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1、第三章 染色体工程与植物育种,植物染色体工程的用途十分广泛，主要用在基因定位和异源基因的导入。我国自80年代开始进行染色体工程育种研究，经过“六五”和“七五”协作攻关，在小麦染色体工程育种方面有较大进展，创制了小麦与黑麦(Secale cereals)、山羊草(Aegilops tauschii)、簇毛麦(Haynaldia villosa)、大麦(Hodeum vulgare)、类麦(Thinopyrum)等近缘种、属的双二倍体，转育了不同生态型的小麦单体系统和缺体系统，选育出了多种异附加系、异代换系和易位系。这是一批十分有用的染色体工程基础材料，是选育小麦良种的宝贵资源。,本章内容提要,第
2、一节 染色体工程的一般概念和主要内容第二节 染色体组水平的操纵技术第三节 染色体水平的细胞遗传学操纵第四节 染色体片段的细胞遗传学操纵第五节 染色体微切割和人工染色体第六节 染色体工程和作物育种,第一节 染色体工程的一般概念和主要内容,一、概念二、亲缘关系远近与遗传操作策略三、染色体的操纵的三个水平,一、染色体工程概念,该术语最早由里克（Rick）和库升（Khush）于1966年在论述番茄单体、三体和缺体时提出的。染色体工程：按照人们预定目标，采用一定的方法和步骤，通过染色体操纵改变生物染色体组，并进而改变其遗传性的过程。陈佩度染色体工程：是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异
3、种染色体，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的一种技术。李志勇染色体工程：指某一种植物的染色体或染色体片段按照人们的意愿进行添加、消减、代换或易位，从而达到定向改变植物遗传性的一项技术。陈耀锋,陈佩度本课教材编者,抗白粉病八倍体小偃麦和双体附加系的鉴定染色体组成多倍性现象在高等植物中相当多，但动物界的多倍体现象却少得多。染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。17m）在倒置AABBRR（六倍体小黑麦）自然产生：双生苗（多胚现象）、半配合（精、卵各自分裂嵌合体）P A表现型二体（n-1）+AA 缺体（n-1）如，酵母人工染色体（YAC）是目前容量最大的克隆载体，
4、但遗传不稳定。可以利用同工酶和核酸限制性片段长度多态性来检测导入受体的外源染色体乃至染色体片段，并据此确定导入的外源染色体与被代换的受体亲本染色体之间的部分同源关系。目前最常用的方法是用秋水仙素处理在细胞分裂时期的分生组织，使其新生器官的染色体加倍。染色体工程在培育抗病新品种上有重要意义，而且是基因定位和染色体转移等基础研究的有效手段。多倍体动物的性腺发育及其应用（n-1）若待测基因不在某单体染色体上，则F2分离情况为：一、染色体工程中值得注意的问题广义的还应包括应用细胞遗传学技术通过有性杂交和回交、细胞组织培养和体细胞杂交等方法，按预定目标有计划有步骤地转移染色体组、染色体或染色体片段。如，
5、具有1RS/1BL易位的许多小麦品种。第五节 染色体微切割和人工染色体使用的方法通常是染色体分带、分子原位杂交、生化标记和分子标记等。生产上可以利用这个不育特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长上，避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，也避免了生长停滞和死亡率的增高，缩短了养殖周期、减少了养殖成本，可养成大型个体。,狭义和广义染色体工程：狭义：指人工分离染色体或染色体片段，导入受体原生质体，再经过原生质体培养再生细胞壁、愈伤组织，直至再生出完整植株的过程。广义的还应包括应用细胞遗传学技术通过有性杂交和回交、细胞组织培养和体细胞杂交等方法，按预定目标有计划有步骤地转移染色体组、
6、染色体或染色体片段。,注：导入的染色体必须是有活力的，导入原生质后，又涉及到如何与受体染色体“共处”或“重组”问题。染色体工程在培育抗病新品种上有重要意义，而且是基因定位和染色体转移等基础研究的有效手段。,染色体组：生物体内维持生命活动所必须的一套非同源染色体（用x表示），它是遗传的生命单位。部分同源群：分别处于不同染色体组中，最早可能由同一条染色体演化而成的，具有不同程度同源关系的染色体互称为部分同源染色体并共同组成一个部分同源群。它们具有基本相似的核苷酸组成和排列次序，相互之间具有一定的补偿性。,染色体组和部分同源群,二、亲缘关系远近与遗传操作策略,1、含有同源染色体组物种间的遗传操纵特点
