确是介导细胞粘着的分子?答:首先要克隆钙粘着蛋白基因;将克隆的基因导入粘着能力差的细胞中(如成纤维细胞的 L-细胞);通过体外培养,检查和比较工程细胞的粘着能力。图

11、4E-1 是该实验的结果:L-细胞相互粘着的能力很低，但是将克隆的编码 E-钙粘着蛋白或 P-钙粘着蛋白的基因导入 L-细胞,使得 L-细胞具有合成 E 或 P-钙粘着蛋白的能力并能够进行相互粘着。用基因克隆的方法使 L-细胞产生的钙粘着蛋白与自然细胞合成的钙粘着蛋白是相同的。这些实验结果说明钙粘着蛋白也是介导细胞粘着的分子。3. 如何通过实验证明间隙连接具有通讯作用?答:W.R. Loewenstein 的实验:将染料注入用间隙连接连起来的一排昆虫细胞中的一个,然后在光学显微镜下观察,发现染料很快从一个细胞移向下一个细胞,而且比预料的要快的多。这种染料是亲水性的, 相对分子质量为 300 道

12、尔顿。他们还用类似的实验证明了离子能够自由通过间隙连接。在 Loewenstein 的实验中能够自9由通过间隙连接的最大分子是 1200 道尔顿,这说明其他的一些小的信号分子如 cAMP 和 IP3 等也能自由通过。Gilula 和他的同事们们的实验:他们用了两种培养的细胞系,一种是卵巢细胞,这种细 胞没有去甲肾上腺素的受体,所以不会对去甲肾上腺素或其他的胆碱激素作出应答。另外一个细胞系是心肌细胞,它具有这种激素的受体,并受该激素的刺激。当将这两种细胞放在一起培养时,它们很快通过间隙连接连成一体,当加入去甲肾上腺素时,不仅心肌细胞作出了应答,卵巢细胞也作出了应答。这一结果说明卵巢细胞之所以能够

13、对去甲肾上腺素作出反 应,是从心肌细胞得到了第二信使的结果。第五章细胞通讯1. 如何通过实验分离烟碱样乙酰胆碱受体并证明烟碱样乙酰胆碱受体证明具有通道偶联受体的作用?答:烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor)是研究得比较清楚的离子通道偶联受体,它存在于 脊椎动物骨骼肌细胞以及某些鱼的放电器官细胞的质膜上； 受体与乙酰胆碱结合,引起 Na+通道的开放,Na+流入靶细胞， 使得质膜去极化并引起细胞的收缩。10分离纯化乙酰胆碱受体,首先要找到一种与该受体结合的配体,然后进行受体分离。幸运的是发现了一种蛇毒毒素，使得受体的纯化成为可能。-银环蛇毒素(-b

14、ungarotoxin)是一种小分子的蛋白质， 能够选择性地并且几乎是不可逆地同乙酰胆碱受体结合。这些毒素能够阻止乙酰胆碱同受体相互作用，导致呼吸麻痹和死亡。利用放射性标记的 -银环蛇毒素可在显微镜下确定组织切片中的乙酰胆碱受体的位置,以及检查纯化的蛋白样品 中是否有受体的存在。利用 -银环蛇毒素从电鳐属电辐射鱼的放电器官细胞质膜中分离纯化了乙酰胆碱受体。结构分析发现这种受体是由 5 个亚基组成的，其中两个 亚基、一个 亚基、一个 亚基、一个 亚基， 最小的亚基 上有乙酰胆碱的结合位点。分离纯化了乙酰胆碱受体，可用人工脂质体研究其功 能。实验发现将纯化的烟碱样乙酰胆碱受体加到脂质体上， Na+

15、的通透性就增加了， 由于人工脂质体上没有其它的蛋白成分，根据这一实验推测烟碱样乙酰胆碱受体本身就是一种Na+离子通道， 也说明乙酰胆碱受体是神经递质门控离子通道。通道的开启与关闭受神经递质乙酰胆碱的调节(图 5E-1)。11图 5E-1 乙 酰胆 碱离 子通 道偶联受 体的 结构 域功能2. 请设计一个实验研究受体与配体结合的特异性。答:可采用非放射性标记的底物同放射性标记的配体竞争受体的结合位点的方法。原理是:如果结合是特异性的, 只有信号分子能够同受体结合,而与信号分子无关的分子则不能同受体结合。例如,放射性标记的胰岛素与受体的结合不会受胰高血糖素或 ACTH(促肾上腺皮质激素)的抑制,但

