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1、选修1生物技术实践第一部分 微生物的利用实验1大肠杆菌的培养和分离一、大肠杆菌1大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，为兼性厌氧的肠道杆菌。2用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。二、本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。本实验用LB液体培养基（通用的细菌培养基）扩大培养大肠杆菌，培养后用LB固体平面培养基进行划线分离。三、 细菌的培养和分离1细菌的培养：（1）繁殖方式：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20min分裂一次。（2）培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用
2、接种环来转移带菌的培养物。2细菌的分离分离的方法与特点：划线分离法：操作简单。（接种环）涂布分离法：操作复杂，单菌落更易分开。（玻璃刮刀）四、灭菌操作1灭菌操作的原因：获得纯净的培养物的关键是防止外来杂菌的入侵污染。2无菌操作的条件：（1）各种器皿必须是无菌的。（首要条件）（2）各种培养基必须是无菌的。“细菌喜荤，霉菌喜素”细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压。在中性偏碱的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。在中性偏酸的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。如果培养基中有葡萄糖
3、，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力（90 以上）灭菌30min.3灭菌的方法：是指杀灭病原微生物的方法。 （1）灼烧灭菌（2）干热灭菌：160-170 下加热1-2h。（3）高压蒸气灭菌：100kPa、121 (1kg/cm2)下维持15min.（4）过滤灭菌：G6玻璃砂漏斗过滤（用于有些不能加热灭菌的化合物，如尿素加热会分解）4消毒的方法：是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法（1）煮沸消毒法：100煮沸5-6min（2）巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min（3）化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源（4）紫
4、外线消毒五、大肠杆菌的培养和分离实验1实验步骤：（1）培养基灭菌：将50mlLB液体培养基、50mlLB固体培养基加上封口膜和培养皿用牛皮纸包好进行高压蒸汽灭菌。（封口膜的作用是既通气又不使菌进入）（2）倒平板：将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上，打开紫外灯和过滤风（3）接种：接种环接种，在37振荡培养12h（4）划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，接种环只在菌液中蘸菌液一次，然后在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿，将培养皿倒置，放在37恒温培养箱中培养12-24h，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落。（5）菌种保存：用接种环取出单菌落，用划线法接种在斜面上，37培养24h后，置
5、于4冰箱中保存实验2分离以尿素为氮源的微生物一、脲和脲酶1脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。2脲酶：有些细菌可以尿素为氮源，这些细菌含有脲酶（1）可降解尿素的酶（2）作用原理：细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚红指示剂变红。二、实验设计及步骤1实验中的对照设置：实验组：以全营养LB固体培养基进行培养（蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，水）对照组：以尿素固体培养基进行培养（葡萄糖，氯化钠，K2HPO4，酚红，琼脂糖，水）加入通过G6玻璃漏斗过滤（使之无菌）的10ml尿素溶液（内含2g脲）2实验步骤：（1）制备培养基：将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯旁分别倒入两