7、：有性杂交容易成功，F1雌雄配子的育性较好策略：采用一般的有性杂交技术，如果双亲间遗传性状差异大，要加大杂种群体、增加选择代数、或辅以花药花粉培养等技术诱导单倍体，然后加倍，加速形成纯合体。,2、含有部分同源染色体组物种间的遗传操纵,特点：没有相同的染色体组，但具有部分同源关系，有性杂交有难度，杂种后代双亲染色体间很少或基本不配对。策略：通过回交，育成异附加系或异代换系；通过操纵染色体配对控制体系（如小麦5B），可促进具有部分同源关系的染色体间配对，发生交换和重组；也可以通过理化因子或生物因子（如小麦近缘种中的杀配子基因）诱导染色体断裂、重接，产生易位。,3、无同源染色体组物种间的遗传操纵,特
8、点：无同源性，有性杂交极其困难，或至今得不到有性杂种。策略：采用体细胞杂交技术获得体细胞杂种。,三、染色体操纵的三个水平,1、染色体组操纵：添加或消减同种或异种染色体组，合成双二倍体或部分双二倍体，或者创造单倍体。,2、染色体操纵：整条染色体的附加、消除、代换，导入的染色体要有完整的着丝粒和端粒，以保持其结构稳定性和进行正常的复制分裂。,3、染色体片段操纵：指染色体片段的转移易位、添加或消除。需要经过染色体断裂和重接，新形成的染色体具有且只具有一个着丝粒，而且染色体两端形成完好端粒。,在育种中，不仅要求整组染色体、整条染色体或染色体片段的操纵成功，还要求经操纵后的个体在细胞遗传学上的稳定性，在
9、遗传组成和形态特性上比原有亲本更加优良。,（补充）染色体变异,染色体结构变异染色体易位：一个染色体上某一区段与另一非同源染色体上的区段发生互换。染色体缺失：染色体的某一区段及其带有的基因一起丢失。染色体倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转。染色体重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。,一是体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，以整倍体染色体数目变化产生的变异会产生多倍体和单倍体；第二节 染色体组水平的操纵技术（1）可在生产上直接利用，如小麦Lovlin13（1B/1R代换系）F2（n-1）+AA因此有人认为，小麦染色体配对控制基因ph基因是主效基因，它还受位于5BS
10、、5DL和5DS、3BL、3DL、2AS等上载有的促进染色体配对基因的制约，它是通过一套遗传体系来实现的。双二体异附加系添加了2对不同外源染色体的个体。（n-1）+A染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。F1（n-1）Aa+（n-1）Aa+五、多倍体倍性鉴定的方法策略：采用体细胞杂交技术获得体细胞杂种。（n-1）（n-1）+aa三倍体预期是不育的，许多实验也都证明了这一点。形态标记染色体计数和染色体构型分析、第六节 染色体工程和作物育种Vittate杂交，得到三倍体后裔。可以利用同工酶和核酸限制性片段长度多态性来检测导入受体的外源染色体乃至染色体片段，并据此
11、确定导入的外源染色体与被代换的受体亲本染色体之间的部分同源关系。因此有人认为，小麦染色体配对控制基因ph基因是主效基因，它还受位于5BS、5DL和5DS、3BL、3DL、2AS等上载有的促进染色体配对基因的制约，它是通过一套遗传体系来实现的。第一节 染色体工程的一般概念和主要内容第四节 染色体片段的细胞遗传学操纵5、三级三体大麦的保持和利用。,（补充）染色体变异,染色体数变异一是体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，以整倍体染色体数目变化产生的变异会产生多倍体和单倍体；另一种是染色体组内的个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的的完整倍数，因此被称为非整倍体。,第二节 染色体
12、组水平的操纵技术,一、远缘杂交障碍及克服途径二、染色体组的消减：即单倍体产生和二倍体化三、染色体组的添加异源多倍体、同源多倍体等,一、远缘杂交障碍及克服途径,障碍：花粉萌发不好、花粉管伸长缓慢、雄配子不能顺利通过珠孔进入胚囊壳完成受精、远缘杂种的某亲本的染色体全部或部分消失、杂种灭亡和杂种不育。克服途径：使用失活的母本花粉、生长素类物质（2，4D）或利用可交配基因和桥梁亲本，采取幼胚拯救和染色体加倍等措施。,二、染色体组的消减：即单倍体产生和二倍体化,1、单倍体：含有配子染色体数目的孢子体。单倍体包括：（1）整倍体单倍体：一倍体、多倍单倍体（同源多倍单倍体、异源多倍单倍体）（2）非整倍体单倍体