16、是能够被非放射性标记的胰岛素或胰岛素衍生物所抑制(图5E-2)。图 5E-2 证明激 素与 受体 结合 特异 性的 实验 12实验中,将放射性标记的胰岛素与分离的膜一起温育,同时加入各种不同浓度的胰高血糖素或 ACTH。与胰岛素无关的激素不会与放射性标记的胰岛素竞争质膜受体。通过检测放射性即可证明。3. cAMP 是如何发现的?科学家是如何证明腺苷酸环化酶在信号转导中的作用?答: 1957 年 Earl Sutherland及其同事们在研究狗肝组织中糖原是如何断裂时发现了 cAMP， 这是代谢研究的一个重要里程碑。Sutherland和他的同事们利用离体系统研究激素的生理反应,经过多次努力后,

17、他们发现胰高血糖素或肾上腺素与细胞一起温育能够激活磷酸化酶。破碎细胞并经离心分离后,分别收集颗粒和溶液,发现磷酸化酶只存在于上清液 中； 但是,如果要对激素作出应答,颗粒是必不可少的。后来的实验表明,对激素的应答至少涉及两个不同的过程。如果分离肝的匀浆液中的颗粒部分,并将分离的颗粒与激素一起温育,然后将与激素温育过的颗粒添加到上清液中,发现有某种物质的产生,这种物质能够激活磷酸化酶。Sutherland鉴定了从膜颗粒中释放出的物质是一种小分子的环状单磷酸腺苷,即 cAMP。由于 cAMP 是激素作用膜受体后释放出来的,并且能激活磷酸化酶的活性,所以 cAMP 被称为第二信使。13虽然 cAMP

18、 是第一信使作用于膜颗粒后产生的第二信使, 至于 cAMP 是如何产生的却有几种推测。最简单的推测是与激素结合的受体本身就有催化 ATP 生成 cAMP 的能力,即cAMP 是受体催化的。如此解释,就同 G 蛋白和腺苷酸酸环化酶毫无关系了。为了证明 cAMP 的产生与第一信使及 G 蛋白偶联受体膜机器的三个成员密切相关,科学家们进行了一系列实验获得了证据， 证明它们是独立的三个成员， 共同完成信号转导。Joseph Orly和 Micheal Schramm 通过细胞融合实验首先证明了受体与腺苷酸环化酶是不同的两种蛋白。用于融合实验的两个细胞中一个是带有肾上腺激素受体但缺少腺苷酸环化酶的红细胞

19、，另一个是带有腺苷酸环化酶但缺少肾上腺激素受体的肿瘤细胞。细胞融合以后，加入肾上腺激素能够产生 cAMP，而在未融合的细胞中加入肾上腺激素则不会有 cAMP 的产生(图 5E-3)。虽然证明了激素受体和腺苷酸环化酶是两个独立的成 员，但是，同受体结合的激素又是如何激活腺苷酸环化酶? 最早是通过一种称为 cyc�突变的肿瘤细胞系发现 GTP 能够增强激素对腺苷酸环化酶的激发作用。这种突变细胞具有正常的腺苷酸环化酶和肾上腺激素受体，但是用肾上腺素处理不能促进 cAMP 的生成。如果在该细胞培养基中加入从正常细胞分离的 G 蛋白,就能够恢复对 cAMP 合成的激发作用。14由于这种 G 蛋白能

20、促进(stimulating) cAMP 的合成， 故称之称为 Gs。上述实验结果令人信服地证明该系统中三个成员的存在和各自独立的作用。图 5E-3 证明肾 上腺 素受 体与 腺苷 酸环 化酶 是两个 不同 蛋白 的细 胞融 合实验 第六章核糖体与核酶1. 如何证明 RNA 聚合酶进行 5S rRNA 基因转录时, 使用的是内部启动子?答:可通过基因操作。如将 5S rRNA 基因的 5 侧的上游序列完全除去，检测转录情况,然后再切去 5S rRNA 基因15的部分内部序列,再检测转录情况。实验结果表明:将 5S rRNA 基因的 5 侧的上游序列完全除去并不影响 5S rRNA 基因的转录。

