第八章抗生素分析课件.ppt

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1、第八章,抗生素类药物的分析,第一节 概述第二节 抗生素效价微生物检定法第三节 抗生素药物的分析,世界各国实际应用的抗生素有300多种，我国药典中收载的品种有200多种。生物发酵，化学纯化，精致，化学修饰等过程，最后制成制剂，结构，组成更复杂。化学纯度低，有三多：同系物多，异构体多，降解物多。发酵过程不易控制。生产工艺复杂易受污染。分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用。活性产物易发生变异。,一、抗生素药物的特点,第一节 概述,二、抗生素类药物的检查项目,抗生素的检查项目是由抗生素的生产、用途、毒副作用等决定的。一般来说，各种抗生素及其制剂的性质及工艺不同，检查项目也不同。注射剂

2、型检查项目多、要求严；口服剂型、外用药检查项目少、要求松。,第一节 概述,鉴别试验：用物理化学方法判定抗生素真伪相关物质的检查：抗生素产生过程中产生的中间体、副产物、贮存过程中的降解产物(TC ETCEATC)酸碱度检查：保证产品的稳定性和适用于临床应用水分的检查：限制水分，以免水解反应溶液澄清度检查：限制不溶性杂质,检查项目：,第一节 概述,无菌检查：检查有无杂菌异常毒性试验：限制产品中的致毒物质热源试验：限制产品中的致热物质降压物质检查：限制产品中降低血压的物质效价检查：检查抗生素含量与活性其它检查：检查抗生素各组分之间的比例（GMC），比旋度检查(TC ETC)、熔点检查(羟氨苄青霉素)

3、、晶型检查（金霉素、利福平）、溶剂残留量（甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、二氯甲烷等等）,第一节 概述,其中无菌试验的目的是检查药物是否染菌。有抑菌作用的药物的微生物限度检查，应该先将抗生素活性灭活，或者除去抗生素，这样才能使制品中所污染的杂菌在培养基中生长出来，才能判定是否染菌。,去除抗生素影响的办法很多，但是又要保证杂菌不被杀死，一般有以下方法：,第一节 概述,青霉素酶法：青霉素酶先与青霉素类药物作用一段时间，使其水解b-内酰胺环部分而灭活，对细菌无抑杀作用。这种方法只对青霉素有效，特异性高。盐酸羟胺法：链霉素与盐酸羟胺反应生成链霉污，可使链霉素失活。只对链霉素有效，特异性高。树脂法：以无菌的

4、钠型树脂与碱性抗生素的水溶液混合，放置，抗生素被交换吸附到树脂上，而被去除，杂菌则留在中性或者偏碱性的水溶液中，这样取流出液作无菌检查。无菌滤膜过滤法：将抗生素水溶液通过无菌滤膜，抗生素被除去而杂菌被截留在滤膜上。取此滤膜作无菌检查。这种方法应用最广，但是操作过程中不得引入其他杂菌，以免错误判断。,第一节 概述,三、抗生素效价的标示量,1.效价定义：早期抗生素产品往往不是纯品，因此无法用重量单位表示其活性。因此，为了与临床上应用原理保持一致，以抗生素的抑制或者杀死细菌的能力作为衡量抗生素活性的指标，这个指标就叫做效价，即以效价的高低作为抗生素质量的标示。,通常，新发现的抗生素在初期尚未得到纯品

5、时候，常常用上述方法来确定效价，或者用性质相近的已知抗生素作为标准来衡量其效价。,第一节 概述,最早确定效价的抗生素是青霉素，其效价单位定义是：在实验条件下，能完全抑制50ml肉汤培养基中金黄色葡萄球菌标准菌株生长的青霉素的最低含量为一个效价单位，即一个牛津单位，也叫做一个生物活性单位。链霉素的效价单位：能完全抑制1ml肉汤培养基中大肠杆菌标准菌株生长的链霉素的最低含量为一个效价单位。,第一节 概述,随着抗生素分离纯化技术的不断提高，现在已经能制备纯净的抗生素，可以用重量来表示其效价。,首先制备出纯净的抗生素为苄青霉素钠（PcGNa）,1949年国际联盟卫生组织通过试验证明，1mg PcGNa