13、：二体单倍体（n+1）、附加单倍体（n+1）、缺体单倍体（n-1）、置换单倍体（n-1+1）,2、单倍体的产生自然产生：双生苗（多胚现象）、半配合（精、卵各自分裂嵌合体）诱发产生：远源杂交诱导、延迟授粉、单倍体的诱发基因（大麦中的hap基因）和核质互作、利用合子发育过程中染色体消减，以及花药、花粉核未授粉的子房、胚珠培养等。,3、二倍体化可自然加倍，但频率很低，一般需要人工加倍。目前最常用的方法是用秋水仙素处理在细胞分裂时期的分生组织，使其新生器官的染色体加倍。,4、单倍体在育种上的应用（1）提高选择效率，加速育种进程，因为单倍体的基因型核表现型是一致的，对于隐性基因控制的性状特别有效，常规杂
14、交育种需要810年，而单倍体育种只须一个世代即可得到纯合二倍体。（2）加速纯系的获得，尤其对于玉米等异花授粉作物杂种优势利用来说具有特别重要意义。,（3）利用花粉植株进行异源染色体或基因的转移，例如：小黑麦（AABBRR）小麦（AABBDD）F1（AABBRD）R、D两组单体在减数分裂过程中将以07的各种可能出现于子细胞中。通过花粉培养可得到类型丰富的花粉植株，这些植株在遗传育种中具有重要的研究利用价值。,（4）利用单倍体进行突变体的选择，由于单倍体没有显隐性关系，所以无论是培养过程中引起的体细胞变异还是在人工诱导产生的突变体，特别是隐性突变体，均可以有效地表现出来。,5、单倍体育种的不足（1
15、）基因重组的机会只有一次，缺少常规杂交育种各个分离世代的基因交换与重组的机会，后代不能积累更多的优良基因。（2）单倍体诱导技术还不是很完善，花培出愈率和绿苗率均较低，单倍体群体小，很多优良基因可能被淘汰。,所有单体为a表现型 所有二体为A表现型染色体计数：是鉴定多倍性的一个准确的直接方法。（2）用作品种改良的亲本：指携有亲缘物种有用基因的易位系，如小麦簇毛麦6Vs/6AL易位系。诱导三倍体可以增加种间杂种的成活率，三倍体种间杂种可以比二倍体杂种成活得更好一些。例如：若待测隐性基因a在三体染色体上，则：自从60年代发现一种美洲角蛙是一个确定的四倍体动物以来，学者们陆续在低等脊椎动物中发现许多多倍
16、体动物，包括鱼类、两栖类和爬行类。三、染色体操纵的三个水平染色体工程：按照人们预定目标，采用一定的方法和步骤，通过染色体操纵改变生物染色体组，并进而改变其遗传性的过程。由于荧光染料Hoechst 只对A-T特异性染色，而染料Chromomycin只对G-C特异性染色。17m）在倒置由这些非同源染色体形成的新端着丝粒染色体融合而形成的易位叫罗伯逊易位。G（n-1）a+（n-1）A+（n-1）A+染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。染色体工程在培育抗病新品种上有重要意义，而且是基因定位和染色体转移等基础研究的有效手段。原位杂交等方法鉴定异附加系。（二）初始亲本
17、和回交亲本：选用最优异的系或单株作原始供体亲本，并尽可能分系或分单株保存；F1（n-1）Aa+F2（n-1）+aa染色体组的添加可以自然发生，也可以人工诱导合成染色体工程在培育抗病新品种上有重要意义，而且是基因定位和染色体转移等基础研究的有效手段。（2）加速纯系的获得，尤其对于玉米等异花授粉作物杂种优势利用来说具有特别重要意义。,还有3DS上的ph2基因，以及3A、4D、2A等上的一些微效抑制基因。另一种是染色体组内的个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的的完整倍数，因此被称为非整倍体。染色体计数：是鉴定多倍性的一个准确的直接方法。（3）异附加系的应用：二倍体西瓜（BB 2n2
18、x22）狭义和广义染色体工程：因此有人认为，小麦染色体配对控制基因ph基因是主效基因，它还受位于5BS、5DL和5DS、3BL、3DL、2AS等上载有的促进染色体配对基因的制约，它是通过一套遗传体系来实现的。（3）利用缺体或单体异附加系，再自交，也可产生异代换系是研究染色体组亲缘关系、物种起源进化、基因互作、基因表达的有用遗传材料；（二）用细胞、组织培养诱导染色体易位，原因可能与培养基中的某些成分和培养过程中的理化因素刺激有关，因此，组织培养结合理化诱变可大大提高变异体的频率，其中将会有不少易位。八倍体小堰麦PMC减数分裂MI 2n=281、染色体工程的概念和主要内容是什么？易位系：指某物种的
19、一段染色体和另一物种的相应染色体节段发生交换后，基因连锁群也随之发生改变而产生的新类型。在育种中可能真正有作用的人工染色体，如哺乳动物人工染色体（MAC）和植物人工染色体（PAC），还处在研究阶段中。双二体异附加系添加了2对不同外源染色体的个体。染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。（2）用作品种改良的亲本：指携有亲缘物种有用基因的易位系，如小麦簇毛麦6Vs/6AL易位系。二、人工染色体构建的依据“染色体组重建”基因能诱发高频率的染色体断裂和重接。G（n-1）+a（n-1）（n-1）+A同源多倍体在有利基因剂量效应对植株的生长量和某些生物产物有促进作用。,三