21、但是，如果将 5S rRNA 基因内部缺失一部分序列(从 50 位到 80 位缺失)，RNA 聚合酶 不仅不能转录这段DNA，甚至不能结合上去(图 6E-1)。如果将 5S rRNA 基因的内部启动子序列插入到基因组的其它部位，会使插入的部位形成一个新的转录起点。图 6E-1 RNA 聚 合酶 转录 5 S rRNA 基 因启 动子的 鉴定 将 图中 5S rRNA 基 因的 A 片 段 或 D 片 段缺 失都不 影响 RNA 聚 合 酶 的转 录, 但是 将 B 片段或 C 片 段缺失 , 都会影响 RNA 聚 合酶 的 转录 。 表 明 5 S rRNA 基 因的 启动 子位 于 5S 基

22、 因内 部的 控制 区。2. 如何证明原核生物的 16S-23S-5S 三种 rRNA 位于同一条转录的 rRNA 分子中。答:通过核酸酶 (RNase )突变体的研究证明原核生物的三种 rRNA 位于同一个原初转录物中。在这种突变体中， 三种 rRNA 位于同一条 rRNA 分子中，但是在正常的细胞中这三种 rRNA 是以三种独立的小分子存在，这一研究结果也16说明 RNase 是将 16S-23S-5S rRNA 前体切割成单体的主要核酸酶。在细菌中 RNase 不是参与 rRNA 前体加工的惟一的一种酶，还需要其它一些核酸酶参与，实验证明 如果缺少其它一些酶，得不到正确大小的 rRNA。

23、第七章线粒体与过氧化物酶体1. 请根据线粒体外膜比内膜通透性高这一特性,设计分离线粒体各组份的方法。答:将线粒体放在低渗溶液或者去垢剂毛地黄皂苷(digitonin) 中直到线粒体外膜裂开， 随着外膜的破裂,膜间隙中的物质释放到溶液中,此时线粒体内膜和基质仍结合在 一起(称为线粒体质),通过离心可将线粒体质分离。用去垢剂Lubrol 进一步处理线粒体质，破坏线粒体内膜,释放线粒体基质,破裂的内膜重新闭合形成小泡,其表面有 F1 颗粒。实验中要通过离心分离各组分,并要借助电子显微镜观察将内膜和外膜区分开来 分离的外膜看起来象空的囊， 而内膜会形成小泡，内膜自我封闭形成内膜小泡的外表面含有 F1

24、颗粒。2. 请设计一个实验证明线粒体蛋白合成之后进入了线粒体。17答:可通过基因工程和分子生物学方法进行研究，主要过程如下： 克隆线粒体基质蛋白基因; 在无细胞系统中合成酵母线粒体蛋白; 检测分离后将合成的蛋白质分成两组,一组直接加入胰蛋白酶,另一组先加入线粒体,然后再用胰蛋白酶蛋白酶处理; 结果分析:如果加入线粒体的一组中的蛋白质对胰蛋白酶具有抗性,而不加线粒体的一组中蛋白质被胰蛋白酶水解,即可证明加入线粒体后,线粒体蛋白进入了线粒体。因为胰蛋白酶是水溶性的酶,不能进入线粒体,所以对胰蛋白酶的抗性说明线粒体蛋白进入了线粒体从而得到保护。实验过程示于图 7E-1。18图 7E-1 线 粒体 蛋

25、白前体 转运 的实 验证明 3. 科学家是怎样证明线粒体基质蛋白在转运过程中穿膜中间体的存在？如何证明导序列(导肽)没有特异性?答:主要是通过离体实证实了穿膜中间体的存在,并证明导向序列对所引导的蛋白质没有特异性(图 7E-2)。首先利用 DNA 重组技术构建一个嵌合蛋白，其 N-端含有一个长为 31 个氨基酸的线粒体基质导向序列,其后接上一段间隔序列,长度为 51 个氨基酸,紧接着是 187 个氨基酸组成的小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR),该酶在正常情况下存在于胞质溶胶中,并且它的 C-末端可在分子伴娘的作用下处于非折叠状态。用无细胞系统合成的 DHFR 嵌合蛋白能够被转运到线粒体基质,然后切

