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1、第八章,种质保存与鉴定技术,1,主要内容,?,种质资源的作用与现状,?,种质资源的类型与特点,?,种质资源的收集与保存,?,种质资源的评价与利用,?,种质资源的创新,?,种质鉴定技术,2,种质资源的定义,?,种质（,germplasm,）：指决定生物性状遗,传（种性），并将其遗传信息从亲代传递,给后代的遗传物质，也称为基因,3,?,种质资源（,germplasm resource,）,具有种质并能繁殖的生物体的统称。或,遗传资源或基因资源。,?,种质库（,germplasm pool,）,：指以种为单,位的群体内的全部遗传物质，它有许多个体,的不同基因所组成。又称基因库。,4,?,种质资源,包
2、括：栽培或养殖种、野生种,及近缘种，人工创造的种质材料。,?,蕴藏种质的主要材料是：,植物：植株,、种子，根、茎、叶、芽,等无性繁殖器官和营养器官，及愈伤组织、,分生组织、花粉、合子、细胞、原生质体,等。,动物：精子、卵子、受精卵等,。,其他：,染色体和核酸片段等。,5,1.1,种质资源的作用与现状,1.1.1,种质资源的作用,?,种质资源是地球生命的基础。,?,是人类赖以生存和发展的基础，是最为,宝贵的自然财富。,?,是利用和改良生物的物质基础，是育种,的原始材料及生命科学研究的基础材料。,6,一个基因或者一个物种可以影响一个,国家的有关的经济发展；一个优良的生,态群落的建立可以改善一个地区
3、的环境。,实例：,?,野生稻雄性败育基因,?,矮杆基因（绿色革命）,?,白蝶贝、砗磲、麒麟菜、海草、大型藻类海带,?,提供食物、各种工业原料、医药品，在,娱乐、旅游业中也起着重要作用。,?,拥有种质资源的,数量和质量,，以及对其,研究的程度,是决定育种效果的重要条件，,也是衡量一个国家或研究单位育种水平,的重要标志。,8,生态系统多样性,生态系统多样性,1.1.2,种质资源的现状与存在问题,1.1.2.1,发展理念的误区造成种质资源的,遗传侵蚀,?,人类对品种良种化和遗传一致性的要求，,使传统的品种被改良品种所取代，并使之,加速灭绝。减少了种质资源遗传多样性。,?,更大的一致性倾向或遗传单一性
4、增加了主,要海水养殖种类对流行性病虫害潜在的遗,传脆弱性。,11,生物多样性保育的紧迫性,?,地质史上已发生过,5,次自然大灭绝,(Wilson,1989),原因：,地质变化和大灾变；,?,地球又一次进入大灭绝时期,，,当代物种灭绝,速度比自然灭绝速度快,1000,倍,(Wilson,1989),！,?,有花植物中约有,5,10,的物种处于,受威胁或濒危之中（陈心启等,1998,）,?,1,个物种灭绝可能影响到几十个物种,的生存。,1.1.2.2,人类活动及现代科技的发展,对种质资源的影响,?,人类对资源的需求日趋增长，逐渐造成生态,环境的破坏和生物资源流失。,?,海洋生态环境的严重破坏与污染
5、，过度捕捞，,高密度养殖，使大量海洋野生动物、植物失,去栖生、繁衍的场所。,13,?,沿海城市的发展以及沿海海岸带的不科学,开发，使土壤、水源和大气的污染。潮间带,与海岸带植被的破坏加剧了海洋生态环境的,恶化，反过来又导致了海洋生物资源的进一,步流失，形成了恶性循环。,?,现代科技的迅猛发展产生了某些负面的影,响。化学肥料和农药的大规模使用，造成大,量种质资源减少；生物工程的安全性等。,B,14,1.2,种质资源的类型和特点,种质资源的类别,：,?,按其来源分类,本地的种质资源,外地的种质资源,野生的种质资源,人工创造的种质资源,15,1.2,种质资源的类型和特点,种质资源的类别,：,?,按其
6、来源分类,?,亲缘关系分类,动植物学分类：科、属、种,16,1.2,种质资源的类型和特点,种质资源的类别,：,?,按其来源分类,现代优良品种或高产品种、主,要商品品种、次要品种、具有,?,亲缘关系分类,特长的、过时类型、育种材料、,?,育种实用性分类,突变体、原始类型和野生种等,类型。,17,1.2,种质资源的类型和特点,种质资源的类别,：,?,按其来源分类,?,亲缘关系分类,?,育种实用性分类,?,生态类型分类、用途分类,?,种质资源的类型及性质来分类：地方品种、,核心养殖品种、原始养殖类型、野生近缘种和,育种材料,。,18,1.2.1,地方品种,?,指那些在局部地区内养殖的品种，或原,始品