6、能够抑制83300ml肉汤培养基中的标准金黄色葡萄球菌标准菌的株生长，即相当于1mg PcGNa=1667u（83300/50），1u PcGNa=0.6ug。,第一节 概述,2.抗生素的效价标示方法：,重量单位：以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（纯游离碱或游离酸）的重量1微克作为1单位，即1毫克=1000单位。如链霉素硫酸盐、土霉素盐酸盐等均以重量单位表示。用这种方法表示，对不同有机酸根的同一抗生素，只要单位一样或有效部分重量一样，则这一抗生素的各种盐类虽然称重不同，但实际有效含量是相同的。这样标示的抗生素有：红霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、氯霉素、新生霉素、利福霉素SV。,第一节 概述

7、,类似重量单位：以特定的纯抗生素制品盐的重量，规定1毫克1000单位，其中包括了无抗菌活性的酸根在内，如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）。这种类似重量单位，虽然并不合理，但在国际上已经习惯沿用。,第一节 概述,重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的某一重量为效价单位而加以折算。如第二次青霉素国际标准品（1952年）青霉素G钠称重0.5998微克为1单位，即1毫克=1670单位，那么80万单位的青霉素G钠称重应为0.48克。虽然青霉素G制品现已完全可用化学或物理方法检验其含量，但仍广泛使用效价单位的表示方法。,第一节 概述,特定单位：以一特定量的抗生素标准品（或对照品）作为1单位。如第一

8、批杆菌肽国际标准品（1953年）杆菌肽A为1毫克=55单位。制霉菌素（1963年）为1毫克=3000单位等。这类抗生素的效价单位的精确定义很难确定，折算效价也难以计算，只能以国际标准品的效价单位，作为比较的基准。,第一节 概述,半合成新霉素、头孢菌素类药物纯度较高，化学结构确定，规定原料药按照整个分子计算其百分含量。（同其他化学合成药物）稀释单位：抗生素不纯时，不能用重量表示其效价，只能用稀释单位来标示抗生素的生物活性。用于新抗生素的初期研究,第一节 概述,四、抗生素标准品,绝大多数抗生素效价采用微生物检定法。要使用到标准品。标准品是具有一定物理、化学性质及生物活性的物质。分为国际标准品和国家

9、标准品。,国际标准品是由英国伦敦生物标准检定所负责标准品原料的挑选、理化分析、分装和分发等。国际标准品效价的标定由世界卫生组织邀请有条件的国家检定所或者药厂实验室分别进行效价测定，然后通过统计分析，考察标定结果的误差与真实性，最后由生物检定专家委员会确定效价。我国自1976年参加了部分品种的国际协作标定。,第一节 概述,国内标准品是由国际标准品来标定的。我国的抗生素标准品是由中国药品生物制品检定所负责标准品原料的挑选、理化分析、分装和分发等。各种标准品都有一定的有效期，新制备的标准品开始发放，上一批的标准品停止使用。,第一节 概述,第二节 抗生素效价微生物检定法,一、抗生素效价测定方法,又叫微

10、生物检定法，是各国药典收载的法定方法。它是以抗生素的抑制、杀死细菌的能力作为衡量效价的标准,物理测定法,化学测定法,生物测定法,生物测定法优点：1）检测原理与临床应用原理一致，检测的结果能代表其杀菌、抑菌活性2）灵敏度高，用量极少，ug级，是其他方法所不及的3）使用范围广，即可用于较纯的精品，也可用于粗品，对已知抗生素和位置抗生素都适用。只要按照操作规定，既可以一次测定其总效价，而不需要分离纯化。生物测定法缺点：1）操作步骤多2）测定时间长3）误差大。,第二节 抗生素效价微生物检定法,物理、化学法测定效价是根据抗生素分子结构特点，利用其特有的物理或者化学性质及反应而进行的测定。优点：操作简单、

11、方便、省时、具有一定的专属性。缺点：1）只能对结构清楚、纯度高的已知抗生素有效2）对未知的新抗生素，或者在发酵生产中未提纯的样品无法测定。只有当用物理化学方法所测定的结果与生测结果相同时，才能用该法测定抗生素药物的效价，这是临床上的要求。,第二节 抗生素效价微生物检定法,第二节 抗生素效价微生物检定法,发展趋势：随着对抗生素分子结构的逐步认识，用物理化学方法测定效价的应用日渐增多。如我国现有几种抗生素（庆大霉素、青霉素、氯霉素、灰黄霉素）使用HPLC测定其含量，而且还分别要求了其中各个组分的含量范围，为更好的控制其毒性提供了监督手段。各国药典收载的抗生素，除了上述提及以外，其他均用微生物效价检