26、除导向序列。氨甲蝶呤(methotrexate)是DHFR 抑制剂,它能够与嵌合的 DHFR 的活性位点牢牢地结合,使嵌合 DHFR 锁定在折叠状态而不能进入线粒体基质。但是 N-端的导向序列能够进入线粒体基质,并被水解,此时的DHFR 仍然被结合在膜上形成稳定的转运中间体。这一实验中,间隔序列的设计非常重要,如果间隔序列较短,譬如说 35 个氨基酸,就得不到稳定的转运中间体。当除去氨甲蝶呤,嵌合 DHFR 就能完全进入线粒体基质。这一实验同时证明了导肽没有特异性。19图 7E-2 线 粒体 蛋白 转运 中间 体的 证明 (a) 通 过重组 DNA 技 术构建的 嵌合 蛋白 的结 构。(b)

27、转 运中 间体 的证 明。 氨甲 蝶呤是 DHFR 的 抑制 剂, 它能够 同 DHFR 的 活性 位点结合 , 使 D HFR 不 能 解折叠, 因 而不 能穿 过运输通 道, 维持 转运 中 间 体的 状 态, 这种 状 态能够 通过电子显微镜进行 观察 。 当除去氨甲 喋呤 , 转 运 中间 体 消失 , 因为 DHFR 能够 解折叠, 从而 进入 线粒 体基 质。4. 请设计一个实验证明 ATPase 既能催化 ATP 的水解,又能催化ATP 的合成。答: 可采用来自其它膜结构中的 ATPase 作实验, 如用质膜中的 Na+/K+ ATPase。在细胞质膜中,该酶的功能是水解ATP

28、进行 K+的逆浓度梯度运输,这是该酶在细胞质膜中的惟一功能。实验采用红细胞。首先分离红细胞并在高 K+离子水溶液中制成血影,使其内部具有极高 K+离子浓度， 然后将之放入具有极高浓度的 Na+离子环境中,“细胞”内的 K+向外移动,20而 Na+向细胞内移动。这两种离子都是沿各自的浓度梯度向下移动,而不像在生活细胞中那样逆浓度梯度移动。如果在红细胞血影中加入 ADP 和 Pi 的话,离子的移动会引起 ATP 的合成而非 ATP 的水解(图 7E-3)。图 7E-3 利用 红细胞血 影和 Na+ /K + ATPa se 重组 小泡 进行 的 ATP 合 成实验图中小 写字母表 示离 子移 动的

29、 方向 。上述实验结果表明,在科学研究中，不能总是按常规思维去认识事物，反向理论也有很重要的作用。上述结果是根据酶催化反应的反向理论去认识酶的作用后发现的,同时,该实验也证明了离子梯度能够驱使 ADP 磷酸化合成 ATP。可以用这一结果预测在线粒体膜间隙中由电子传递所建立的质 子移动力可用于 ATP 的合成。实验中合成 ATP 必须满足三个条件:要有膜结合的 ATP 合酶、离子梯度、合成 ATP 的化学材料(ADP 和 Pi),这三个条件在线粒体内膜的两侧都是具备的。5. 请推测线粒体膜重建实验是如何进行的?21答:为了证明 F1 具有 ATP 合酶的作用,最好、最直接的方法是通过线粒体膜的重

30、建实验,验证其功能,即将线粒体内膜与其嵴上的 F1 颗粒分离出来,重新装配后研究 F1 的功能。实验中先分离附着有 F1 颗粒的线粒体内膜小泡,然后将小泡置于加有 NADH、ADP 和无机磷的溶液中,这些小泡能够将 NADH 的电子经由小泡膜中呼吸链逐步传递给 O2,偶联合成了 ATP。Efraim Racker 实验室第一个成功进行了含有 F1 颗粒的线粒体内膜小泡的拆装。首先分离完整的线粒体，然后用超声波处理使线粒体破裂。破裂的线粒体内膜能够自我封闭成内膜小泡,其上结合有 F1 颗粒， 然后用脲处理或用玻珠与内膜小泡一起振荡，使内膜上附着的 F1 颗粒脱落， 形成没有颗粒附着的内膜小泡，将