7、种,?,是长期自然选择和人工选择的结果。特,定的适应性和抗逆性强,?,适合当地特殊的饮食或观赏习性和养殖,习性,?,大多没有经过现代育种技术的改良。,19,?,有些材料虽有明显缺点，但往往具有某,些罕见的特性，以及具备一些在目前看,来虽然并不重要的特殊经济价值,?,往往因优良新品种的推广而被淘汰（特,别是过时的或极为零星分散的品种）,?,是最重要的，具极大遗传价值和育种潜,力的种质资源,。,20,1.2.2,核心养殖品种,?,经由现代育种技术改良过的品种，或称改良品种。,?,遗传多样性较地方品种单一，即基因库较狭窄。,?,适应当前新的消费习惯和生产方式。,?,具有较好的丰产性和较广的适应性及抗
8、逆性。但外,地或外国引入的品种对本国（地）的特殊气候条件,的适应性差于本国（地）的核心养殖品种。,?,它们是育种的基本材料。,21,1.2.3,原始养殖品种,?,具有原始农业性状的类型。是现代海水养殖的原,始种或参与种，是经数千年的发展而产生的。,?,不少原始类型已经绝灭。现今往往要在人们不容,易到达的地区才能搜集到。,?,基因库丰富，对本地区的自然条件适应性更强。,?,是难得的育种材料。,22,1.2.4,野生种及近缘种,?,野生种是生物进化长期自然选择的的结果,?,海水养殖近缘种是介于人工养殖品种和野生类,型之间的不同程度的过渡类型是先人人工选择,的成果。,?,具备生物多样性，常带有养殖品
9、种所缺少的某,些抗逆基因，在育种上往往作为抗源资源加以,利用。,23,1.2.5,人工育种材料,?,各种育种途径的中间材料。如这种材料可以是杂,种后代、物理化学诱变育成的突变体，人工诱变,的多倍体、体细胞融合材料、远缘杂交材料、转,基因材料等等，有人称之为育种中间材料。,?,虽然它们具有某些缺点，而不能成为新的品种，,但因具有一些明显的优良性状，仍不失为一种优,良的亲本或种质资源。,?,这类材料，因育种工作的不断发展会日益增加，,这样会大大丰富种质资源的遗传多样性。,24,1.3,种质资源的搜集与保存,1.3.1,种质资源的调查,1.3.1.1,种质资源调查的目的和意义,?,摸清当地的海洋生物
10、资源，可以直接或间接地,应用于生产。,?,为海水养殖发展规划或品种区域化提供资料。,?,编写海洋生物志，或整理成文献。为资源的搜,集、保存和研究利用提供了信息。,25,1.3.1.2,种质资源调查的主要内容,?,地区情况调查,:,社会经济和自然,(,地形、气象、土壤、植被等,),?,海洋生物资源概况调查,:,养殖史，种类、品种的分布，繁育方,法和养殖模式，生产、利用中存在的问题和提出的要求。,?,养殖种类品种调查,:,记载种类和品种的一般概况，生物学特性，,形态特征，经济性状以及某些潜在的可利用价值等。,?,标本资料采集和制作,:,对植物的根、茎、叶、花、果等器官进,行录相或绘图，成分分析和标
11、本的制作。对动物的实体进行,固定、保存，并进行录相或绘图，成分分析和标本的制作。,?,资源调查整理和总结,做好最后的资料整理和总结分析工作。,26,1.3.2,种质资源的搜集,1.3.2.1,种质资源搜集的一般原则,?,根据需要和目的，有针对性地搜集种质资源。,?,对需要的种质资源要采用一切必要途径进行搜集。,如，通讯联系、现场引种。组织考察队进行搜集。,?,苗种的搜集要遵照苗种的调拨制度。要求质量高、,典型、有生活力，以便繁殖和保存。一定要注意检,疫。,?,搜集时应由近及远，从本地到外地，逐步进行搜集。,?,集时要做到细致、无误、分类，不重复、不遗漏。,27,1.3.2.2,种质资源搜集的方