12、定法。,第二节 抗生素效价微生物检定法,二、抗生素效价微生物检定法（生测法）,原理：以抑制或者杀死细菌的能力作为检验标准。是将供试液和标准液两者抗菌能力进行比较。,分类：稀释法比浊法扩散法,第二节 抗生素效价微生物检定法,1.稀释法 抗生素微生物效价测定最简单的办法,操作方法：在一系列试管中用液体培养基逐管将抗生素做2倍稀释，并于各个试管中加入同量的对该抗生素高度敏感的试验菌液，将各个试管放置于3724小时，观察能抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为测定终点。同法测定抗生素标准品终点，作比较，即可求出被测定抗生素的效价。计算公式 A=(T/S)C A:供试品效价 T：供试品最大稀释倍数 C：标准品

13、效价 S：标准品最大稀释倍数注意：这种方法终点判定比较困难，误差较大，因此不是药典收载的方法，只适用于最小抑菌浓度的测定。,第二节 抗生素效价微生物检定法,二、比浊法,原理：细菌生长产生的浊度与细菌数量、群体质量（生长期、衰老期）及细菌细胞容积之间存在相关性，在一定范围内符合Beer定律。操作方法：同稀释法相似。放置于37 2-4小时，加入甲醛溶液（12%），摇匀（抑制细菌生长），用分光光度法测定530nm透光率或者吸收度，用标准曲线法（先用标准品作一条标准曲线），测定供试品效价。标准曲线测定：每个浓度测定3次,第二节 抗生素效价微生物检定法,空白：未接种试验菌的液体培养基9ml+蒸馏水1ml

14、+12%甲醛溶液0.5ml先测定各浓度3只试管吸光度，求平均值，绘制标准曲线再测定供试品3只试管吸光度，求平均值，查标准曲线，计算效价。该法比较简单，准确，日英美等国家药典收载，我国药典不收载。,第二节 抗生素效价微生物检定法,三、扩散法,原理：该法是采用固体琼脂培养基，在融化后凝固前接入试验菌（多为细菌），倒平板。等凝固后，根据量反应平行线原理，用不同的试验设计方法，将供试品和标准品接触于含菌的培养基表面，经培养后，由于抗生素向培养基内部扩散，凡抑菌浓度所达到的地方都没有细菌生长“抑菌圈”。通过比较标准品和供试品抑菌圈的大小测定抗生素的效价。,第二节 抗生素效价微生物检定法,分类：垂直扩散法

15、平面扩散法 依靠总量扩散 纸片法 依靠浓度扩散 管蝶法,管蝶法是国际通用的抗生素效价测定法，为各国药典所收载，中国药典只收载管碟法。它灵敏度高，所需要样品少，但是操作复杂，时间长，影响结果因素多，因此要从多个环节加以严格控制，才能保证试验结果与真实值接近.,第二节 抗生素效价微生物检定法,1.管蝶法测定效价的原理、操作及公式推导,原理：利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内扩散，形成一定浓度的含抗生素的球形区，抑制了试验菌的生长繁殖而呈现出透明的抑菌圈，并且在一定的范围内，抗生素浓度对数剂量与抑菌圈面积或者直径成正比。在同样条件下，将同质的已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液同时测定，

16、标准品溶液与供试品溶液对一定试验菌所得到的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。通过比较两者抑菌圈的面积或者直径，利用公式，求得供试品效价。,第二节 抗生素效价微生物检定法,根据原理设计出一剂量法（标准曲线法）：适用于实验室研究的初级阶段，因为本身误差大，不要求很准。二计量法：各国药典收载，常用于抗生素产品的效价测定，法定方法。三计量法：用于抗生素标准品效价的测定，准确度最高，操作最复杂。美国药典收载三种方法，中国药典 1985 年后仅收载后两种方法，并且均规定要对测定的数据进行统计处理。,一剂量法 二计量法 三计量法,第二节 抗生素效价微生物检定法,公式推导：将不锈钢小管放置在摊布特定实

17、验菌（检定菌）的琼脂培养基平板上，当向小钢杯内滴加抗生素溶液后，抗生素分子就随着溶剂向培养基内呈球形扩散。同时将培养基平板置于培养箱内37培养，试验菌开始繁殖。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度随着离开小管的距离增大而降低，当抗生素分子扩散到T时间，这时琼脂培养基内抗生素的浓度恰好等于该抗生素对试验菌的最小抑菌浓度，试验菌的生长繁殖受到抑制而出现透明的抑菌圈。在抑菌圈边缘处，琼脂培养基中所含有抗生素的浓度即为该抗生素对该试验菌的最小抑菌浓度。,第二节 抗生素效价微生物检定法,2.二计量操作方法,1)标准品溶液的制备、保存 见药典附录2)培养基及其制备方法 见药典附录3)采用的检定菌4)供试品溶液的