31、处理的样品离心后,分别收集沉淀和上清液。在显微镜下检查收集的沉淀都是表面光滑的小泡。经功能实验，这种光滑型的内膜小泡只有电子传递的功能而没有合成 ATP 的能力。实验收集的上清液中含有从内膜脱落的 F1 颗粒,经检查,这种颗粒既不能传递电子又不能合成ATP。非但如此,分离的 F1 颗粒能够水解 ATP,其功能与结合在线粒体内膜时相反。根据这一结果推测,F1 的正常功能是附着在线粒体内膜上进行 ATP 的合成,若是脱离了内膜则具有水解 ATP 的作用,因为失去了合成 ATP 所需要的能量。22这种假说得到实验的支持。将分离的 F1 颗粒与光滑的线粒体内膜小泡结合,使 F1 颗粒重新附着到线粒体内

32、膜上,这种重建的含有 F1 颗粒的线粒体小泡不仅能够进行电子传递, 而且具有 ATP 合成的能力(图 7E-4)。通过线粒体内膜重建实验,人们得出结论 线粒体内膜中的 F1 颗粒是一种 ATP 合酶，它是呼吸链上氧化(放能)和磷酸化(贮能)的偶联装置。23图 7E-4 线 粒体 内膜重建 实验 246. 请推测David Luck 通过什么样的实验证明线粒体是通过分裂增殖的?实验过程如何?答: 1965 年 David Luck 通过放射性标记实验证明线粒体分裂增殖的观点。首先将脉胞菌(胆碱缺陷突变株)培养在加有 3H 标记的胆碱(一种磷脂的前体物)培养基中,使线粒体的膜带上放射性标记。然后收

33、集放射性标记的细胞,转入非同位素的培养基中继续培养,分别在不同培养时间收集菌体,再通过放射自显影检查经过不同时期培养的细胞中同位素的分布。并预测同位素的分布应是下述三种模式中的一种:如果新的线粒体是由已有线粒体的生长和分裂而来,那么每分裂一次,线粒体中的放射性就会减少一半；如果新的线粒体是重新合成的,那么,新线粒体应该没有放射性,而老的线粒体的放射性应与原初的线粒体相同； 如果新线粒体是由其他的膜重新装配而来,那么原有的线粒体仍然保持原有的放射性,而新的线粒体在开始阶段应具有放射性,随着时间的延长,放射性会消 失。结果发现，随分裂次数的增加,放射性的线粒体数量增多,放射性均匀分布到新的线粒体中

34、,并逐渐减弱,若是重新合成,那么就应发现有未标记的线粒体。但实际上从未测到过。实验结果证明线粒体是通过分裂增殖的(表 7E-1)。表 7E-1 证明线 粒体 的生 长和 发育 方式 的同 位素标记实验结果 25标记后培养的代实测的放射性预测的的合成方式及放射性数生长和分裂重新合成膜装配12.02.0221.01.02应介于前二者之30.50.52间40.250.2527. 过氧化物酶体是怎样被发现的? 涉及哪些技术关键?答:过氧化物酶体是 de Duve和他的同事发现的,发现的过程很简单,但是实验的设计却给我们以极大的启发。de Duve 和他的同事通过梯度离心分离到溶酶体之后, 通过对溶酶体

35、酶的研究,发现至少有一种酶与溶酶体酶的性质不同:尿酸氧化酶不是酸性水解酶,尽管这种酶在离心分部时与溶酶体的酶相似。进一步研究发现在差速离心中,尿酸氧化酶与溶酶体的酶的沉降行为稍有不同,这些发现促使 de Duve决心对该酶探个究竟,因为他猜测该酶有可能来自其他的细胞器。通过等密度梯度离心技术, de Duve等终于获得尿酸氧化酶是一种新细胞器的酶的线索。通过蔗糖密度梯度离心, 发现尿酸氧化酶存在的密度区是 1.25g/cm 3,而线粒体和溶酶体分别是 1.19g/cm 3 和 1.20g/cm 3-1.24g/cm 3,由于密度差异太小,而溶酶体自身的密度范围又很宽,如何将尿酸氧化酶与溶酶体的

36、酶分开?他们根据一次偶然的实验观察,设计了一个很好的方法:用一种去垢剂 Triton WR1339 注射小鼠,这种去垢26剂在细胞内主要积累在溶酶体中,并使溶酶体的浮力密度降低到 1.1-1.14g/cm 3,这样就可以将尿酸氧化酶与溶酶体和线粒体分开。离心后部分收集尿酸氧化酶样品,经分析,收集的尿酸氧化酶的样品中还含有过氧化物酶和 D-氨基酸氧化酶,后来发现的几种酶都与 H2O2 的形成和分解有关,由于新发现的细胞器与过氧化氢有关,故此命名为过氧化物酶体。通过酸性磷酸酶和过氧化氢酶的释放实验也证明过氧化物酶体与溶酶体是两种不同的细胞器。首先分离能够释放酸性磷酸酶和过氧化氢酶的膜结合细胞器,然

