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1、1,1,第五章 第六节.5.6 有害物质的环境毒理学研究方法,污染物的生物毒性监测与评价研究方法,2,本章将讨论以下内容：生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法,3,5.6.1 生物测试及方式,（1）生物测试（Bioassay）的概念：指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应注释2：生物测试与物理化学测试的比较,4,注释2：生物测试与物理化学测试的不同之处？生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定
2、污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。例如：通过水污染的生物测试可获得以下数据：各种环境因素如DO、pH、温度、混浊度等对生命的有利以及不利的浓度或强度；污染物对受测生物的毒性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所应处理的程度；允许的污染物排放浓度等。,5,（2）生物测试的方式,根据生物测试所经历的时间长短：短期生物测试/中期生物测试/长期生物测试根据试验溶液或试验气体的给予方式：静止式生物测试/流动式生物测试根据生物测试中所用测试生物的物种：单物种生物测试、多物种生物测试和模拟生态系统生物测试根据生物测试中所测试的生物效应性质：毒性试验、积累试验、行为试验、“三致”（致癌、
3、致畸、致突变）试验、损伤试验等等。,6,短期生物测试（Short Term Bioassays）被试生物在短时间内暴露于高浓度的污染物下，测定污染物对生物机体的影响。主要用于测定LC50、IC50、EC50用来快速估计污染物的毒性；评定几种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性；指示出中期或长期试验所应使用的毒物浓度。多数采用静止式。中期生物测试（Intermediate Term Bioassays）时间为8d到90d，多数情况下为流动式。,7,长期生物测试（Long Term Bioassays）包括全部生活史的生物测试（Complete Lifecycle Bioassays）和部分生活史的
4、生物测试（Partial Lifecycle Bioassays）目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓度或最大允许毒物浓度（MATC）只能采用流动式,8,受试生物的选择敏感性广泛性和可获得性有代表性，是生态系统的重要组成易于实验室培养和繁殖具有丰富的生物背景资料对毒物的响应能够被反应和测定 等等,9,影响生物测试结果的因素受试生物试验条件：要保证试验的环境条件（pH、硬度、温度等）和自然界的季节变化相符合。不同实验室：人员操作水平、仪器设备差异生物测试的标准化,10,（1）生物毒性的基本概念,毒物（Toxicant）一定条件下，可引起不良生物反应的外来化学物质。毒物与非毒物之间
5、不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒剂量时才是毒物。中毒（Intoxication）生物体受到毒物作用引起功能或器质性改变后出现的疾病状态。中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒。,5.6.2 一般毒性试验,11,毒性（Toxicity）指一种物质引起机体损伤的能力。毒性作用或毒效应（Toxic Effect）化学物引起生物体损害的总称无损害作用（Non-adverse Effect）可逆的生物学变化，不引起机体形态、生长发育和寿命的改变；不引起机体功能容量的降低和对额外应激状态代偿能力的损害等。,12,效应（Effect）也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使
6、机体产生的生物学改变。效应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。反应（Response）指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体中所占的比例。反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡率等。,13,剂量效应关系（Dose-effect Relationship）剂量反应关系（Dose-response Relationship）分别表示不同剂量在个体或群体中表现出来的量效应大小之间的关系，以及不同剂量与质效应发生率之间的关系。以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到的曲线，即为剂量效应关系和剂量反应关