18、制备按照各药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度,第二节 抗生素效价微生物检定法,第二节 抗生素效价微生物检定法,第二节 抗生素效价微生物检定法,5）操作步骤：管：不锈钢小管（内径6.0mm0.1mm，高10.0mm0.1mm，外径7.8mm0.1mm），重量要求一致，内外壁洁净，不得粘有其他抗生素。摊布底层培养基：融化后，倒入平皿中（直径约90mm、高1617mm）。底层20ml，冷却凝固。摊布上层培养基：融化后，冷却至45-55（芽孢可至60），加入试验菌，倒入平皿中。菌层5ml，冷却凝固。放置不钢杯，滴加抗生素溶液与供试品溶液稀释液。,第二节 抗生素效价微

19、生物检定法,SH/SL=2:1 或者4：1；S3/S2/S1=1：0.8:0.80.8盖陶瓦盖：防止培养过程中水滴回落到培养基或者小管中，3716-18小时。测量抑菌圈：手工或者抑菌圈测量仪测量抑菌圈的直径（或面积）。计算效价：带入公式计算，抑菌圈测量仪自动计算。照生物检定统计法（附录）中的（2.2）法进行可靠性测验及效价计算。本法计算所得效价，如低于估计效价的90或高于估计效价的110时,则应调整其估计效价，予以重试。除另有规定外，本法的可信限率不得大于5。,第二节 抗生素效价微生物检定法,要求：二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在1822mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌

20、圈直径在1518mm。注意：不同的国家，同一种抗生素，使用的检定菌不完全相同。,三、影响管蝶法效价测定结果的因素及其控制,影响抑菌圈形状的因素及控制,出现抑菌圈破裂、不圆（椭圆或不正常形态），其原因：,稀释抗生素的缓冲液PH值及盐浓度制备琼脂菌层时，加菌时培养基的温度测试用实验器材洁净程度培养温度其他,第二节 抗生素效价微生物检定法,1）稀释抗生素的缓冲液PH值及盐浓度有些抗生素溶液，若PH值低或者盐浓度高，就会出现不显抑菌圈或者呈椭圆或不正常形态，这可能是因为抗生素分子的解离状态发生了改变，从而抑菌作用受影响。四环素、链霉素都会出现这种现象。2）制备琼脂菌层时，加菌时培养基的温度温度高，试验

21、菌被烫死而造成无圈。解决办法：依据实验菌的生理特性，将融化的培养基放在不同温度的恒温水浴中，待温度平衡后，加入试验菌。3）测试用实验器材洁净程度如果测试用的玻璃平皿、小钢杯、镊子等先被抗生素污染，可能出现抑菌圈不完整的现象。,第二节 抗生素效价微生物检定法,4）培养温度培养温度不均匀，造成试验菌生长快慢不均匀，抑菌圈不圆。培养温度不均匀，抗生素的扩散系数不同，抑菌圈不圆。解决办法：培养箱内要温度均一，平皿放在同一层内，不要过多开启培养箱 5）其他抗生素滴加到小钢杯外，或者溅到小钢杯外，抑菌圈不圆。小钢杯底部与培养基表面接触不严，漏液，抑菌圈不圆。小钢杯放置太近，抑菌圈扩散到一起，抑菌圈不圆。平

22、皿内培养基厚度不同，抑菌圈不圆。,第二节 抗生素效价微生物检定法,第二节 抗生素效价微生物检定法,2.影响抑菌圈边缘清晰度的因素及控制,抑菌圈不清楚，模糊、不光滑、锯齿、双圈，其原因是：,试验菌放置时间过长菌层中含菌量过低 培养基原材料的影响 培养基pH值及盐浓度的影响 培养时间的影响,第二节 抗生素效价微生物检定法,1）试验菌放置时间过长试验菌放置时间过长，菌群内一些菌株生理特性有改变，如生长速度不同（有先长，后长），或者对抗生素敏感度不同，从而出现双圈，抑菌圈边缘不圆。这是由于C变化 r2改变（lgM=1/9.21DT*r2+lgC*4DTH）。解决办法：定期对实验菌纯化，试验菌必须是纯种

