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1、实验六 细胞器的分离与观察一、细胞核的分离与观察二、线粒体的分离与观察,一、实验目的,了解细胞器的分离原理掌握差速离心和密度梯度离心技术,二、实验原理,细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。,分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中
2、用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。,(1)细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25molL蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。,(2)分级分离(Fractionation)：由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必
3、然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化.,(3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。,Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）,细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。,活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这
4、样它们彼此之间就发生了吸引作用。,中性红-詹纳斯绿染色,线粒体分析：詹纳斯绿（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿色）。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，将活细胞中的液泡系染红色。,洋葱内表皮细胞的线粒体分布,植物根尖液泡的中性红染色,三、材料和试剂,材料：小鼠的肝脏器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、0.34mol
5、/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。,四、实验方法与步骤,1.细胞核的分离（1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀浆完毕,移入1.5ml离心管中。,（2）离心：低温离心机（4）中进行。每次离心前一定要在天平（托盘天平）上将两离心
6、管配平。第一次以600g(3005rpm)离心10min。将其上清夜移入Eppendorf管中，盖好盖子置于冰浴中，留待后面使用（分离线粒体）。沉淀使用1ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次，每次1000g(3880rpm)离心10min。,（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。以1500g(4752rpm)离心1520min。弃上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶液悬浮，4C保存。,细胞经
7、甲基绿-派洛宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，派洛宁染低聚分子的RNA呈红色。,下次实验内容：,（4）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干燥。将干燥的涂片浸入95乙醇溶液固定5min，晾干，滴加甲基绿-派洛宁染液染色2030min，丙酮分色30s，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检。核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。,六、实验报告,1.线粒体提取分离过程中，为什么要在04进行？2.要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定
8、的过程中需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。3.分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层?有什么作用?,2.线粒体的分离,(1)分离:将分离细胞核时收集的上清液以10000g(12270rpm)离心10min。沉淀用预冷0.25mol/L蔗糖溶液悬浮,10000g离心10min,反复2次。(2)鉴定:在干净的载玻片中央滴加12滴中性红-詹纳斯绿染液,用牙签挑取沉淀物均匀涂片。盖上盖片,染色5min,镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。,五、实验结果,核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。观察每
9、个视野中所见完整细胞核和线粒体的数量及纯度。,差速离心（differential centrifugation）,主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。,密度梯度离心（density gradient centrifugation）,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。,如果分离的颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种大小的颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种不同大小的颗粒在离心管中被分成独立的区带。细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，避免细胞器的聚集。,