20、、染色体组的添加异源多倍体、同源多倍体等,多倍体（polyploid）这个名词是由Winkler（1916年）首先使用的，它是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。染色体组成多倍性现象在高等植物中相当多，但动物界的多倍体现象却少得多。自从60年代发现一种美洲角蛙是一个确定的四倍体动物以来，学者们陆续在低等脊椎动物中发现许多多倍体动物，包括鱼类、两栖类和爬行类。,由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视,染色体组的添加可以自然发生，也可以人工诱导合成1、异源多倍体：在正常二倍体染色体组的基础上添加一个至多个异种染色体组的个体
21、。如：小麦、燕麦、棉花等典型的例子是普通小麦和小黑麦,一粒小麦（AA）2n14？（BB）,AB,染色体自然加倍,二粒小麦（AABB）2n28 节节麦（DD）2n14,ABD,染色体自然加倍,普通小麦（AABBDD）2n42,普通小麦AABBDD黑麦RR,ABDR（不育）,染色体加倍,AABBDDRR八倍体小黑麦,硬粒小麦（AABB）黑麦（RR）,ABR（不育）,染色体加倍,AABBRR（六倍体小黑麦）,2、同源多倍体：在正常二倍体的染色体基础上添加一个至多个同种染色体组的个体。如：马铃薯等同源多倍体在有利基因剂量效应对植株的生长量和某些生物产物有促进作用。如三倍体甜菜、橡胶、香蕉、西瓜、草莓等
22、。典型例子：三倍体无籽西瓜3、同源异源多倍体（如AAAAGG）是介于同源多倍体和异源多倍体之间的过渡类型。,典型例子：三倍体无籽西瓜,二倍体西瓜（BB 2n2x22）,0.2%秋水仙素处理生长点,四倍体西瓜（BBBB）二倍体西瓜,三倍体西瓜（BBB）,（*不育，不结籽，在外界花粉刺激下可结实）,四、人工诱导多倍体的方法,生物学方法 Rasch等（1965）年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过杂交产生，他们将雌核发育的二倍体帆鱂（Poecilia formosa）与P.Vittate杂交，得到三倍体后裔。雌性草鱼（2n=48）与雄性三角鲂（2n=48）杂交获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体
23、，其中草鱼提供了二倍数目的染色体（48），三角鲂提供了单倍数目的染色体（24）。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。,物理学方法温度休克法：包括冷休克法和热休克法两种，即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。此法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于养殖场大规模生产使用。水静压法：就是采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。此种方法诱导率高（90%100%）、处理时间短（35min），对受精卵损伤小、成活率高。但该法需要专门的设备水压机，成本较高，其样品室
24、容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产。,化学方法细胞松驰素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。秋水仙碱：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。其它药物：N2O 和聚乙二醇等。,五、多倍体倍性鉴定的方法,核体积测量：二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5，二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。蛋白质电泳：生化分析：如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体。染色体计数：是鉴定多倍性的一个准确的直接方法。DNA含量测定：流式细胞仪。,染色体直接计数法准确、直接，但费时；红细胞体积测量法省时、简单，在生产现场就能进行而广为人们采用，但缺乏准确
