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1、第七章 寄生虫病诊断,第一节 病原学诊断方法,一、粪便虫卵检查法,1.直接涂片法 direct smear method 2.漂浮集卵法 flotation method 3.沉淀集卵法 sedimentation method,4.麦氏计数法 MacMaster method,5.毛蚴孵化法 是诊断日本血吸虫及东毕吸虫的方法之一。,6.粪便培养与幼虫分离法圆线虫目所属线虫种类很多，其虫卵在形态上非常相似，很难区别。有时为了区别这些线虫的种类，常将含有虫卵的粪便加以培养，待其中虫卵发育成为幼虫时再检查，根据幼虫形态上的差异，加以鉴别。,最常用的方法是在培养皿底部加草纸或滤纸1张，而后将欲培养的
2、粪便加水调成硬糊状，塑成半球形，放于皿内的纸上，并使半球形粪球的顶部略高出平皿边沿，使加盖时与皿盖相接触。,将此皿置25温箱中，注意保持皿内湿度（应使底部的垫纸保持潮湿状态）。经7天后，多数虫卵即可发育成第三期幼虫，并集中于皿盖上的水滴中。将幼虫吸出置载玻片上，放显微镜下检查。,有些寄生虫（如网尾科线虫），其虫卵在新排出的粪便中已孵化为幼虫；类圆属线虫虫卵随粪便排出后，在外界温度较高时，经5-12 h即孵出幼虫。为了提高检出率，常将幼虫从粪便中分离出来进行检查。,常用的方法为漏斗幼虫分离法 亦称贝尔曼法(Baermanns technique),7.测微技术各种虫卵和幼虫，大小通常较为恒定。虫
3、卵或幼虫的大小可作为确定某一虫卵或幼虫的依据。虫卵和幼虫的测量需用测微器。,长1mm的直线等分为100小格,每小格等于10 m,10倍物镜，标定后每小格是多少？,1 m,二、体表虫体检查法,寄生于动物体表的寄生虫主要有蜱、螨、虱等。对于它们的检查，可采用肉眼观察和显微镜观察相结合的方法。,蜱寄生于动物体表，个体较大，通过肉眼观察即可发现。螨和虱有些个体较小，常需刮取皮屑，于显微镜下寻找虫体或卵。,三、生殖道虫体检查,寄生于生殖道的虫体主要有牛胎儿三毛滴虫和马媾疫锥虫,牛胎儿毛滴虫存在于病母牛的阴道或子宫的分泌物，流产胎儿的羊水、羊膜或其第四胃内容物中，也存在于公牛的包皮鞘内，应采集以上各处的病
4、料寻找虫体。,由于虫体的检定常以见到运动活泼的虫体为准，故在采集病料时必须尽可能地避免污染，以免其它鞭毛虫混入病料造成误诊。采集用的器皿和冲洗液等应加热使接近体温，否则虫体骤然遇冷会失去活动力或死亡。,冲洗液应采用以玻璃蒸馏装置制备的蒸馏水配制生理盐水，以保证冲洗液中不含金属离子，减少金属离子对虫体的影响。病料采集后应尽快地进行检查。,由母畜采集病料，是取阴道分泌的透明粘液，以直接自阴道内采取为良好，建议用一根长45厘米，直径1.0厘米的玻璃管，在距一端的12厘米处，弯成150角，而后消毒备用。,使用时将管的“短臂”插入受检畜的阴道，另端接一橡皮管并抽吸，少量阴道粘液即可吸入管内。取出玻管，两
5、端塞以棉球，带回实验室检查。,收集公牛包皮冲洗液，应先准备100-150毫升加温到30-35的生理盐水，用针筒注入包皮腔。用手指将包皮口捏紧，用另一手按摩包皮后部，而后放松手指，将液体收集于广口瓶中待查。,流产胎儿，可取其第四胃内容物，胸水或腹水检查。,检查时应将收集到的病料，立即放于载玻片上，并防止材料干燥。对浓稠的阴道粘液，检查前最好以生理盐水稀释2-3倍，羊水或包皮洗涤物最好先以每分钟2000转的速度离心沉淀5分钟，而后以沉淀物制片检查。,未染色的标本主要检查活动的虫体，在显微镜下可见其长度略大于一般的白细胞，能清楚地见到波动膜，有时尚可见到鞭毛，在虫体内部可见含有一个圆形或椭圆形的有强