7、系曲线。不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的曲线。（见图31，32，33，34）,14,剂量效应关系和剂量反应关系曲线图,剂量,100,50,死亡率（）,图32 剂量反应曲线（抛物线型）,死亡率（概率单位）,15,危害性（Hazard）:有毒物质在与机体接触或使用过程中，引起中毒的可能性。与风险（Risk）相近危险性：化学物质在正常的生产使用条件下，能引起机体发生中毒的可能性。偏重物质本身性质。,16,（2）毒性试验常用参数,致死剂量或致死浓度（Lethal Dose/LD，Lethal Concentration/LC）表示一次染毒后，在一
8、定时间内引起受试动物死亡的剂量或浓度。绝对致死剂量或浓度（LD100、LC100）半数致死剂量或浓度（LD50、LC50）最小致死剂量或浓度（MLD、MLC）最大耐受剂量或浓度（LD0、LC0）,17,最大无作用剂量（Maximum No-Effect Level,MNEL）指化学物在一定时间内，按一定方式与机体接触，按一定的检测方法或观察指标，不能观察到任何损害作用的最高剂量。随实验方法的改进而变化每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake，ADI）最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration，MAC）最小有作用剂量（MEL）/中毒阈剂量（
9、TL）,18,毒作用带（Toxic Effect Zone）一种根据毒性和毒性作用特点综合评价外来物危险性的指标。是对LD50的补充。急性毒性作用带（Acutetoxic Effect Zone）慢性毒性作用带（Chronic toxic Effect Zone）,19,半效应浓度（EC50）在一定时间内，引起50%受试生物的某种效应变化的浓度。只有同种效应才能比较。半数抑制浓度（IC50）是指能引起受试受试生物50%抑制的浓度常用于对生长速率和活性的抑制。,20,毒物单位与分级：mg/L,mg/kg,mg/m3分级：按急性毒性，人为分级。与染毒方式有关。,21,22,（3）急性毒性试验（Ac
10、ute Toxicity Test）,急性毒性试验（Acute Toxicity Test）研究化学物质大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。急性毒性试验类型哺乳动物急性毒性试验水生生物急性毒性试验蚯蚓急性毒性试验,23,急性毒性试验过程（啮齿类）（1）按试验要求选择受试生物常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观察几天后标记编号并随机分组。（2）预备试验和确定剂量组选用少量动物进行预备试验，求出引起动物90（或全部）死亡的剂量（即最高剂量组剂量）和引起动物10死亡（或不死亡）的
11、剂量（即最低剂量组剂量）。在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数插入若干个中间剂量（一般为4-6个），从而确定正式试验的剂量组。,24,（3）染毒方式和受试物的配制一般用灌胃法和人工熏气法。受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所需浓度。（4）观察指标中毒症状：一般观察2448小时，最好观察到绝大多数动物出现典型中毒症状。动物死亡数目和死亡时间病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡。,25,（5）确定半数致死量（LD50）（6）试验结果LD50值越小，毒性越大。急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，
12、而不能全面反映其毒性。由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不一致，故表示LD50应注释明动物种类和染毒方式。,26,鱼类急性毒性试验过程选择合适的鱼类确定养殖条件水质、水量、pH、温度、溶氧量等蚯蚓急性毒性试验过程主要评价土壤中残留农药的毒性一般采用试纸法（蚯蚓与浸润在试纸上的有害物接触）与人工土壤法（将一定浓度的有害物置于人工土壤中）,27,（4）亚慢性毒性试验和慢性毒性试验,亚慢性毒性试验在生物生命周期的1/201/30时间内,使生物每天或反复多次接触受试物的毒性实验，以确定最大毒物效应剂量和效应时间。采用的剂量是LD50的1/801/50，给药途径尽量模仿人类在环境中实际的
13、接触方法。观察的指标主要有：（a）表观指标，如生长情况、活动能力、死亡等（b）血液与生化指标，如血细胞、肝功能等（c）病理组织学检查，如肝、肺肾等有否病变等,28,29,慢性试验,目的是最终确定最大无作用剂量，为制定人体每日允许摄入量和最高容许浓度提供毒理学依据。实验步骤如下：选择与确定实验动物；实验浓度为亚慢性实验中最低中毒浓度的1/101/50;给药方法同亚慢性，试验周期约数个月至两年（基本覆盖受试动物整个生命周期）；观察指标同亚慢性。,30,（5）蓄积毒性试验,低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次地与机体持续接触，经一定时间后使机体出现明显的中毒表现，即为蓄积毒性作用是由于外来化合物进入