25、性，亦测不出嵌合体，往往需要校正；DNA含量测定法是较为先进常用的方法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但需要特殊的仪器设备。,六、多倍体动物的应用及发展趋势,多倍体动物的生活力及生长能力。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良好的生存力和生长率。诱导三倍体可以增加种间杂种的成活率，三倍体种间杂种可以比二倍体杂种成活得更好一些。,特点：无同源性，有性杂交极其困难，或至今得不到有性杂种。形态标记染色体计数和染色体构型分析、单体、缺体在基因定位上的应用染色体重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。（二）初始亲本和回交亲本：选用最优异的系或单株作原始供体亲本，并尽可能分系或分单株保存；“
26、染色体组重建”基因能诱发高频率的染色体断裂和重接。（n-1）（n-1）+aa如果去掉的是两条非同源染色体则称为双单体（2n-1-1）。G（n-1）a+（n-1）A+（n-1）A+所谓杀配子基因，乃是当载有这些基因的染色体处于半合杂合状态时，不含该染色体的雌雄配子无受精能力，而这些染色体自身则优先传递。抗白粉病八倍体小偃麦和双体附加系的鉴定G（n-1）a+（n-1）A+（n-1）A+2、含有部分同源染色体组物种间的遗传操纵缺体很少，几乎全是显性需要经过染色体断裂和重接，新形成的染色体具有且只具有一个着丝粒，而且染色体两端形成完好端粒。一是体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，以整倍体染色体数
27、目变化产生的变异会产生多倍体和单倍体；诱发产生：远源杂交诱导、延迟授粉、单倍体的诱发基因（大麦中的hap基因）和核质互作、利用合子发育过程中染色体消减，以及花药、花粉核未授粉的子房、胚珠培养等。二体异附加系添加了1对外源染色体的个体；染色体工程：按照人们预定目标，采用一定的方法和步骤，通过染色体操纵改变生物染色体组，并进而改变其遗传性的过程。（2）用作品种改良的亲本：指携有亲缘物种有用基因的易位系，如小麦簇毛麦6Vs/6AL易位系。1992），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和 parC）。典型的
28、例子是普通小麦和小黑麦,多倍体动物的性腺发育及其应用 三倍体预期是不育的，许多实验也都证明了这一点。生产上可以利用这个不育特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长上，避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，也避免了生长停滞和死亡率的增高，缩短了养殖周期、减少了养殖成本，可养成大型个体。与三倍体不同，四倍体是可育的。目前如何大量诱导四倍体并培育至性成熟，尔后与正常二倍体杂交获得不育的三倍体，进行三倍体育种是许多学者正在致力研究的课题。,多倍体动物的其它经济性状三倍体虹鳟的鱼肉质量确实优于二倍体，其抗传染性造血器官坏死病毒能力较强；三倍体大西洋鲑耐低氧，故可适用于低氧环境养殖；三倍体
29、香鱼对声音和光线的感受能力比二倍体香鱼略显迟钝，适于在噪音较大的环境中放养。,七、多倍育种中存在的问题,准确的处理时间；诱导率、成活率及孵化率的提高；准确可靠的倍性鉴定方法的确定。,第三节 染色体水平的细胞遗传学操纵,一、染色体的消减二、染色体的添加三、染色体的代换,一、染色体的消减,从正常细胞中去掉一条染色体，染色体数变为（2n-1），叫做单体；去掉一对同源染色体，则叫缺体（2n-2）；如果去掉的是两条非同源染色体则称为双单体（2n-1-1）。除了消减正常的整条染色体外，还可以消减染色体的某一个臂，称为端体。,单体在遗传上不稳定，自交后可分离出正常的二体、单体和缺体三种类型，除缺体外，多数单
30、体和二体在外部形态上十分相似，直观上很难区分，必须进行细胞学观察，才能把单体植株挑选出来。因此，单体植株的保存很困难。,以小偃6号1D单体（含1415）作为受体与含有510优质亚基的品种杂交，进行优质亚基聚合的染色体工程法。,2D单体小麦与遗4212杂交F1出现的单价体,箭头示双单体,4D缺体小麦PMC减数分裂MI 2n=20,八倍体小堰麦PMC减数分裂MI 2n=28,杂种F1根尖染色体 2n=48,簇毛麦6VS端体：a,T240-6-1(2n=41+t);b,T240-6-1(2n=41+2t),在染色体工程上，常用单体植物系统和缺体植物系统，它们是染色体工程和基因定位的重要材料。例如，已