6、个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。（2）制备细胞悬液：用1g土样配制不同浓度的细胞悬液（加无菌水稀释）。（3）用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭。在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。（4）培养：倒置培养皿，在37恒温培养箱中培养24-48h（5）观察：培养基中的菌落数。实验4果汁中的果胶和果胶酶一、果胶1化学组成：半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯2作用：（1）植物细胞壁的主要成分（2）将植物细胞粘合在一起（去掉果胶植物组织变得松散）3鉴别方法：果胶不溶于
7、酒精二、果胶酶1来源：黑曲霉、苹果青霉等微生物2作用：3应用：（1）应用原理：水解果胶，使水果组织的分散性加大。（2）果汁生产：提高出汁率和澄清度。三、探究制作果汁的最佳条件实验流程：95%的乙醇用于检验是否有果胶如果有浑浊（或者沉淀），说明果胶还没有被完全水解。如果澄清，说明果胶被完全水解实验6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测一、酶1功能：是生物体内各种化学反应的催化剂2特性：专一性和高效性3应用的特点：在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。二、固定化酶1概念：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。2酶固定化的方法：吸附法、共价偶连法、交
8、联法、包埋法等。将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。三、-淀粉酶的固定化1固定化原理：利用吸附法将-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成这里使用的是枯草杆菌的-淀粉酶，其作用的最适温度为5075；最适PH为5.57.52固定化过程：（1）在烧杯中将5mg-淀粉酶溶于4ml蒸馏水中（由于酶不纯，可能有些不溶物）。（2）再加入5g石英砂,不时搅拌（3）30min后装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4ml)（4）用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游
9、离淀粉酶,流速为1ml/min3步骤：（1）淀粉溶液流经固定化酶柱：将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱。（2）接取流出物：在流出5ml后接收0.5ml流出液。（3）流出物的鉴定：加入12滴KI-I2溶液,观察颜色.用水稀释1倍后再观察颜色。（4）洗涤、保存固定化酶柱：用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱,放置在4冰箱中保存。（5）几天后取出冰箱中该固定化酶柱，再重复上述实验,看是否有相同的结果。（可重复使用）控制流速的目的是使淀粉溶液与淀粉酶充分接触。洗涤固定化酶柱的目的是洗去残留的反应物和产物。实验8 果酒及果醋的制作一、用葡萄制作
10、葡萄酒1实验原理：（1）与制作葡萄酒有关的微生物：酵母菌（2）制作葡萄酒所需原料：葡萄（3）制作原理：酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵C6H12O6 2CO2 + 2C2H5OH（4）当培养液中乙醇的浓度超过16%时，酵母菌会死亡。2实验步骤：（1）冲洗：洗净成熟葡萄，并在高锰酸钾溶液中浸泡，然后用水洗净。（2）榨汁：用榨汁机以低速将葡萄打成浆状（3）制作酵母悬液：干酵母加水制成糊状，加少许（一小撮）蔗糖，混匀，放置片刻，至酵母悬液中出现气泡。（4）装入发酵瓶：将葡萄浆放入发酵瓶中，装量不要超过2 / 3，然后加入酵母悬液，搅拌均匀，瓶上加软木塞或橡胶塞，塞上带有弯曲玻璃管（加水，防止O2进入，
11、空气中杂菌污染）。（5）酒精发酵：在25-30C条件下放置2-3天，若温度偏低，则发酵时间延长；若温度高于30C，要采取降温措施，否则酒的风味不佳。（6）过滤、分装、保存：用两层纱布过滤发酵液，除去葡萄皮和籽。同时可以用洗干净的手挤压滤渣，以获得尽可能多的葡萄酒，分装到1-2L细口瓶中，加盖密封，静置。待沉淀后，上清液即为葡萄酒。用这种简单工艺制造的葡萄酒，常温下可保存1-2年。二、用果汁制作果酒1制作果酒材料（1）苹果（最好）、梨、柑橘或其他水果（2）新鲜酵母或干酵母2实验步骤：（1）制取果汁：苹果切成大块，放在多功能榨汁机打碎，用两层纱布过滤果汁（2）配料（以1L为例）：向2L发酵瓶中加2
12、00g蔗糖，然后倒入果汁，转动发酵瓶使蔗糖完全溶解，最后倒入酵母悬液（约1g干酵母），混匀，加盖。（3）发酵：3天后可见气泡，10天后剧烈的发酵停止，此时即可取出果酒过滤和分装。（4）静置：静置5-6个月，上清液即为果酒，可用虹吸法取出三、用果酒制作果醋实验原理：（1）与制作果醋有关的微生物：醋化醋杆菌如能获得醋化醋杆菌的菌种，可在下列液体培养基中培养繁殖，配方：1L中含蛋白胨3g，酵母提取物5g，甘露醇25g（2）制作原理：醋杆菌在有氧的条件下才能将乙醇氧化为醋酸。醋杆菌所产生的醋酸可使培养液中醋酸的含量高达13%。C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O2实验步骤：（1）连接发酵