23、的，使其处于同一生理状态。在挑取单菌落的时候，球菌要取光滑型，芽孢杆菌挑取粗慥型，传斜面。斜面培养好后，用无菌水洗下菌苔，过滤。芽孢要60-65处理30分钟。镜检观察，单个菌分散度在90%以上。,第二节 抗生素效价微生物检定法,2）菌层中含菌量过低抑菌圈边缘不清，含菌量高，抑菌圈太小，影响灵敏度。解决办法：在正式实验前，找出最适菌浓。解决办法：预实验 3）培养基原材料的影响蛋白胨、酵母膏、琼脂等都能影响抑菌圈的大小与清晰度。实验发现，蛋白胨选取鱼胨、骨胨、鸡肉胨要好于肉胨、蛋胨。酵母膏中含有维生素B，不仅影响试验菌的生长，还影响某些抗生素的抗菌活性。如氯霉素效价测定，培养基中含有维生素B,抑菌

24、圈较为清晰。琼脂的质量与加量能影响抑菌圈的质量。不同琼脂的机械强度、凝固点、杂质种类和数量等等都不同，都会对试验菌的生长以及抗生素在琼脂培养基内的扩散系数，导致抑菌圈的模糊不清，不圆等现象。,第二节 抗生素效价微生物检定法,4）培养基pH值及盐浓度的影响调节培养基的PH或者适量增加盐浓度可以使抑菌圈清晰。如碱性抗生素在偏碱性的培养基和缓冲液中，抗菌活性强，抑菌圈清晰。如酸性抗生素在偏酸性的培养基和缓冲液中，抗菌活性强，抑菌圈清晰。庆大霉素、新霉素缓冲液中增加3%的NaCl，使分子扩散加快，抑菌圈大而清晰。,第二节 抗生素效价微生物检定法,5）培养时间的影响 不适当的延长双蝶的培养时间，使抑菌圈

25、边缘不清，这是因为某些抗生素只是抑制试验菌的生长，当继续培养时，细菌总量增加，抗生素随着时间的延长而降解，抑菌圈边缘的细菌便会向圈内生长，致使抑菌圈变小，边缘不清。,3.标准品与供试品的质要相同,效价计算公式是以标准品与供试品的质相同为前提推导而来的，因此在操作的时候要确保这一点。如标准品与供试品要相同，稀释用的缓冲液（PH、盐浓度）要相同。如供试品中含有某种可能影响效价测定的杂质，那么在标准品溶液中要相应的添加这种杂质，以抵消影响。如盐酸四环素制剂中含有维生素C，则标准品种也要添加维生素C,第二节 抗生素效价微生物检定法,4.抗生素最后稀释浓度与抑菌圈直径的关系,由公式lgM=1/9.21D

26、Tr2+lgC4DTH 得出，抗生素最后稀释液的浓度与抑菌圈半径平方值之间在一定的剂量范围内呈直线关系（剂量反应直线）。为了简化计算过程，常以直径代替半径平方来计算。如果供试品的效价估计不准，仍可用半径平方来计算，这样线性范围宽一些。如果抗生素在实验过程中，最后稀释浓度发生变化（如抗生素被破坏或被培养基中某些杂质吸附，被试验菌吸附等等），都能使计量反应直线的距离缩短。解决办法：调节稀释用的缓冲液pH值、培养基pH值、去除某些杂质、选取灵敏度高的试验菌等,第二节 抗生素效价微生物检定法,5.直线的斜率与截率,由公式lgM=1/9.21DTr2+lgC4DTH得出，如果斜率1/9.21DT 小，r

27、大；抗生素的剂量稍作改变，r变化很大，灵敏度高。若使1/9.21DT小 D大，T大D:与抗生素分子量（固定）、培养基成分、缓冲液PH、盐浓度、琼脂含量、试验菌量及试验菌是否吸附抗生素有关.T:控制培养基成分或者降低培养基PH，使其偏酸（PH4.5），生长缓慢。降低温度（铺好菌的双蝶预先冷却在滴加抗生素，或者滴加抗生素后，室温放置半小时以上，再放入恒温培养箱中。）但是培养时间过长，抗生素可能要分解，对抑菌圈清晰度与实验准确度都有影响.,第二节 抗生素效价微生物检定法,截距 lgC4DTH小，对于一定剂量的抗生素来说，抑菌圈变大，灵敏度高。除了DTC对截距有影响外，H（培养基厚度）也是重要的影响因