37、后用去垢剂(毛地黄皂苷)破坏细胞器使之释放酸性磷酸酶和过氧化氢酶。如果这两种酶定位于同一种细胞器中,那么只要该细胞器破裂就会同时释放出这两种酶,实验结果是要加十倍量的去垢剂才能释放过氧化氢酶,这就说明溶酶体和过氧化物酶体是两种不同的细胞器,两种细胞器的膜对去垢剂的耐受性是不同的。第八章叶绿体与光合作用1. 请你设计一种方法分离叶绿体的各个组分(被膜、类囊体、基质), 并简要说明原理?答:叶绿体组份的分离首先要考虑用何种方法破碎细胞壁。27有些分离方法使用了剧烈的匀浆技术，例如通过研磨破坏细胞壁让叶绿体释放到溶液中，然后通过差速离心分离叶绿体。也可用纤维素酶或果胶酶水解细胞壁获得原生质体， 再用

38、温和的方法破坏细胞质膜， 然后通过离心分离叶绿体。用剧烈方法分离的叶绿体能够在光诱导下产生氧、ATP、NADPH、但是不能固定 CO2。在电子显微镜下观察这种有缺陷的叶绿体，发现它含有很少或者根本没有叶绿体基质，并且叶绿体外被是破损的或者没有外被,将这种叶绿体称为 型叶绿体。相比之下， 用温和方法分离的叶绿体具有完整的被膜， 将它称为 类叶绿体，它能够完成整个光合作用，包括 CO2 的固定。可以用 型或 型叶绿体作为分离叶绿体各组分的出发材料，常用 型叶绿体分离叶绿体的亚组分。将叶绿体悬浮在低渗溶液中，破裂外被，接着用等密度离心分离叶绿体基质、外被、类囊体。如果用 型叶绿体作为分离叶绿体亚组分

39、的出发材料，需要弗氏细胞压碎器(French pressure cell), 分离到组成叶绿体的亚组分之后，便可对这些组分化学组成和功能进行分析。实验流程见图 8E-1。28图 8E-1 叶 绿体 各组 分的分离用温和匀浆技术分离 型叶绿体,这种类型的叶绿体保留完整的被膜。然后在低渗条件下破坏叶绿体,使叶绿体的膜、叶绿体基质、类囊体相互分开。2. 请设计一个实验证明类囊体的 CF1 颗粒能够在 pH 梯度驱动下合成 ATP。29答:首先用温和法分离纯化含有 CF1CF0 的类囊体小泡, 将分离的类囊体置于 pH7.5的溶液中平衡后,再于暗处置于pH4.0 的溶液中,使类囊体小泡膜内外的 pH

40、平衡(pH 达到 4,0), 最后将类囊体小泡置于含有 ADP 和 Pi 的溶液中,测定 ATP 的合成,及 H+质子从类囊体小泡中输出。流程如图 8E-2。图 8E-2 CF1 利用人工 pH 梯 度合成 ATP 3. 什么是卡尔文循环? 是如何发现的(实验要点)?答: 卡尔文通过实验发现的 CO2 在光合作用中被固定的一种途径, 由于这一途径中 CO2 的固定是一个循环过程, 并且是卡尔文发现的, 故称为卡尔文循环。30二次世界大战之后,美国加州大学贝克利分校的Melvin Calvin 和他的同事们使用 14C 示踪和双向纸层析技术,研究一种藻:Chlorella 在光合作用中怎样固定

41、CO2,。他们将培养的藻生长在含有未标记 CO2 的密闭容器中, 然后将标记的 CO2 注入培养基,培养合适时间后,将培养的藻浸入热的乙醇中,这种处理有三种功效:杀死细胞、终止酶的作用、提取溶解的分子。然后将提取物点在层析纸上进行双向纸层析,最后通过放射自显影分析放射性斑点,并同已知化学成份进行比较。在卡尔文的实验中,发现标记的 CO2 转变成有机物的速度很快,几秒钟之内,在层析纸上就有放射性的斑点,经测定, 斑点中的化学成份是三磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate,PGA),是糖酵解的中间体。由于被鉴定到的第一个中间体是三碳分子,所以将 CO2 的这种固定途径称为 C3 途径,将