6、折光性的核。,波动膜常作为本虫与其它一些非致病性鞭毛虫和纤毛虫在形态上相区别的依据。也可将标本固定，用姬氏染液或苏木素染色后检查。,马媾疫锥虫在末梢血液中很少出现，因此血液学检查在马媾疫诊断上的用处不大。检查材料主要应采取浮肿部皮肤或丘疹的抽出液，尿道及阴道的粘膜刮取物，特别在粘膜刮取物中最易发现虫体。,采取病料时，浮肿液和皮肤丘疹液用消毒的注射器抽取，为了防止吸入血液发生凝固，可于注射器内先吸入适量的 抗凝剂（2%柠檬酸钠生理盐水）。,马阴道粘膜刮取物的采取，先用阴道扩张器扩张阴道，再用长柄锐匙在其粘膜有炎症的部位刮取，刮时应稍用力，使刮取物微带血液，则其中容易检到锥虫。,采取公马尿道刮取物
7、时，应先将马保定，左手伸入包皮内，以食指插入龟头窝中，徐徐用力以牵出阴茎，用消毒的长柄锐匙插入尿道内，刮取病料。,以上所采的病料，均可加适量的生理盐水，置载玻片上，覆以盖玻片，制 成压滴标本检查；也可制成抹片，用姬氏液染色后检查。,也可用灭菌纱布，以生理盐水浸湿，用敷料钳夹持，插入公马尿道或母马阴道，擦洗后，取出纱布，洗入无菌生理盐水中，将盐水离心沉淀，取沉淀物检查，方法同上。,四、血液和组织内虫体检查法,1.鲜血压滴标本检查2.涂片染色标本检查 3.虫体浓集法,涂片法虽然可以查到血液中的原虫，但血液中的虫体较少时，则不易查出虫体。为此常先进行集虫，再制片检查。其操作过程是采病畜抗凝血6-7毫
8、升，以每分钟500转的速度离心5分钟，使其中大部分红细胞沉降。,而后将含有少量红细胞，白细胞和虫体的上层血浆移入另一离心管中，补加一些生理盐水，以每分钟2500转的速度离心10分钟。取沉淀物制成抹片，按上述染色法染色检查。此法适用于伊氏锥虫病和梨形虫病。,其原理是锥虫和感染有梨形虫的红细胞较正常红细胞的比重为轻，所以在第一次沉淀时，正常红细胞下降，而锥虫和感染有梨形虫的红细胞尚悬浮在血浆中。第二次离心沉淀时，则将其浓集于管底。,对于血液中的微丝蚴，也可用虫体浓集法。方法是采血于离心管中。加入5%醋酸溶液以溶血。待溶血完成后，离心并吸取沉淀检查。,4.组织内虫体检查法有些原虫可以在动物身体的不同
9、组织内寄生。一般在死后剖检时，取一小块组织，以其切面在载玻片上做成抹片、触片，或将小块组织固定后制成组织切片，染色检查。抹片或触片可用瑞氏染色法或姬氏染液染色。,泰勒虫感染的病畜常呈现局部体表淋巴结肿大。取淋巴结穿刺物，进行显微镜检查以寻找病原体，对本病的早期诊断很有帮助。其方法是，首先将病畜保定，用右手将肿大的淋巴结稍向上方推移，并用左手固定淋巴结。,局部剪毛，消毒，以10毫升注射器和较粗的针头刺入淋巴结，抽取淋巴组织；拔出针头，将针头内容物推挤到载玻片上，涂成抹片，固定，染色，镜检，可以找到柯赫氏蓝体。,家畜患弓形虫病时，除死后可在一些组织中找到包囊和速殖子外，生前诊断可取腹水，检查其中滋
10、养体的存在。收集腹水，猪只可采取侧卧保定，穿刺部在白线下侧脐的后方（公畜）或前方（母畜）1-2厘米处。,穿刺时先局部消毒，将皮肤推向一侧，针头以略倾斜的方向向下刺入，深度约2-4厘米，针头刺入腹腔后会感到阻力骤减，而后有腹水流出。取得的腹水可在载玻片上抹片，以瑞氏液或姬氏液染色后检查。,肌肉中旋毛虫的检查，是肉品卫生检验的重要项目，世界各国使用的方法大同小异。传统的方法为镜检法，但目前多用消化法。,镜检法为取膈肌肉样0.51g，剪成310mm的小块，用厚玻片压紧，放显微镜下检查。,消化法为取100g肉样，搅碎或剪碎，放入3L的烧瓶内。加入10g胃蛋白酶和2L自来水。然后加入16ml盐酸（25%