12、法,（,1,）当地种质资源的搜集,主要是当地的优良品种或品系，不,用鉴定或生态适应等问题，,只要采用适,当的材料就地保存即可。,28,1.3.2.2,种质资源搜集的方法,（,1,）当地种质资源的搜集,（,2,）野生种质资源的搜集,?,必须搜集本属内每个种的野生个体，获取属内,全部的有利基因,。,?,搜集区域应注重种类丰富的遗传多样性中心和,经常出现某些特异性状的地区。,?,搜集时间以繁殖期和成熟期为宜，有利于对材,料的繁殖习性和经济性状等性状的鉴定。,?,搜集这类种质时应注意某些特定性状，特别是,经济性状和抗性。,29,1.3.2.2,种质资源搜集的方法,（,1,）当地种质资源的搜集,（,2,
13、）野生种质资源的搜集,（,3,）外地种质资源的搜集,是指从国内外其它地区引入种质资源，简单引,种或驯化引种。,?,搜集时要调查两地生态环境，一般来讲，驯化,引种必须搜集苗种。,?,搜集时一定要严格遵守检疫和编号登记制度,?,搜集后的外地种质要多点试验，再进行大规模,推广。,?,30,1.3.3,种质资源的整理,?,搜集到的种质资源将样本对照现场记录，,进行初步整理,?,归类，将同物异名者合并，将同名异物,者予以订正。,?,给以科学的登记和编号，包括统一编号、,品种名称、原产地、来源地、保存单位，,或用以查找重复和定位号等项目以便为,保存和进一步研究提供依据。,31,1.3.4,种质资源的保存,
14、?,是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源。,防止资源流失，便于研究利用。,?,保存的种质资源主要包括以下几个方面：,（,1,）核心养殖品种、地方品种、过时品种、原始养殖,类型、野生近缘种、育种材料等。,（,2,）可能灭绝的稀有种和已经濒危的种质，特别是养,殖品种的野生祖先。,（,3,）尚未很好改良利用，但具有潜在利用价值的种质。,32,?,种质资源保存的方式,（,1,）就地保存,指在海洋生物生长所处的自然环境中采取措,施，来保护和保存种质资源，建立自然保护区。,如海草自然保护区、白蝶贝自然保护区、麒麟菜,自然保护区以及红树林自然保护区等等。,（,2,）迁地保存（种植保存、资源圃保存）,
15、指将海洋生物由原产地或次生地迁离，养殖,在特定的环境条件中加以保存。,33,34,（,3,）种质保存,建立以自然保护区或人工苗种场为主要形式海洋生物,种质资源库，这是目前中海洋生物种质资源保存中,应用最,普通的资源保存方法。,35,（,4,）离体保存,离体条件下，保存生物体的细胞、组织或器官等方式,保存种质资源。,最适合的植物：顽拗性植物、水生植物和无性繁殖植物,的种质资源离体保存。,36,（,4,）基因文库保存,从生物体中提取大分子量的,DNA,，用限制性内切酶将,其切成许多,DNA,片段。然后再通过载体把该,DNA,片段转移,到繁殖速度快的大肠杆菌中去，通过大肠杆菌的无性繁,殖，产生大量的
16、、生物体中的单拷贝基因。,不仅可以长期保存该物种的遗传资源，而且还可以通,过反复的培养繁殖、筛选，来获得各种基因。,B,37,1.4,种质资源的评价与利用,1.4.1,种质资源的鉴定,?,对搜集保存的资源进行全面的性状鉴定,和研究，作出科学评价。可以说知之越,深则用之越当。,?,种质资源鉴定技术经历了从外部形态到,内部生化，最后深入到,DNA,的三个研究,层次。,?,目前，种质资源鉴定技术正朝着综合化、,自动化、计算机化的方向发展。,38,表,1-2,种质资源鉴定技术分类,研究层次,形态学,鉴定依据,形态特征,鉴定方法、技术,生殖细胞形态特征鉴定法,幼体形态特征鉴定法,成年个体形态特征鉴定法,
17、养殖性状鉴定法,染色体计数鉴定法,染色体核型鉴定法,生殖细胞解剖鉴定法,消化系统解剖鉴定法,荧光鉴定法,荧光扫描图谱鉴定法,生殖细胞电镜扫描鉴定法,电阻、电导率鉴定法,备注,直观、经济,养殖学,细胞学,解剖学,养殖性状,染色体特征,组织构造特征,分辨率低,标记少,分辨率低,物理学,荧光特性,超显微结构特,征,电导性,分辨率低,标记少,稳定性差,39,表,1-2,种质资源鉴定技术分类（续表）,生理学,生理反应,激素反应敏感性鉴定法,稳定性差,光周期反应鉴定法,稳定性差,缺矿质元素反应鉴定法,标记少,色谱鉴定法,层析鉴定法,酚类染色鉴定法,碘化钾鉴定法,次生物质鉴定法,同工酶电泳鉴定法,醇溶蛋白电