42、通过这种途径固定 CO2 的植物称为 C3 植物。最终的研究结果发现, CO2 固定的 C3 途径是一个循环过程,称为C3 循环,由于这一循环是卡尔文发现的,故又称卡尔文循环, 可分为三个阶段:羧化、还原和 RuBP 的再生。第九章内膜系统与膜运输1. Jamws Jamieson 和George Palade 是如何用同位素示踪技术研究胰泡细胞中蛋白质分泌的?31答:胰腺系统中胰泡细胞具有最发达的内膜系统,主要功能是合成消化酶类。这些酶类合成之后要从胰腺系统经由导管分泌到小肠中行使功能。这些酶是如何分泌出去的? Jamws Jamieson和 George Palade 使用放射自显影技术得

43、到了答案。他们将一小块胰腺组织放在加有放射性同位素标记氨基酸的培养液中进行短暂培养，在此期间,活细胞就会摄取具有放射性的氨基酸并掺入到核糖体合成的消化酶中,然后立即将组织进行固定,通过切片和放射自显影检测,发现放射性出现在内质网,说明蛋白质的合成始于内质网。为了检查蛋白质合成后的运输路线,他们还进行了一系列脉冲追踪实验(pulse-chase experiment),即将组织置于加有放射性同位素标记氨基酸的培养液中进行短暂培养，然后将组织洗净再置于无同位素的培养基中培养不同时间再进行组织固定和放射自显影术检测。检测的结果表明 追踪培养的时间越长， 同位素标记的蛋白离开合成部位越远,分泌蛋白在内

44、质网合成后转移到经高尔基体,再转移到分泌小泡和细胞外(图E9-1)。32图 E9-1 蛋白质 分泌 的同 位素 示踪 实验 示意 图(a) 细胞与 同位 素接触 3 分 钟之 后, 标记 物出 现在 内质 网中 ; ( b) 细胞 接触 同位 素 3 分钟 后, 置 于非 同 位 素的 培养 基中 “ 跟 踪” 17 分 钟, 放 射性 标记出 现 在 高 尔 基体和 部 分分泌 泡 ; (c) 细胞 接触 同位 素 3 分钟 后, 置于 无同 位素的培养基中“ 跟踪 ” 117 分 钟, 标记物 主要出现 在分 泌泡 中。 2. 如何利用利用微粒体在无细胞蛋白质合成系统中的合成实验证明膜结合

45、核糖体合成的蛋白质进入了微粒体的腔。答:实验设计要考虑三个问题: 分离有功能的结合有核糖体的微粒体; 要用同位素标记新合成的蛋白质; 要能使蛋白质合成提前终止,防止成熟之后被降解。二十世纪六十年代,Colvin Redman和David Sabatini 用分离的 RER 小泡研究膜结合核糖体合成的蛋白质是否会进入 RER 的腔,他们的实验要点是:将 RER 微粒体置于加有放射性标记氨基酸的蛋白质合成体系中进行短暂温育,然后加入嘌呤霉素，使蛋白质合成提前中止并从核糖体中释放出不完全的多肽。此时离心收集RER 小泡,用去垢剂将 RER 小泡破坏,使小泡内的物质释放出33来,并对其进行分析,结果表

46、明,从破裂的 RER 小泡中释放出来的物质中有放射性标记的新合成的多肽(图 9E-2)。图 9E-2 证明膜 结合 核糖 体合 成的 蛋白 质进入 R ER 腔 的实验 3. 请你设计一个离体实验证明 SRP 和 SRP 受体的功能。34答:实验中首先要分离 SRP、SRP 受体和微粒体,并要有克隆的分泌蛋白的基因,然后在无细胞蛋白质合成系统 中进行蛋白质合成实验。主要做法是:在无细胞翻译体系中如果不加 SRP、SRP 受体、微粒体， 分泌蛋白只能合成一条带有信号序列的完整多肽；如果加入SRP、但不加入 SRP 受体和微粒体， 新生肽的合成在完成70-100 个氨基酸时被阻断,因为 SRP 已经与信号序列结合并中止了蛋白质的翻译,但由于找不到受体,SRP 不能被释放,所以蛋白质不能继续合成； 如果反应体系中加有 SR