13、装置：在装置的甲瓶中加入800mL酒水混合物（用铝箔将上口盖住）。装盒的乙瓶（发酵瓶）中装入锯末（八分满），下口用双孔橡胶塞连接发酵瓶和外界空气及锥形瓶（丙瓶）。（2）加入醋化醋杆菌：将适量醋化醋杆菌的培养物加在200mL酒水混合物中混匀，并将pH调至7.0后倒入乙瓶中，使锯末均匀湿透。（3）发酵并检测pH ：将水族箱通气泵的出气管与乙瓶上塞棉花的玻璃管相连,通气.不必太快，发酵48h,检测PH,若明显酸性,则进入下一步.（4）调节活塞，控制流量：调节甲瓶下口的双通活塞和乙瓶下口的螺旋夹，保持液体流量相同。（5）检测pH，监控发酵情况：每天用pH试纸检测流出液的pH，直至pH不在减少，或者甲瓶
14、中的液体全部流入乙瓶时，停止实验。实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定一、泡菜腌制1有关微生物：泡菜制作时起主要作用的微生物是假丝酵母和乳酸菌。2泡菜制作原理：在无氧的条件下，微生物利用菜种的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质，其中也有亚硝酸（HNO2）。3泡菜制作流程：（1）预处理：将菜洗净并切成小块，洗净泡菜坛，并加热水洗内壁。（2）加料入坛：将蔬菜、盐水、糖、白酒、调味品等放入坛内。如果希望发酵快些，可以将蔬菜在开水中浸1min后入坛，再加一些白酒（抑制杂菌生长）。（3）密封发酵：将坛口用水封好（防止外界空气进入），腌制1周。（加入泡菜汁更好，相当于接种已经扩增的发酵菌
15、，减少腌制时间）（4）成品。二、亚硝酸盐的定量测定1亚硝酸盐测定原理：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。2亚硝酸盐的定量测定流程：（1）样品处理：泡菜25g及少量泡菜汤打成匀浆过滤，用氢氧化钠（NaOH）将pH调至8.0，再加入25ml硫酸锌至产生白色沉淀，水浴加热至60C，过滤取滤液定容至500ml。（2）测定：10ml样品溶液，加入4.5ml氯化铵缓冲液、2.5ml 60%乙酸溶液和5ml显色液，定容至25ml，暗处静置25min，用
16、光程为1cm的比色杯在550nm处测定光密度值。（以10ml水为空白对照）（3）标准曲线的绘制：取0、0.5、1.0、3.0、5.0ml亚硝酸钠标准溶液，分别放在25ml定量瓶中，各加入4.5ml氯化铵缓冲液、2.5ml 60%乙酸溶液和5ml显色液，定容至25ml，暗处静置25min，用光程为1cm的比色杯在550nm处测定光密度值。以亚硝酸钠质量为横坐标，以光密度值（OD值）为纵坐标，绘标准曲线。（4）计算： X1= m21000 V1 / m1 1000 V2 式中：X1样品中亚硝酸盐含量 单位：mg/kgm1样品中亚硝酸的含量 单位：gm2标准曲线中亚硝酸盐含量 单位：ug V1 样品
17、处理液总体积。 V2 测定用的样品处理液体积。 实验11 植物的组织培养一、植物组织培养1概念：取一部分植物组织，如叶、芽、茎、根、花瓣或花粉等，在无菌条件下接种在三角瓶中的琼脂培养基上，给予一定的温度和光照，使之产生愈伤组织，或进而生根发芽。2培养基中加入的激素（1）激素的种类：生长素和细胞分裂素（2）激素的使用比例比例结果细胞分裂素/生长素比例高诱导芽的生成（从状苗）细胞分裂素/生长素比例相当愈伤组织继续生长不分化细胞分裂素/生长素比例低趋于长根3实验中使用的激素：人工合成的萘乙酸（NAA）代替生长素人工合成的苄基腺嘌呤（BA）代替细胞分裂素二、菊花的组织培养材料：1.MS培养基:由大量元
18、素、微量元素和有机成分组成（用于配置发芽和生根培养基）2.萘乙酸（NAA）用少量0.1mol/L NaOH溶液溶解苄基腺嘌呤（BA）用少量0.1mol/L HCl溶液溶解3.发芽培养基：MS培养基+苄基腺嘌呤（BA）+萘乙酸（NAA）+蔗糖+琼脂+蒸馏水4.生根培养基：MS培养基+萘乙酸（NAA）+蔗糖+琼脂+蒸馏水步骤：1取外植体：超净台上将无菌幼苗切段，每段至少1张叶片。2生芽培养：在酒精灯旁，将每段放入一瓶生芽培养基中，使茎的一部分插入培养基内，盖上封口膜。每瓶也可放入2-3段幼茎切段，在日光灯下保持18-25C的温度培养，每天光照不少于14.5h。3生根培养：23周后,将丛状苗在无菌条件下转入生根培养基中,在上述条件下继续培养。4适应锻炼：待生根后，将苗转移至草炭土或蛭石中,用玻璃罩或塑料布保持80以上的湿度,23天后打开玻璃罩逐渐降低湿度进行锻炼,直到将罩全部打开处于自然湿度下为止5定植：将苗转移到土中培养。6自然生长的茎进行组织培养方法：取一段茎在70乙醇中浸泡10分钟 5次氯酸钠溶液中浸泡5min 5次氯酸钠溶液中浸泡5min 超净台上用无菌水清洗 将茎移至生芽培养基中