11、），放入1磁力搅拌棒。置于可加热的磁力搅拌器上，设温于4446。,30min后,将消化液用180m的滤筛滤入一2L的分离漏斗,静置30min,放出40ml液体于一50ml的量筒内,静置10min,吸去30ml上清夜。加入30ml水，摇匀。10min后，再吸去30ml上清液。剩下的液体到入一带有格线的平皿内，用20-50倍显微镜观察。,五、动物接种法,伊氏锥虫 试验动物可用小鼠、大鼠、豚鼠、兔或犬。其中尤以小鼠最适用。接种材料用可疑病畜的抗凝血液，血液采取后应在2-4小时内接种完毕。接种量0.5-1.0毫升，可接种于腹腔或皮下。,接种后的动物应隔离并经常检查。当病料中含虫较多时，小鼠在接种后1-
12、3日即可在其外周血液中查到锥虫，当病料内含虫量少时，发病时间可能延长，因此接种后至少观察一个月。也可于接种的第3天采接种小鼠的血液0.51.0毫升，接种于另一只小鼠，如此盲传3代，即可在接种小鼠外周血内发现虫体。,2.马媾疫 马媾疫锥虫不能接种于多数实验动物，但可将病畜的阴道或尿道刮取物与无菌生理盐水混合，接种于公家兔的睾丸实质中，每个睾丸的接种量为0.2毫升。,如有马媾疫锥虫存在，经1-2周后，即可见家兔的阴囊、阴茎、睾丸以及耳、唇周围的皮肤发生水肿，并可在水肿液内检出虫体。,3.胎儿毛滴虫 取病牛阴道分泌物或包皮冲洗液为病料，接种于妊娠豚鼠的腹腔内，在接种后1-20天可以使妊娠豚鼠发生流产
13、，在其流产胎儿的消化道和胎盘里可查出大量的毛滴虫。,4.弓形虫 弓形虫是多宿主病原原虫，多种家畜和实验动物均具有易感性，但小鼠对之特别敏感，常常仅数十个虫体即可使小鼠感染发病。,一般取急性死亡的可疑动物的肺、淋巴结、脾、肝或脑组织，以1:5的比例加入生理盐水，制成乳剂，并加少量青霉素和链霉素以控制细菌感染。,吸取乳剂0.2毫升接种于小鼠腹腔，一般急性者在4-5天后发病。病鼠被毛粗乱，食欲消失，腹部膨大，有大量腹水，病程4-5天，最后死亡。抽取病鼠或病死鼠的腹水作涂片，染色检查，可见大量游离的滋养体。,六、动物剖检法,1.全身剖检法在动物死亡（或捕杀）后，首先制作血片，染色检查，观察血液中有无寄
14、生虫，而后仔细检查体表，观察有无体表寄生虫。而后剥皮，观察皮下组织中有无虫体寄生。,将各内部脏器依次取出，先收集胸水，腹水，沉淀后观察其中有无寄生虫。而后取出全部消化器官及其所附的肝、胰等腺体。取出呼吸系统、泌尿系统和生殖系统、心脏和大的动脉和静脉血管，分别进行检查。,消化系统 先将附着其上的肝、胰取下，再将食道、胃（反刍兽应将四个胃分开）、小肠、大肠、盲肠分别结扎后分离。,呼吸器官 用剪刀将鼻、喉、气管、支气管切开，寻找虫体。用小刀刮气管粘膜，刮下物在解剖镜下检查。肺组织按肝脏处理方法。,泌尿器官 切开肾，先对肾盂作肉眼检查，再刮取肾盂粘膜检查。最后将肾实质切成薄片，压于两玻片间，在放大镜或
15、解剖镜下检查。剪开输尿管，膀胱和尿道，检查其粘膜，并注意粘膜下有无包囊。收集尿液，用反复沉淀法处理。,生殖器官 切开并刮取粘膜，压片检查。怀疑为马媾疫和牛胎儿毛滴虫病时，应涂片染色后油镜检查。,脑 先肉眼检查有无多头蚴，再切成薄片，压片检查 眼 结膜和结膜腔以括搔法处理检查。剖开眼球，将前房水收集于皿中，在放大镜下检查。,心和主要血管 剖开将内容物洗于生理盐水中，反复用沉淀法检查（对血管内分体吸虫的收集见后）。膈脚 特别是猪，应用镜检法和消化法进行检查。,2.个别器官和个别寄生虫剖检法,有时为了特定的目的，仅对某一器官或某一器官中的某种寄生虫进行检查，如调查某一地某一器官中寄生虫寄生的情况，或