18、泳鉴定法,谷蛋白电泳鉴定法,RFLP,技术鉴定法,RAPD,技术鉴定法,SSR,技术鉴定法,AFLP,技术鉴定法,原位杂交技术鉴定法,多态性低,多态性低,多态性低,多态性低,多态性较强,化,学,化学成分,生物化学,蛋白质生,化特性,DNA,序列,差异,分子生物,学,多态性高,精度高,标记多,40,1.4.2,种质资源的评价,?,在搜集、保存、研究鉴定种质资源的基础上，,对种质资源进行恰如其分的评价，是有效合,理地利用种质资源的重要前提。,?,评价涉及到多层次的研究领域，需要多个学,科协作完成，国际标准化以及编码化的种质,资源的评价体系和有效的操作程序。,41,基因库,所基因库,外单位赠予,生长
19、,繁殖,研究所,研究所,自然搜集,计算机化数据室,计算机化数据室,登记,复份样品送,其它长期保,存中心,交流,性状,描述,全面,评价,学科评价,遗传学,细胞学,植物化学,生理学等,经济性状,评价,抗病性,抗逆性,品质鉴定,42,基因库登记资源的评价及操作程序,1.4.3,种质资源的利用,?,海洋生物资源的直接利用,如许多野生种、近缘野生种经过鉴定评,价后直接用作海水养殖品种。,?,海洋生物资源的间接利用,可以作为育种原始材料加以利用。特别,是近缘野生种综合性状较差或很差，但往往有,着某些潜在的育种利用价值，如抗病性很强等,特性。,43,1.5,种质资源的创新,?,种质创新（,germplasm
20、 enhancement,）泛指人们利用,各种变异，通过人工选择的方法，根据不同目的而创造,成的新作物、新品种、新类型、新材料。,?,广义的种质创新除了上述含义外还应包括种质拓展,（,germplasm development,），指使种质具有较多的,优良性状，如将高产与优质结合起来；以及种质改进,（,germplasm improvement,）泛指改进种质的某一性,状。,?,狭义的种质创新是指对种质做较大难度的改造，如通过,远缘杂交进行基因导入，利用基因突变形成具有特殊基,因源的材料，综合不同类型的多个优良性状而进行聚合,杂交。种质资源研究中所进行的种质创新，一般指的是,狭义的种质创新。,
21、44,?,种质创新已成为创造新材料、新类型的种质资源学的,内容，因此又称作,预育种,。种质创新是种质资源有效,利用的前提和关键，是生物育种发展的基础和保证。,?,新种质创造的希望在于野生种质生物技术开发利用。,?,创造重要的和关键性的基础研究材料是种质创新的重,要任务。,?,随着生物技术、海洋生物育种、农业生产的发展，种,质创新工作的内涵和外延越来越专，其拓宽的领域越,来越大，其创新量也越来越大。,45,二、种质鉴定技术,-,分子遗传标记,（,Molecular Genetic Marker,）,46,什么是遗传标记？,遗传标记（,genetic marker,）：指可追踪染色体、,染色体某一
22、节段、某个基因座在家系中传递的任,何一种遗传特性。,它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；,因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作,为遗传标记。,47,遗传标记的类型,形态学标记（,morphological marker,）,细胞学标记,(cytological marker),生化标记,(biochemical marker),分子标记,(molecular marker),：,DNA,分子遗传,标记，或,DNA,标记。,48,形态学标记,形态标记即个体的外部形态特征。,形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多数,有限、多态性较差，表现易受环境影响，并且有,一些标记与不良性状连锁。