31、知某植物的某对性状是由A和a一对基因控制的，而且已获得该植物的所有单体或缺体，用单体法或缺体法确定A（a）基因所在的染色体。1、单体法2、缺体法,单体、缺体在基因定位上的应用,1、单体法（1）若测定的二体植株的基因是隐性纯合时，则单体系列为显性。,P a表现型二体（n-1）+aa A表现型单体（n-1）+A,G（n-1）+a（n-1）（n-1）+A,F1（n-1）+a（n-1）+Aa,所有单体为a表现型 所有二体为A表现型,若待测基因在某单体染色体上时，则aa基因型双体（2n）与A表现型的该染色体的单体（2n-1）杂交后，F1代表现型为：,若待测基因不在某单体染色体上时，则F1表现型为：,P
32、a表现型二体（n-1）aa+A表现型单体（n-1）AA+,G（n-1）a+（n-1）A（n-1）A+,F1（n-1）Aa+（n-1）Aa+,无论单体还是二体，均为A表现型,（2）若测定的基因为显性纯合时，则单体材料为隐性。,若待测基因在某单体染色体上时，则AA基因型二体（2n）与a基因型的该染色体单体（2n-1）杂交后，F2代的分离情况为：,P A表现型二体（n-1）+AA a表现型单体（n-1）+a,G（n-1）+A（n-1）（n-1）+a,F1（n-1）+A（n-1）+Aa,F2（n-1）+AA（n-1）+AA（n-1）+A（n-1）+Aa（n-1）（n-1）+aa,因缺体的生活力较弱，占
33、很少一部分几乎全部为显性性状,显隐性比例为31,自交,自交,若待测基因不在某单体染色体上，则F2分离情况为：,P A表现型二体（n-1）AA+a表现型单体（n-1）aa+,G（n-1）A+（n-1）a（n-1）a+,F1（n-1）Aa+（n-1）+Aa,自交,自交,F2（n-1）AA+（n-1）Aa+（n-1）aa+（n-1）AA+（n-1）Aa+（n-1）aa+（n-1）AA（n-1）Aa（n-1）aa 显隐性比例为31,（n-1）AA+（n-1）Aa+（n-1）aa+显隐性比例为31,P a表现型二体（n-1）+aa 缺体（n-1）,F1（n-1）+a 全部为a表现型的单体,自交,F2（n
34、-1）+aa（n-1）+a（n-1）,2、缺体法（1）若待测定的是隐性基因a，则用显性缺体系统 若待测基因a在缺体染色体上，则：,若待测基因a不在缺体染色体上，则：,P a表现型二体（n-1）aa+缺体（n-1）AA,F1（n-1）Aa+全部为A表现型的单体,F2（n-1）AA+（n-1）Aa+（n-1）aa+（n-1）AA+（n-1）Aa+（n-1）aa+（n-1）AA（n-1）Aa（n-1）aa 显隐性比例为31,自交,三倍体预期是不育的，许多实验也都证明了这一点。目前最常用的方法是用秋水仙素处理在细胞分裂时期的分生组织，使其新生器官的染色体加倍。染色体直接计数法准确、直接，但费时；若待测
35、基因在某单体染色体上时，则aa基因型双体（2n）与A表现型的该染色体的单体（2n-1）杂交后，F1代表现型为：原位杂交等方法鉴定异附加系。诱导率、成活率及孵化率的提高；显微镜下对目的基因所在染色体区段进行切割与分离。4、如何应用单体缺体进行基因定位？生产上可以利用这个不育特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长上，避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，也避免了生长停滞和死亡率的增高，缩短了养殖周期、减少了养殖成本，可养成大型个体。在减数分裂时，两个非同源的单价染色体同时发生错分裂，产生端着丝粒染色体。如果去掉的是两条非同源染色体则称为双单体（2n-1-1）。17m）在倒置Chr
36、omosomes of Chinese Spring stained with Carbo Fuchsin,One of chromosome 6B indicated in A was microdissected into R1,R2,R3 and R4 sections(B)Bar represents 10m原位杂交等方法鉴定异附加系。目前最常用的方法是用秋水仙素处理在细胞分裂时期的分生组织，使其新生器官的染色体加倍。染色体计数：是鉴定多倍性的一个准确的直接方法。F2（n-1）+AA因此有人认为，小麦染色体配对控制基因ph基因是主效基因，它还受位于5BS、5DL和5DS、3BL、3DL
37、、2AS等上载有的促进染色体配对基因的制约，它是通过一套遗传体系来实现的。将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体（artificial minichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。此种方法诱导率高（90%100%）、处理时间短（35min），对受精卵损伤小、成活率高。双单体异附加系添加了2条不同外源染色体的个体；,（2）若测定的是显性基因A，则用隐性缺体系统 若待测基因A在缺体染色体上，则：,P A表现型二体（n-1）+AA 缺体（n-1）,F1（n-1