16、调查某一地区某种寄生虫的流行情况，或考核某一药品对某种寄生虫的驱虫效果。其剖检方法同全身剖检法。,第二节 免疫学诊断方法,免疫学诊断：应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态。,抗原抗体反应,T细胞杀伤反应,补体介导的反应,已报道的寄生虫免疫学诊断方法很多，包括变态反应、沉淀反应、凝集反应、补体结合试验，免疫荧光抗体技术、免疫酶技术、放射免疫分析技术、免疫印迹技术等。此处仅介绍主要几种。,一、间接血凝试验,1.基本原理 间接血凝试验(Indirect heamagglutination assay，IHA)是将可溶性抗原或抗体先吸附于红细胞表面，然后与相应的抗体或抗原作用，在适宜
17、的条件下由于抗原抗体的特异性结合，会带动红细胞的凝集，出现肉眼可见的凝集现象，称间接血凝试验。,红细胞自然沉降，阴性,被致敏的红细胞与被检血清反应，形成复合物，而不沉降，阳性,（1）用微量滴管加4滴（25l/滴）生理盐水于U型微量血凝板第一排第二孔内，第三孔空白，第四孔加1滴。（2）第一孔内加待检血清，混匀，从中吸取血清1滴加入第二孔内，充分混匀后吸出2滴，于第三孔和第四孔各加1滴，在第四孔混匀后弃去1滴，使第三孔和第四孔血清稀释度为15和110。（3）将冻干致敏红细胞用蒸馏水稀释后，用定量吸管吸取致敏红细胞悬液，于第三孔和第四孔各加一滴（25l），立即旋转震摇2min，室温下静置1h左右，观
18、察结果。（4）判读标准以血清大于或等于1:10稀释出现阳性反应判为血吸虫病患者。,二、免疫荧光技术,免疫荧光技术(Immunofluorescence method)又称荧光抗体标记技术(Fluorescent-labelled antibody technique)，是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。,判定结果时，-为无荧光，+为荧光弱但清楚可见，+为荧光明亮，+为荧光强而明亮。,A：+；B：+；C：:+；D：阴性对照,目前，荧光免疫技术已在许多寄生虫病中得到应用。如血吸虫病、锥虫病、旋毛虫病、弓形虫病、利什曼病等。,弓形虫速
19、殖子抗原片的制备用适量生理盐水稀释弓形虫速殖子全虫，滴于载玻片上，显微镜下观察，至视野中的虫体均匀散在，每个高倍视野100个虫体左右（1107/mL）。用移液器吸取上述稀释好的虫体30L，滴于载玻片每个反应孔区内，静置30 min，吸去孔区内多余的液体，空气中自然晾干后，冷丙酮固定10min，自然干燥510min，用锡纸包装后，4保存备用。,弓形虫速殖子,免疫荧光专用载玻片,将待检血清稀释后，取30L加入抗原片反应区内，置湿盒内室温反应30 min，用PBS漂洗3次，每次5 min，自然凉干。滴加用PBS稀释的FITC标记二抗30L，湿盒内室温反应30 min，同上洗涤、晾干。再加PBS稀释的
20、伊文斯蓝（0.02%）30L，湿盒内室温反应5 min，PBS洗1次，5 min，晾干。各反应区内滴加90%的磷酸盐缓冲甘油一滴，覆以盖玻片，荧光显微镜下检查。,弓形虫IFA结果A：一抗1:60稀释时检测结果；B：一抗1:120稀释时检测结果；C：:一抗1:480稀释时检测结果；D：阴性对照检测结果,三、免疫酶技术,酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质。,有色物质的出现，客观地反映了酶的存在。根据有色产物的