28、素。,由此可见，H 1/2H抑菌圈直径增大，灵敏度高，这是薄层法测定微量抗生素浓度的原理。如血液中、食品、制剂中抗生素，样品经过高度稀释后，杂质、辅料的影响减少，可以较准确地测定抗生素的含量,第三节 抗生素药物的分析,、-内酰胺类抗生素,（一)鉴别1、生物学鉴别法-青霉素酶法实验2、化学法-呈色反应、沉淀反应、有机胺盐反应3、光谱法-IR法、UV法、核磁共振光谱4、色谱法-TLC、HPLC(二)检查1、聚合物2、有关物质和异构体3、杂质吸收度的检查(三)含量测定1、碘量法2、电位配位滴定法（汞量法）3、HPLC,青霉素类,典型的内酰胺类抗生素,特点：含有-lactam ring;四氢噻唑或者二

29、氢噻嗪环,头孢菌素类,1、生物学鉴别法青霉素酶法实验原理：用青霉素酶水解青霉素类抗生素而失去抗菌活性，再用对青霉素类抗生素敏感菌金黄色葡萄球菌试验其是否丧失抗菌活性，即是否发生水解反应，如果已失去抗菌活性，证明供试品已被酶水解，供试品为青霉素类药物。本试验需要同时作对照实验，即取供试液与标准液，一部分用酶灭活，另一部分保存。同时使用滤纸片测定生物学活性。经过灭活的不应有抑菌圈，而未经灭活的有抑菌圈。,2.化学法,1）呈色反应羟肟酸铁反应,2)呈色反应类似肽键的反应,茚三酮反应,（开环分解）,似肽键,3）呈色反应-双缩脲反应,蓝紫色,4）呈色反应-与变色酸-硫酸反应青霉素 阿莫西林 氨苄西林,活

30、泼“-CH2-”,（分解）,变色酸,显色,1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸,1,8-二羟基-3,6-萘二磺酸,5）呈色反应-与重氮苯磺酸反应 头孢哌酮酚羟基,（偶合）,6）呈色反应-与H2SO4-HNO3反应,头孢菌素类,7）呈色反应-与铜盐反应,橄榄绿色,NaOH,专属反应,9）沉淀反应,遇酸,有机溶剂中溶解,10）有机胺盐反应,重氮化-偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,普鲁卡因,普鲁卡因青霉素,与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,mp,三硝基苯酚,3.光谱法,1）IR法2）UV法3）核磁共振光谱,阿莫西林的红外光谱图,-内酰胺环,酰胺,青霉素,Cu2+,头孢氨苄 max=262nm,青霉素

31、V钠 A280nm/A264nm=1.301.50,取本品，加醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH3.8，制成50ug/ml的溶液，取10ml，水浴加热，以未加热的共试品为空白。测定，吸收度0.6。,4.色谱法 对照品对照法,1）TLC法,2)HPLC法,二、检查（一）聚合物 中国药典规定，头孢曲松，哌酮，噻肟需检查聚合物。用HPLC，以他啶为例。,对照溶液的制备 取对照品适量，精密称定，加水制成100ug/ml溶液，摇匀。,测定法 取供试品适量，精密称定，加水制成，20ug/ml进样。含聚合物不得超过头孢他定的0.3%。,（二）有关物质和异构体 头孢氨苄中有关物质的检查（反相TLC法）头孢氨苄以青霉素钾

32、为原料，经氧化、扩环、裂解得7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA），再与侧链a-苯甘氨酸缩合而成。这两种原料有可能成为主要杂质。用茚三酮显色，a-苯甘氨酸和7-ADCA斑点显橙黄色。,（三）杂质吸收度的检查 青霉素钠（钾）：取本品，加水，1.80mg/ml。280nm不得大于0.10，264nm应为0.80-0.88。264nm的吸收值用来控制青霉素钠（钾）的含量。280nm的吸收用来控制杂质。,四、,三、含量测定,ChP,利用其分子本身不消耗碘，而降解产物消耗碘，用剩余碘量法测定，以标准对比法计算。,（水解）,原理,水解产物,定量过量,剩余,反应分两步进行：水解反应(按化学计算量进行)氧

33、化-还原反应(无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),第一步,第二步,例,注射用普鲁卡因青霉素 含量测定,取装量差异项（药典附录P7）下的内容物，精密称取约0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟，,再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，摇匀，在2025暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，,至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至

34、蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，,在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。,V样空,V样,V对空,V对,2.方法,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂 质的干扰C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,空白,样品,Na2S2O3,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环 境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定 法一致,3.条件（

