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1、树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究,张恒辉 何豫 赵鸿 朴文花 刘茂昌 席宏丽于敏 王贵强 北京大学第一医院感染疾病科,研究背景,HBV慢性感染主要原因,HBV特异细胞免疫功能的低下,T细胞,树突状细胞（DC）,慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常,研究背景（1）,特异性CTL数量少低反应,HBV慢性感染主要原因,HBV特异细胞免疫功能的低下,T细胞,树突状细胞（DC）,慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常,促进DC成熟、恢复DC的功能,增强DC激活特异性抗病毒免疫反应,打破免疫耐受彻底清除病毒,研究背景（1）,特异性CTL数量少低反应,获得高频数、功能强HBV特异性的CTL,
2、促进DC成熟，增强DC功能,CpG,CD40L,Ad-IL-12转染,Poly（I：C）,关于恢复DC功能的研究,研究背景（2）,研究目的,本研究通过在体外进行慢性乙型肝炎患者单核细胞的DC方向转化，并辅以聚肌胞Poly(I:C)刺激，增强DC的成熟和功能。将患者DC经HBV core18-27肽负载后，刺激病人自身的T淋巴细胞。并用Elispot法及本研究室构建的HLA-A2肽四聚体复合物检测病毒特异性T淋巴细胞的数量和功能。,研究对象和方法,研究对象,22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。HBeAg+患者16例、HBeAb+患者6例。HBV DNA 均104 copy/ml。排除HCV、H
3、AV、HDV、HEV感染。近半年没有接受过抗病毒治疗。,研究方法,HLA-A2型别鉴定 DC的体外培养扩增及鉴定 以树突状细胞为抗原递呈细胞体外诱导病毒抗原特异性T细胞 Elispot检测分泌IFN-的T细胞频数 MHC-肽四聚体检测 HBVcore18-27 肽特异性CD8+T 细胞,HLA-A*02型别鉴定,外周血淋巴细胞标记鼠抗人HLA-A02单抗；流式细胞仪检测；每份标本均设自身阴性对照。,树突状细胞的体外培养扩增及鉴定,分离病人PBMC；GM-CSF、IL-4 刺激下DC培养转化；Poly(I:C)刺激；通过流式细胞仪检测DC的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表
4、面分子表达，进行功能及成熟度的鉴定。,以DC为抗原递呈细胞体外诱导HBV抗原特异性T细胞,培养成熟DC负载HBV 核心肽（HBV core18-27 FLPSDFFPSV）；DC与自体T细胞共培养48-72h；单纯IL-2维持未经自身树突状细胞刺激T细胞组为对照。,Elispot检测分泌IFN-的T细胞频数,封闭种板 孵育：37，5%CO2 孵育15-20 h；显色计数：CTL IMMUNOSPOT分析仪计数，取两复孔的平均值,MHC-肽四聚体检测 HBVcore18-27 肽特异性CD8+T 细胞,PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD
5、8标记；流式细胞仪检测；慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/HCV 四聚体标记作为阴性对照；,统计学处理,实验数据以xSD表示。用SPSS10.0软件进行统计分析，组间比较用配伍组方差分析。,结 果,DC的扩增、表型鉴定及Poly(I:C)对其表面分子表达的影响,慢性乙型肝炎病人DC经Poly(I:C)作用前后表面分子表达的比较*表示差异有统计学意义（P0.01）,经Poly(I:C)刺激后：CD80、CD83表达明显上调。CD14的表达明显下降。,Poly(I:C)对DC表面分子表达的影响,Elispot检测HBV特异性的分泌IFN-的CTL细胞频数的比较,1 2 31.慢乙肝病人体外经
6、IL-2维持生长的T细胞；2.经自体DC刺激后的T细胞；3.DC经Poly（I:C）作用后刺激的T细胞,树突状细胞激活的分泌IFN-的CTL细胞的频数分布图,T：慢性乙型肝炎患者体外经IL-2维持生长的T细胞；DC-T：经树突状细胞刺激后的T细胞；PDC-T：树突状细胞经Poly（I:C）作用后刺激的T细（“”表示均数）,Elispot检测结果说明,病人T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比，分泌IFN-的CTL细胞频数均值由16上升为46，约为2.9倍；发现经Poly（I:C）作用后的树突状细胞所活化的特异性分泌IFN-的T细胞频数明显升高，均值为98，和未经树突状细胞刺激组和树突状细
7、胞刺激组相较，分别升高6.1和2.1倍。,Tetramer 流式细胞技术检测HBVcore18-27 特异性CD8+T 细胞结果,PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD8标记T细胞，行流式检测。以淋巴细胞设门，收集门内细胞50,000个,右上象限细胞数/右上及右下象限细胞数之和即为抗原特异性CTL占CD8+细胞数比例（图中右上象限的百分比值）。,1PE-羊抗鼠IgG/FITC-鼠抗人CD8标记的T细胞；2.IL-2维持的自身T细胞；3.与树突状细胞作用的T细胞；4.与poly（IC）刺激后的树突状细胞作用的T细胞,图3.tetramer检
8、测特异CD8+T 细胞的频数分布图,Control：非相关肽四聚体标记的T细胞；T：IL-2维持的自身T细胞；DC-T：与树突状细胞作用的T细胞；PDC-T：与poly（IC）刺激后的树突状细胞作用的T细胞。,Tetramer 结果说明,患者T细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前相比，HBV core18-27 肽特异的CTL频数均值由0.77%上升至1.92%，提高约2.5倍，差异均有统计学意义（P 0.001）。经Poly（I:C）刺激的树突状细胞活化后，HBVcore18-27 表位特异性CTL的频数均值上升为3.49%，分别为前2组的4.5和1.8倍，差异均有统计学意义（P值均小于0
9、.001）。,讨 论,讨论（1）,树突状细胞能激活幼稚T细胞，调节T、B淋巴细胞的功能；在病毒抗原摄取、递呈及特异性激活抗病毒免疫反应中发挥重要的作用，是抗感染免疫的中心环节。HBV急性感染时：多克隆、高反应性的病毒特异性CTL可迅速、彻底清除病毒；HBV慢性感染时：单一克隆、弱反应性的病毒特异性CTL。,讨论（2）,聚肌胞Poly(I:C)是一种型和型干扰素的强诱生剂。Poly（I:C）能够有效地诱导体外单核细胞转化的树突状细胞成熟，并维持树突状细胞的成熟状态。CD83：DC成熟；行使功能CD83表达 DC成熟及功能改善 CD14：单核细胞的特异性分子标记CD14表达 DC分化程度改善,讨论
10、（3）,MHC-肽四聚体染色法检测HBVcore18-27 特异性CTL的数量：高特异性、敏感性 对特异性CTL进行定性、定量分析 用于感染、肿瘤、自身免疫性疾病等的细胞免疫学研究和治疗效果监测。Elispot 检测活化的分泌IFN-的有功能的病毒特异性T细胞两种技术结合 能够更准确、客观地评价体外转化的树突状细胞活化特异性T淋巴细胞的能力。,结 论,慢性乙型肝炎患者T细胞在体外经自身负载HBV core18-27抗原肽的DC刺激后，可获得高频数、功能较强的HBV特异性的CTL；在DC体外转化的过程中加入聚肌胞作为刺激剂可明显促进DC的成熟、增强DC功能，在负载HBV core18-27抗原肽后与自身T细胞作用可获得频数更高及功能更强的病毒特异性的CTL。,Thank you!,