21、有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量，从而达到定性或定量的目的。,免疫酶技术在方法上分为两类，一类用于组织细胞中的抗原或抗体成分检测和定位，称为免疫酶组织化学或免疫酶染色法，另一类用于检测液体中可溶性抗原或抗体成分，称为免疫酶测定法。,免疫组织化学标本制备 后，先将内源酶抑制，然后进行免疫酶染色检查。其基本原理和方法与抗体法相同，只是以酶代替荧光素作为标记物，并以底物产生有色产物为标志。常规免疫酶染色法可分为直接和间接两种方法。,直接法 是用酶标记特异性抗体，直接检测寄生虫或其抗原。在含有寄生虫或其抗原的标本固定后，消除其中的内源性酶，用酶标记的抗体（直标一抗）直接处理，
22、使标本中的抗原与酶标抗体结合，然后加底物显色，进行镜检。,间接法 是将含有寄生虫或其抗原的组织或细胞标本，用特异性抗体处理，使抗原抗体结合，洗涤清除未结合的部分，再用酶标记的抗抗体(酶标二抗)进行处理，使其形成抗原抗体-酶标记抗抗体复合物，最后滴加底物显色，进行镜检。,间接法虽然多一步骤，但比直接法特异性强，使用范围更广。酶标记第二抗体可用葡萄球菌A蛋白SPA或生物素与亲合素系统等代替，亦成功地用于许多抗原和抗体的检测。同时在不同程度上提高了检测方法的特异性与敏感性。,免疫酶测定法分固相免疫酶测定法和均相免疫酶测定法两类,固相免疫酶测定法 是需用固相载体，以化学的或物理的方法将抗原或抗体连接其
23、上，制成免疫吸附剂，随后进行免疫酶测定。酶联免疫吸附试验(ELISA)是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种。,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。,包被抗原,洗涤,孵育一抗,洗涤,酶标二抗,洗涤,加底物,终止与显色,第三节 分子生物学诊断方法,从DNA双螺旋结构被发现以来，基于核酸的寄生虫分子诊断技术就一直在飞速发展。从基于DNA探针的DNA印迹技术，到现在广泛应用的PCR技术，最新也发展了基于高通量测序、核酸芯片技术的方法，分
24、子生物学诊断技术在寄生虫和寄生虫病的鉴定、诊断方面起到越来越重要的作用。,一、DNA印迹（Southern blot）,转基因艾美耳球虫的DNA印迹分析。转基因球虫基因组提取后用EcoR V,酶切，电泳分离后将DNA转印到硝酸纤维素膜膜上，然后用地高辛标记的、特异性针对外源基因YFP的探针去杂交。图中显示仅仅转基因球虫具有YFP基因特异性的杂交条带。阳性对照为含有YFP基因的质粒DNA。,二、DNA聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）,PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。通过20-30个重复的变性、退火和延伸步骤，DNA片段得到了大量复制，数量可达2106107拷贝。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。,材料：待扩增的样品（提取的含有寄生虫的基因组DNA）引物：根据寄生虫特定DNA序列设计的寡核苷酸单链脱氧核糖核苷三磷酸：分别是dATP,dTTP dCTP dGTPDNA聚合酶：将特定的脱氧核糖核苷三磷酸添加到引物3端，完成DNA扩增酶缓冲液：含有Mg2+等成分，用于保持聚合酶的活性。,样品,DNA聚合酶及缓冲液,引物,脱氧核糖核苷三磷酸,