23、此外形态标记的获得,需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。,主要在早期使用。,49,细胞遗传标记,细胞学标记即植物细胞染色体的变异。,包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着,丝粒位置等）和带型（,C,带、,N,带、,G,带等）的变化。,与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重,要基因的染色体或染色体区域定位。,但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来,培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏,感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。,50,生化标记,生化标记包括同工酶和等位酶标记。,同工酶是指一个以上,基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的,不同等
24、位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是电泳和组织,化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。,生化标记具两个方面的优点：,一是表现近中性，对生物经,济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，,受环境影响较小。,生化标记的应用有限：,一是可用标记数量少，二是染色方法,和电泳技术有一定难度。,51,分子标记,分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种,差异特征的,DNA,片段，它直接反映基因组,DNA,间的差,异。分子标记的优越性表现为：（,1,）直接以,DNA,的,形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均,可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否,等问题；（,2
25、,）数量极多，遍布整个基因组，可检测,座位几乎无限；（,3,）多态性高，自然界存在许多等,位变异，无须人为创造；（,4,）表现为中性，不影响,目标性状的表达；（,5,）许多标记表现为共显性的特,点，能区别纯合体和杂合体。,52,分子标记的三个阶段,随着分子生物学技术发展和研究水平的深入，分,子标记的发展经历了三个阶段，也称为三代,DNA,分子标记。,第一代分子标记：,RFLP,；,第二代分子标记：微卫星（,ms,）；,第三代分子标记：,SNP,；,53,目前的分子标记类型,目前的分子标记有三类：,第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，,包括,RFLP,、,DNA,指纹技术（,DNA Fing
26、erprinting,）、原位杂交,（,in situ hybridization,）等；,第二类是以,PCR,为核心的分子标记技术，,包括,RAPD,、,简单序列重复标记,SSR,或简单序列长度多态性（,Simple,sequence length polymorphism,简称,SSLP,标记）、扩展片段,长度多态性标记,AFLP,、序标位,STS,、序列特征化扩增区域,SCAR,等；,第三类是一些新型的分子标记，,如：,SNP,标记、表达序,列标签,EST,标记等。,54,1,、,RFLP,基本原理：,特定生物类型的基因组,DNA,经限制性内切酶切,后，产生分子量不同的同源等位片段，再通