14、机体的速度大于有机体消除的速度，而使外来化合物在体内的量不断累积，达到了使机体引起毒性作用的阈剂量所致。是引起亚慢性和慢性毒性作用的基础。是评估环境污染毒性作用的常用指标之一，也是制订其在环境中的卫生标准的重要参考依据。,31,蓄积系数法（Cumulative Coefficient Method）是分次给受试物后引起50%受试动物出现某种毒效应的总剂量，与一次给受试物后引起50%受试动物出现同一毒效应的剂量的比值 蓄积系数 K（比值愈小，表示蓄积作用愈强）,32,33,生物半减期生物半减期（T1/2）是指一种外来化合物在体内消除到原有浓度（或量）的一半所需要的时间。生物半减期越长的物质，表示
15、越不易由体内消除，其蓄积作用的可能性就越大。,T1/2=,34,动物细胞模型法采用动物细胞（如：非洲绿猴肾细胞）作为试验受体，通过细胞培养，观察含外源化学物质的培养基中细胞的生长情况（与对照相比较），从而确定化学物对细胞生长产生毒效应；测试时间一般只需48h，而且重复性好、成本低、可较直接反应对人体的影响。,细胞水平检测：,5.6.3 生物的分子和细胞水平检测,35,分子水平检测1：,加合物的测定DNA加合物的测定 蛋白加合物的测定 eg：Hb加合物,36,分子水平检测2：,酶活性的测定方法：直接法：指直接测定体液中酶的含量，该法技术要求较高；间接法：通过测定酶反应中底物的减少或产物的增加量来
16、确定酶的活性，该方法目前使用广泛，但要求反应专一性较高，反应结果与过程方便观察。,37,酶活性的测定一般代谢酶的活性测定乙酰胆碱酯酶腺三磷酶解毒系统酶类诱导作用的检测混合功能氧化酶的诱导作用谷胱甘肽硫转移酶抗氧化防御系统检测过氧化氢酶谷胱甘肽过氧化酶,38,基本概念突变（Mutation）：生物体的遗传物质发生了基因结构的变化。基因突变（Gene Mutation）和染色体畸变（Chromosome Mutation）基 因 突 变：只涉及染色体的某一部分的改变，不能用光学显微镜直接观察染色体畸变：染色体的数目或结构发生改变，可用光学直接观察,（1）致突变试验,5.6.4 生物致突变、致畸和致
17、癌效应检测,39,致突变作用（Mutagenesis）和致突变物（Mutagen）致突变作用：某些物质引起生物体的遗传物质发生基因结构改变的作用致 突 变 物：具有引起生物体的遗传物质发生基因结构变化的物质,40,致突变试验的目的确定某种外来化合物（或环境污染物）对生物体是否具有致突变作用。致突变试验方法基因突变试验例如Ames试验、哺乳动物体细胞突变株试验染色体畸变试验DNA损伤试验,41,Ames试验（沙门氏菌回复突变试验）,Ames试验原理利用一种营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生回复突变，重新成为野生型微生物。注释1：营养缺陷型突变型菌株
18、：不具合成组氨酸的能力，不能在低营养的培养基上生长注释2：野生型微生物：,42,鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，从而弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。方法：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测其所诱发的沙门氏菌回变菌落数。突变率诱发回复突变菌落数/自发回复突变的菌落数（对照）当突变率大于2.0时，为阳性结果。,43,Ames试验的应用检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污
19、染源，为研究防治对策提供依据；检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药,。,44,原理：某种动物体细胞突变株缺乏利用嘌呤碱的酶，因此不能利用某些嘌呤碱类似物，但正常细胞可以利用。当培养液中存在有一些不常见的嘌呤碱类似物时，正常细胞可以将这些嘌呤类似物结合进DNA中，从而影响细胞生长。但突变型细胞不受影响。一旦突变型细胞和某种化学物
20、接触后又变为对这些嘌呤碱敏感的野生型，就说明这种化学物具有致突变性,哺乳动物体细胞突变株试验,45,体外培养法：动物细胞（如淋巴细胞等）在一定的培养液中37oC培养13天，培养过程中与受试物同步接触。在细胞收获前加入秋水仙碱使细胞分裂停止于分裂中期（该期的细胞较易观察胞内的染色体结构），然后经一定的预处理，在显微镜下观察染色体数目和结构等（如断裂、缺失、环状等）。体内试验法：也采用灌胃或腹腔注射方式使受试物进入动物体内（如小鼠等），饲养数个月，在处死前注入秋水仙碱，抽取骨髓细胞经预处理后显微观察。,显微镜检测染色体畸变,46,微核是染色单体或染色体的无着丝点断片或因纺锤体受伤而失去的整个染色体
21、，在分裂后期，仍留在细胞质中，或因核膜受损后核物质向外突出延伸形成，形成一个或几个规则的圆形或椭圆形小体，其嗜染性与细胞核相似，比主核小，故称微核。蚕豆根尖微核实验,微核实验,47,48,概念畸形（Malformation）、畸胎（Terate）畸形：胚胎在发育过程中，由于受到某种因素的影响，使胚胎的细胞分化和器官形成不能正常进行，而造成器官组织上的缺陷，并出现肉眼可见的形态结构异常畸胎：有畸形的胚胎或胎仔称为畸胎（广义的畸胎还包括生化、生理功能及行为的发育缺陷）致畸作用（Teratogenesis）、致畸物（Teratogen）致畸物通过母体作用于胚胎而引起胎儿畸形的现象称为致畸作用。,（2