38、）+A,F2（n-1）+AA（n-1）+A（n-1）,缺体很少，几乎全是显性,自交,若待测基因A不在缺体染色体上，则：,P A表现型二体（n-1）AA+缺体（n-1）aa,F1（n-1）Aa+,F2（n-1）AA+（n-1）AA+（n-1）AA（n-1）Aa+（n-1）AA+（n-1）Aa（n-1）aa+（n-1）aa+（n-1）aa,无论单体、缺体、二体，显隐性比例均为31,自交,除了用单、缺体进行基因定位外，端体也是进行基因定位的好材料，端体分析法基因定位，不仅能将基因定位在特定的染色体上，而且能定位在特定染色体的某一个臂上。（但较复杂）,二、染色体的添加,一个种的染色体组经过杂交或其它方
39、法导入同种或异种染色体叫染色体的添加。1、同种染色体的添加：在原来正常染色体数的基础上添加了一条或一对同种染色体（1）三体：指同源染色体为三条的个体,三体作为遗传工程的基础材料在理论和实践上都有重要的意义，可用来进行基因定位，并在育种实践中发挥作用。,结球甘蓝1号和4号染色体三体核型,菜薹7号染色体三体,陆地棉三体PMC：25+3,基因定位例如：若待测隐性基因a在三体染色体上，则：,P a突变纯合二体（n-1）+aa 三体（n-1）+AAA,G（n-1）+a（n-1）+A（n-1）+AA,F1（n-1）+Aa（n-1）+AAa,自交,自交,F2 显隐性比例为31 显隐性比例为351,若待测隐性
40、基因a不在三体染色体上，则：,P a突变纯合二体（n-1）aa+三体（n-1）AA+,G（n-1）a+（n-1）A+（n-1）A+,F1（n-1）Aa+（n-1）Aa+,自交,自交,F2 显隐性比例为31 显隐性比例为31,三体在育种实践上最成功的实例是大麦核不育系的杂交,三级三体大麦的保持和利用,（2）四体：指某同源染色体为4条的个体，是研究剂量效应的特殊材料。人们对四体研究不多，但补偿性的缺体四体具有特殊的作用而被人们重视，在小麦中比较典型。,谷子四体,2、异种染色体的添加异附加系异附加系：添加有外源染色体的个体。单体异附加系添加了1条外源染色体的个体；二体异附加系添加了1对外源染色体的个
41、体；双单体异附加系添加了2条不同外源染色体的个体；双二体异附加系添加了2对不同外源染色体的个体。,（1）异附加系的产生：常用方法是栽培物种与亲缘物种或通过桥梁亲本再与亲缘物种杂交，再用受体亲本与F1或F1加倍成的双倍体回交一至数次，选出附加单体，再经自交即产生。（详见P6566）,抗白粉病八倍体小偃麦和双体附加系的鉴定Fig10、山农Line15根尖染色体荧光原位杂交（箭头所示微附加系中的中间偃麦草染色体）,抗大麦黄矮病毒的RAPD特异带左边第一个：中间偃麦草，第三第八个，含抗病基因第二个：775433，不含抗病基因。,（2）异附加系的鉴定：形态标记染色体计数和染色体构型分析、染色体分带、生化
42、标记（同工酶和蛋白质）、分子标记、原位杂交等方法鉴定异附加系。,（3）异附加系的应用：生产中尚没有可直接利用的异附加系，原因主要是细胞学上不稳定、遗传学上不平衡，在导入携带有利基因的整条染色体时不可避免地带入该染色体的许多不利基因。优点：是培育代换系和易位系的有用中间材料；是研究染色体组亲缘关系、物种起源进化、基因互作、基因表达的有用遗传材料；利用连锁标记生产杂交小麦种子等。,三、染色体的代换,由外源染色体代换受体品种染色体的个体称异代换系。通常发生在同一个部分同源群内的不同染色体之间，又分为单体异代换系、二体异代换系等，根据代换的染色体不同，可分为同种染色体的代换和异种染色体的代换，同种染色
43、体的代换系通常可以直接作为品种使用，而异种染色体的代换系通常是转移有利基因的有效的中间材料。,遗4212 C-分带分析，箭头示2D染色体被携带抗黄矮病基因的中间偃麦草染色体代换,GISH检测蓝粒小麦中含有长穗偃麦草的染色体片段和染色体,（一）异代换系的产生（1）在远缘杂交的回交、自交过程中自发产生（2）在选育异附加系过程中，由于产生n-1+1配子而产生（3）利用缺体或单体异附加系，再自交，也可产生异代换系,（二）异代换系的鉴定 与异附加系的鉴定方法相同，但由于染色体数不发生变化，所以一般不能通过染色体计数来鉴定异代换系，必须辅助减数分裂期染色体配子对分析进行。可以利用同工酶和核酸限制性片段长度