27、过电泳的方法分,离和检测这些片段。,55,特点：,（,1,）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（,2,）,无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（,3,）共显性，,可区分纯合子和杂合子；（,4,）结果稳定、可靠；（,5,）,DNA,需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。,56,2,、,RAPD,基本原理：,用一个（有时用两个）随机引物（一般,8-10,个,碱基）非定点地扩增基因组,DNA,，然后用凝胶电泳分开扩增,片段。,RAPD,标记的特点有：,（,1,）不需,DNA,探针，设计引物也,无须知道序列信息；（,2,）显性遗传（极少数共显性），不能,鉴别杂合子和纯合子；（,3
28、,）技术简便，不涉及分子杂交和放,射性自显影等技术；（,4,）,DNA,样品需要量少，引物价格便,宜，成本较低；（,5,）实验重复性较差，结果可靠性较低。,57,3,、,AFLP,基本原理：,AFLP,标记是选择性扩增基因组,DNA,酶切片段所,产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶,切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长,度不同被检测出来。,AFLP,标记的特点有：,（,1,）由于,AFLP,分析可以采用的限,制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产,生的标记数目是无限多的；（,2,）典型的,AFLP,分析，每次反,应产物的谱带在,50-100,条之间
29、，所以一次分析可以同时检测,到多个座位，且多态性极高；（,3,）表现共显性，呈典型孟德,尔式遗传；（,4,）分辩率高，结果可靠；（,5,）目前该技术受,专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。,。,58,4,、微卫星标记,ms,基本原理：,ms,是一类由几个（多为,1-5,个）碱基组成的基序,串联重复而成的,DNA,序列，其长度一般较短，广泛分布于基,因组的不同位置，如（,CA,）,n,、（,AT,）,n,、（,GGC,）,n,等重复。,不同遗传材料重复次数的可变性，导致了,SSR,长度的高度变,异性，这一变异性正是,SSR,标记产生的基础。,ms,标记的特点有：,（,1,）数量丰富
30、，广泛分布于整个基因,组；（,2,）具有较多的等位性变异；（,3,）共显性标记，可鉴,别出杂合子和纯合子；（,4,）实验重复性好，结果可靠；（,5,）,由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此,其开发有一定困难，费用也较高。,59,5,、序列标签位点,STS,基本原理：,STS,是指基因组中长度为,200-500bp,，且核苷酸,顺序已知的单拷贝序列，通过,PCR,可将其专一扩增出来。其,基本原理是，依据两端序列，设计合适的引物，进行,PCR,扩,增，电泳显示扩增产物多态性。,STS,标记的主要特点有：,（,1,）标记来源广，数量多；（,2,）,共显性遗传，可区分纯合子和杂合子；（
31、,3,）技术简便，检测,方便；（,4,）与,SSR,标记一样，开发依赖于序列分析及引物合,成，成本较高；（,5,）多态性常常低于相应的,RFLP,标记。,60,6,、染色体原位杂交,染色体原位杂交技术,是,DNA,探针与染色体上的,DNA,杂交，,并在染色体上直接进行检测的分子标记技术，现在常用的是,荧光原位杂交（,FISH,）技术。,61,分子标记技术的应用,1,遗传多样性与种质鉴定,2,分子遗传图谱的构建；,3,重要经济性状相关基因的定位,4,分子标记辅助选择,5,重要经济性状的图位克隆,62,基本概念,标记辅助选择,（,marker assisted selected,，,MAS,）是,指与特定的数量性状相关的遗传标记为工具，以标记信息,作为辅助信息，对该数量性状进行选择，以在育种中获得,较大的遗传进展。,图位克隆,(map-based cloning),：目标基因在染色体遗,传图谱及物理图谱中的位置，采用染色体步移法,(chromosomal walking),进行基因克隆，称为图位克隆。,63,