22、）致畸效应,49,“反应停”致畸,50,致畸作用的毒理学特点不同发育阶段敏感性不同不同发育阶段畸形不同种属差异明显致畸作用带较窄,51,化学致畸作用机理突变引起胚胎发育异常；对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制；母体正常代谢过程被破坏；细胞分裂过程的障碍,52,致畸试验目的：检测环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。一般过程为选择合适的受试动物，受孕后给予一定剂量的化学物（如灌胃等），在自然预产期前12天解剖检查胎儿是否发生畸形。一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相似，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济实用，如大鼠、家兔、小鼠等。,53,致畸作用的评价注意与自然变异区分；注
23、意种属差异；注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差别。,54,概念癌：细胞自主生长，不断分裂形成危害机体的肿块（恶性肿瘤）。化学致癌作用（Chemical Carcinogenesis）指化学物质（包括有机、无机、天然和合成的化学物质）引起肿瘤的过程。化学致癌物（Chemical Carcinogen）指能诱发肿瘤的化学物质。,致癌因素：化学 物理：射线 生物：病毒,（3）致癌效应,55,细胞癌变学说体细胞突变学说癌变形成的基础是体细胞发生了突变，导致其功能发生异常。分化障碍学说 细胞癌变不一定需要体细胞遗传物质发生突变，而只是细胞分化过程中有关的基因调控过程受到致癌因素的干扰，使细胞分
24、化和增殖发生紊乱而出现癌变。,56,癌变过程引发阶段正常细胞转化为癌细胞的过程。促长阶段 促长是经过引发的癌细胞不断增殖直至形成一个临床上可被检出之肿块的过程，是癌的增殖阶段。促进过程需要较长的时间，一般为可逆过程。浸润和转移阶段浸润：癌细胞分泌毒素，侵蚀和破坏体内各种组织和器官。转移：癌细胞从初生肿瘤中离散，随血液循环向全身扩散。,57,致癌试验目的：检验受试物及其代谢产物是否具有致癌效应或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验法。试验方法（p130）短期筛检方法 85以上的癌症都是由致突变作用造成的,利用已建立的各种致突变试验方法快速筛检外来化合物是否具有致癌作用长期动物诱癌试验 过程：选择受试动物类
25、型与数量；确定剂量与给药方式；观察结果（包括肿瘤发生情况，发生率，潜伏期）最终确定结果等。,58,微宇宙（Microcosm）是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上的生物效应的一种方法，又称模型生态系统法（Model Ecosystem）可分为自然微宇宙和人工微宇宙或也可分为水生微宇宙和陆生微宇宙。,5.6.5 微宇宙法,59,标准化水生微宇宙（Standardized Aquatic Microcosm，SAM）用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统的影响。试验时间64天，容器为4L的玻璃广口瓶试验生物包括10种藻、4种无脊椎动物、1种细菌。对温度、光照强度、pH值
26、等理化参数均有具体要求。,60,烧杯水生微宇宙（Mixed Flask Culture，MFC）又称烧杯混合培养，试验时间1214周，容器为1L的玻璃广口瓶，试验生物包括4种藻、2种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。与SAM不同的是通过加入来自生态系统浸出液提供给微宇宙中生物群落所需的基质。,61,室外水生微宇宙（Outdoor Aquatic Microcosm）又称中宇宙Mesocosm试验单元6 m3，试验生物包括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊椎动物。,62,土壤核心微宇宙（Soil Core Microcosm，SCM）该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控制的实验室中试验生物因土壤核心采集场所不同而不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境的影响及其环境归趋。,63,64,模拟海水（6ppt）,25cm,10cm,实验体系结构示意图,65,模拟农田生态系统该系统模拟农田条件，无陆生动物。纳什农业生态系统：为同时测定农药在土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计，采用0.75 m3的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。,