44、多态性来检测导入受体的外源染色体乃至染色体片段，并据此确定导入的外源染色体与被代换的受体亲本染色体之间的部分同源关系。,（三）异代换系的应用（1）可在生产上直接利用，如小麦Lovlin13（1B/1R代换系）（2）用代换系来转移有用基因，培育易位系比用附加系有优势（3）在基因定位、研究基因效应、基因互作方面有特殊优越性（特别是整套代换系）,第四节 染色体片段的细胞遗传学操纵,一、诱导染色体片段转移的方法二、易位系的鉴定三、易位系的利用,转移外源基因较理想的方法是导入携有有利基因的染色体片段，而且伴随的额外染色体物质愈少愈好（最理想就是转基因了）易位系：指某物种的一段染色体和另一物种的相应染色体
45、节段发生交换后，基因连锁群也随之发生改变而产生的新类型。,一、诱导染色体片段转移的方法,（一）辐射诱导易位，最常用的电离辐射。（二）用细胞、组织培养诱导染色体易位，原因可能与培养基中的某些成分和培养过程中的理化因素刺激有关，因此，组织培养结合理化诱变可大大提高变异体的频率，其中将会有不少易位。,（三）利用遗传控制体系诱导染色体易位ph基因如在小麦5BL上的ph1基因抑制部分同源染色体之间配对，在5BS上存在染色体配对促进基因；还有3DS上的ph2基因，以及3A、4D、2A等上的一些微效抑制基因。因此有人认为，小麦染色体配对控制基因ph基因是主效基因，它还受位于5BS、5DL和5DS、3BL、3
46、DL、2AS等上载有的促进染色体配对基因的制约，它是通过一套遗传体系来实现的。,（四）利用杀配子基因诱导染色体易位所谓杀配子基因，乃是当载有这些基因的染色体处于半合杂合状态时，不含该染色体的雌雄配子无受精能力，而这些染色体自身则优先传递。还有研究认为小麦农林26的3B染色体上带有抑制杀配子效应的基因Igcl，该基因和杀配子基因（3S、3C染色体上）互作，产生染色体断裂、重接，并可诱导易位。,（五）利用着丝粒融合诱发易位，以及利用“染色体组重建”基因诱发易位在减数分裂时，两个非同源的单价染色体同时发生错分裂，产生端着丝粒染色体。由这些非同源染色体形成的新端着丝粒染色体融合而形成的易位叫罗伯逊易位
47、。“染色体组重建”基因能诱发高频率的染色体断裂和重接。如，在玉米中有一种与染色体重排有关的系统X组分，在高大山羊草品系中，发现一个调控基因组的基因，等等。,不管用什么方法诱导染色体易位，在育种上有用的易位最好是携带有用基因的小片段中间插入易位，它们在细胞学和遗传学上比较稳定且容易通过基因重组转入栽培品种并遗传给后代。,二、易位系的鉴定,比代换系和附加系的鉴定要困难得多，尤其是小片段易位。使用的方法通常是染色体分带、分子原位杂交、生化标记和分子标记等。,通过C-分带鉴定小麦簇毛麦6VS/6AL易位系,图A和图B:小麦-黑麦易位系BC152-1-1 染色体的C-带(A)和GISH(B),三、易位系
48、的利用,（1）直接利用：一般是指具有优良遗传背景的易位系。如，具有1RS/1BL易位的许多小麦品种。（2）用作品种改良的亲本：指携有亲缘物种有用基因的易位系，如小麦簇毛麦6Vs/6AL易位系。,第五节 染色体微切割和人工染色体,一、染色体微切割二、人工染色体构建的依据,一、染色体微切割,指在显微镜下利用特种工具对某个特定的染色体片断切割加工。要进行染色体微切割，首先要对染色体进行识别鉴定。又由于目标染色体片断DNA的量很少，或者由于目标基因大多数为单拷贝或寡拷贝，因此，常要借助PCR技术。目前，染色体微切割仍局限于构建特定染色体和特定染色体片段的微切割文库。,染色体分离的基本原理由于荧光染料H
49、oechst 只对A-T特异性染色，而染料Chromomycin只对G-C特异性染色。染色体上DNA的碱基序列是不同的，因此这些特异性染料和不同染色体上DNA结合的量和比例是不同的。结合这些染后，再经激光照射，染色体就会呈现不同的荧光带。将特定染色体发出的荧光波长输入计算机，通过计算机控制就可将发出同一波长的染色体收集在一起，从而实现染色体的分离。,Chromosomes of Chinese Spring stained with Carbo Fuchsin,One of chromosome 6B indicated in A was microdissected into R1,R2,R
50、3 and R4 sections(B)Bar represents 10m,染色体微切割最常用的方法有两种微细玻璃针切割法：采用特细的玻璃针（尖端直径约为0.17m）在倒置 显微镜下对目的基因所在染色体区段进行切割与分离。显微激光切割法：将染色体标本在底部贴有特殊薄膜的培养皿上制作，利用 激光共聚焦扫描显微系统，依靠高能量激光照射非选择细 胞或染色体，使其受热蒸发，最后只留下目的染色体。,二、人工染色体构建的依据,染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括自主复制DNA序列（autonomously replicating sequen