35、1）弱酸性 pH4.5碱 I2 IO3-+I-酸普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐沉淀（2）温度 2426温度38 未水解的供试品亦消耗碘,（3）水解时间以水解20分钟后的耗碘量最大（4）反应时间反应20分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误差。,（1）灵敏度高,样品:碘=1:8,（2）反应条件、实验操作要求高,4I28I-,4.特点,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,5.计算 原料,降解产物或杂质可消耗碘而影响测定，因此用未经水解的样品做空白。碘量法是青霉素族的经典的测定方法。,（钠盐）,-内酰胺类,ChP,中和,中和,例,苯唑西林钠 含量测定,取本品约0.5g，精密称定，加新

36、沸过的并用0.01mol/L氢氧化钠溶液中和至酚酞指示液刚显红色的水20ml，使溶解,再用0.01mol/L氢氧化钠溶液中和后，,精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)25ml，摇匀，置水浴中加热20分钟，注意避免吸收空气中的二氧化碳，冷却后，加酚酞指示液12滴，用盐酸滴定液,（0.1mol/L）滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于40.14mgC19H19N3O5S。,（1）水解前先中和溶剂和样品,（2）加热时避免吸收CO2,不能使酚酞变红,（3）空白试验校正(消除Na2CO3干扰),（4）特点 简便快速，不适用于有残留酯的产品,（水解）,C

37、hP 青霉素族,（三）电位配位滴定法（汞量法）,样品,以未经水解的样品作空白测定,例,苯唑西林钠 含量测定,取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，,照电位滴定法(附录 A),用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在3540，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定，,（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于8.029mg的总苯唑西林(按C19H19

38、N3O5S计算)。,另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上。,每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于8.029mg的降解物（按C19H19N3O5S计算）。总苯唑西林的百分含量与降解物的百分含量之差值即为苯唑西林的含量。,3、讨论（1）水解必须完全（2）空白试验 消除已降解产物干扰（4）优点 不需标准品（2）反应摩尔比 1:1,4、计算,（1）原理,（咪唑）,ChP 青霉素族,（五）可见-紫外分光光度法1、硫醇汞盐法,（2）方法,对照品法,计算,pH 9,例,氨苄西林钠

39、含量测定,取本品约60mg 置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml，置25ml量瓶中，加硼酸缓冲液2.5ml与醋酐的乙腈溶液（150）0.25ml，放置5min后，加咪唑溶液至刻度，摇匀，置60水浴,中，加热30min，取出冷却，照分光光度法（附录 A），在325nm的波长处测定吸收度；另取氨苄西林三水合物标准品，按同法测定，计算，即得。,（3）讨论,咪唑催化的水解产率高，硫醇汞盐稳定（3h）,b.侧链有-NH2时，需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述反应,（4）特点,A、简便快速B、用标准品对照，重现性良

40、 好，RSD1%,（水解）,稳定剂,青霉素族,2、酸水解法（铜盐法）（1）原理,（2）方法,（3）特点,实验条件随各药物稳定性不同而定,标准品对照法,（4）计算,红色,-内酰胺类,NaOH,3、羟肟酸比色法,（六）HPLC法 头孢菌素类内标法校正因子 外标法,特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）,第三节 氨基糖苷类抗生素,链霉素 双氢链霉素新霉素 卡那霉素庆大霉素 巴龙霉素,链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉素,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺,庆大霉素,绛红糖胺,紫素胺,

41、2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1=R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,（一）碱性与溶解性多与硫酸成盐,溶解性：水溶性,链霉素 pH57.5庆大霉素 pH212,坂口反应,N-甲基葡萄糖胺反应,麦芽酚反应,二、鉴别,（一）茚三酮反应 羟基胺结构,取庆大霉素5mg水1ml，0.1%茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml,吡啶0.5ml,水浴加热5min,显紫色。,（二）Molisch试验具有

42、五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸或硫酸作用下脱水，成糠醛（五碳）或羟甲基糠醛（六碳糖）。这些产物遇a-萘酚或蒽酮成色。,乙酰丙酮,OH-,吡咯衍生物,对二甲氨基苯甲醛,H+,红色,（Elson-Morgan反应）,（三）N-甲基葡萄糖胺反应,红色,链霉糖特有反应,（四）麦芽酚（Maltol）反应,紫红,麦芽酚,链霉胍特有反应,8-羟基喹啉,-萘酚,H+,（八）光谱法 IR法,庆大霉素无UV吸收,UV法,方法 TLC中的对照品法（BP）,1.来源 反应中间体,三、特殊杂质检查及组分分析,（一）链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）杂质,（二）硫酸奈替米星(乙基西索米星)中有关物质

43、的检查（略）,发酵菌种不同工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量,ChPUSPBPJP,（三）庆大霉素C组分的测定,max=330nm,1.衍生化原理,1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物,规定 C1 2550%C1a 1540%C2a+C2 2050%,3.计算 峰面积归一化法,2.方法 RPHPLC,四、含量测定1.微生物检定法管碟法 参照药典附录操作。如链霉素：试验菌：枯草芽孢杆菌（63501）培养基：I 稀释用缓冲液Ph7.8-8.0,最终稀释浓度 0.6-1.6u/ml,2.HPLC方法（庆大霉素组分测定）,利用庆大霉素C组分结构中的伯氨基同邻苯二醛、巯基醋酸在pH10.4硼酸盐缓冲液

44、中反应，生成1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物，在330nm波长处有强吸收。,三、四环素类抗生素,A,B,C,D,四环素（TC）tetracycline,金霉素(CTC)chlortetracycline,氯四环素,土霉素(OTC)oxytetracycline,氧四环素,多西环素(DOTC)doxycycline,脱氧土霉素,美他环素（METC）metacycline,一、结构与性质,（一）酸碱性与溶解度 两性,具有吸湿性，多含结晶水,pH3 7.5 荧光,（二）旋光性,（四）与金属离子络合,1.差向异构化,淡黄黑,蓝色荧光,（五）不稳定性,差向四环素,（土霉素、多西环素不易差向异构化）,（

45、1）酸性下降解,max=445nm,max=435nm,橙黄色,2.降解反应,脱水四环素,TC,ETC,ATC,EATC,（2）碱性下降解,（荧光）,二、鉴别试验,EDTA 克服痕量金属造成的 拖尾现象,（三）TLC法薄层色谱,（四）HPLC,UV,4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）,HPLC法（2000版）,标准品对照法,三、特殊杂质的检查 盐酸四环素,四环素有关物质TLC图,4,0.5,0.5,2,杂质吸收度,四、含量测定,ChP、USP,HPLC法（外标法）,系统适用性试验 1.防护柱2.预试溶液4-差向脱水四环素四环素3.RSD2

46、.0%,JP 比色法（标准曲线法）,原理,四、大环内酯类抗生素的分析,大环内酯类抗生素的结构特点是以一个大环内酯环（亦称糖苷配基）为母核，通过糖苷键与13个糖基（中性糖或氨基糖）相连接而构成的。易溶于有机溶媒，在酸性溶液中苷键易水解，在碱性溶液中内酯环易破裂。,柱晶白霉素,1、呈色反应1）硫酸反应 该类抗生素遇硫酸即显红棕色反应2）Molish反应 在酸性条件下，该类抗生素的脱氧氨基己糖脱水形成糠醛，与-萘酚反应形成紫色化合物。3）Seliwanaff反应 该类抗生素在酸性下，醛酮糖脱水形成糖醛衍生物，与间苯二酚反应形成不同颜色的化合物。EM呈淡黄色；SPM呈亮紫红色，再加丁醇，丁醇层显亮紫红

47、色；碳霉素呈深青紫色；LM呈极淡青色，加入丁醇，丁醇层无色。,（一）鉴别,2、薄层色谱 色谱条件见表8-6、8-7。3、光谱学鉴别 1）紫外吸收光谱 该类抗生素在200nm-300nm处有特征性的紫外吸收峰，一般不受杂质的干扰，可用于化学鉴别。2）红外光谱 该类抗生素的内酯环中的内酯羰基、共轭双键具有特征吸收，可用于鉴别。表8-9列出两种抗生素的红外光谱特征。,包括一般杂质的检查和有关物质、安全性试验等。以EM-A检查为例，在发酵过程中，还产生EM-B和EM-C，但是抗菌活性只有EM-A的30-60%，故要控制EM-B和EM-C的含量。,（二）检查,红霉素 取本品，加无水乙醇制成每1ml 中含

48、20mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加无水乙醇稀释成每1ml 中含1.5mg 的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取上述两种溶液各2l，分别点于同一薄层板上，以二氯甲烷醋酸乙酯甲苯乙醇浓氨溶液(3:4:2:1:0.15)为展开剂（浓氨溶液在临用前加入），展开后，晾干，喷以显色液（取硫酸铈1g与钼酸钠2.5g，加10硫酸溶液使溶解成100ml），置105 加热数分钟，至出现蓝色斑点。供试品溶液如显杂质斑点，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。,微生物效价检测法管碟法（参照药典附录操作）试验菌：短小芽孢杆菌（CMCC(B)63202培养基：I，稀释用缓冲液Ph7.8,最终稀释浓度 5.0-20.0u/ml37 培养14-16小时,（三）含量测定,