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1、基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用 基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用是小柯论文网通过网络搜集，并由本站工作人员整理后发布的，基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用是篇质量较高的学术论文，供本站访问者学习和学术交流参考之用，不可用于其他商业目的，基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用的论文版权归原作者所有，因网络整理，有些文章作者不详，敬请谅解，如需转摘，请注明出处小柯论文网，如果此论文无法满足您的论文要求，您可以申请本站帮您代写论文，以下是正文。 摘要 综述了基因文库的类型以及鱼类基因文库的构建及其应用。通过构建cDNA表达文库不但可以保护濒危珍稀生物资源，而且可以提供构建分子标记连
2、锁图谱的所用探针；cDNA文库的构建将在鱼类分子生物学方面起到更多的作用。关键词 基因组；基因文库；cDNA文库；鱼类；应用中图分类号 S917 文献标识码A文章编号1007-5739（2008）16-0247-03一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子导入到受体细菌或细胞中，这样每个细胞就包含了1个基因组DNA片段与载体重组DNA分子，形成了含有该生物全部基因组序列的细胞集合体，我们将这个集合体叫做基因文库。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的
3、主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库1。这个文库像是一个贮存有基因组全部序列的信息库，故称为基因组文库（Genomic library）2。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是高等真核生物基因分离、基因定位和基因工程研究的有效手段。1基因文库的类型从序列来源上分，基因
4、文库可分为基因组文库和cDNA基因文库（cDNA文库）。基因组文库是指一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体后所形成的基因组DNA，基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的基因文库3。目前基因组文库和cDNA文库在基因工程中都得到有效应用。cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组DNA含有内含子而难以表达，可以直接筛选到所需的目的基因，并用于该目的基因的表达4。因此，在分离RNA病毒基因、研究功能蛋白序列、分离特定发育阶段或特定组
5、织特异表达基因时应构建cDNA文库。在研究mRNA分子中不存在的序列及基因组作图时必须构建核基因组文库。一个基因文库中应包含的克隆数目与该生物的基因组大小和被克隆 DNA片段的长度有关。原核生物的基因组较小，需要的克隆数也较少；真核生物的基因组较大，克隆数需相应增加，才能包含所有的基因。此外，每一载体DNA中所允许插入的外源DNA片段的长度较大，则所需总克隆数越少；反之则所需数越多。如果一个基因文库的总克隆数较少，则从中筛选基因虽然比较容易，但会给以后的分析造成困难，因为片段的长度增加了。所以在建立基因文库前应根据研究目的来确定DNA片段的长度和克隆数目，并以此确定构建基因文库的载体种类。早期
6、人们使用噬菌体和粘粒（cosmid）作为克隆载体，但是二者容纳外源DNA片段的最大能力分别是25Kb和45Kb，只适用于一般基因的克隆1。通常认为，噬菌体文库较质粒文库更加稳定和易于筛选，但是提取高质量的噬菌体DNA以便分析连接在载体上的插入片段的工作是非常困难的，而质粒载体便于基因克隆和测序分析等方面的操作5。噬菌体载体和粘粒载体是早期构建真核细胞基因组文库的两类载体。随着分子生物学的飞速发展，建库的对象由模式动物到全部生物界，所研究生物的基因组从小到大，而这两类载体存在克隆位点少、插入容量较小和筛选工作量大的问题。20世纪80年代后期，随着人工染色体载体系统的应运而生，这些问题得到解决。2
7、人工染色体文库人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50Kb DNA片段的人工载体。目前，根据目标DNA片段的大小，基因组文库构建常用的载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。选用何种载体主要考虑以下几个因素：如果基因组的目标区域很小（小于50Kb），那么可以选择黏粒载体甚至是噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便地构建黏粒载体文库。如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难，P
8、AC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。如果目标区域非常大（大于250Kb），那么YAC载体就是首选。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难，一般由专门的公司来完成。Murraya和Szostak首次成功构建了包括着丝粒、端粒、复制子和外源DNA在内的总长度为55Kb的酵母人工染色体（Yeast artificial chromosome，YAC）6。Burke等构建了能克隆大片段人体DNA分子的载体，即YAC，并证明YAC可用来构建高等生物的完整基因组文库，插入片段比通常所
9、用的噬菌体、Cosmid等载体的容纳能力至少大10倍7。但是，YAC不仅存在着重排和缺失现象，而且其插入片段的分离较难，转化效率低，同时其嵌合体问题尤为严重，使其在应用和研究工作中受到了很大限制8。因此，建立一种容量大，能够稳定遗传且易于操作的载体系统就成了分子生物学研究的重要内容。20世纪90年代发展起来的细菌人工染色体（BAC），使人们的愿望成了现实。BAC构建的基础是E.coli及F因子。F因子在E.coli中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一般为每细胞单拷贝或2个拷贝。此外，F因子具有携带1Mb插入片段的潜能，这就使得以此为基础、构建具有大容量克隆能力的BAC载体成为可能。1989年，
10、OConnor等首次用“染色体建造”的方法，利用F因子构建载体pMBO131来克隆大片段DNA，目前常用的载体有pECBAC1、pBeloBAC1等9。3cDNA文库3.1经典cDNA文库自1976年Efstratiadis等10报道成功地进行了cDNA的分子克隆，cDNA合成和克隆方法不断改进，与之相适应的cDNA文库也得到不断改善。经典cDNA文库是以带有多聚腺苷酸的mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA第1链，再用适当的方法合成cDNA第2链，加入合成接头后，把cDNA克隆到能在细菌中扩增的载体中11。随着分子生物学的发展，cDNA文库的构建方法在模板制备、cDNA合成效率和克隆
11、载体等方面取得了很大进展。但经典cDNA文库仍存在不足：低丰度表达序列在文库中出现的机率很低；构建经典cDNA文库所需要的mRNA量大，达数微克；筛选经典cDNA文库工作复杂，需要很长时间，限制了基因克隆的速度12。3.2标准化cDNA文库 在绝大多数细胞中，基因表达均存在差异。表现在mRNA上，就是在任意时刻，细胞内的各种mRNA丰度都存在较大差别，反映在使用通用方法制成的cDNA文库，即直接cDNA文库（direct cDNA library）上，就是文库中大多数克隆都是重复的、冗余的13。对单一组织的cDNA文库而言，高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选和鉴定带来不必要的浪费。因此，就出
12、现了标准化cDNA文库。标准化cDNA文库（normalized cDNA library）又称为等量化cDNA文库，即某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中、且含量相等的cDNA 文库。这种文库主要有3个方面的优点：增加克隆低丰度mRNA 的机会，适用于分析分化发育阶段的基因表达及突变检查； 基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用是小柯论文网通过网络搜集，并由本站工作人员整理后发布的，基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用是篇质量较高的学术论文，供本站访问者学习和学术交流参考之用，不可用于其他商业目的，基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用的论文版权归原作者所有，因网络整理，有些文章作者
13、不详，敬请谅解，如需转摘，请注明出处小柯论文网，如果此论文无法满足您的论文要求，您可以申请本站帮您代写论文，以下是正文。等量化的cDNA可做探针来发现基因组序列中的转录区，尤其是普通探针所不能发现的稀有转录区；与原始丰度的mRNA拷贝数相对应的cDNA 探针与标准化的cDNA 文库作杂交，可估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织表达特异的基因12。3.3消减cDNA文库 要产生消减cDNA文库，抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）是最有效、最流行的方法之一。可以用这种有效的技术来比较2个mRNA群体，并获得只在一个群体中过量表达
14、或特异性表达的基因cDNA。这项技术还可以用来比较基因组DNA群体。抑制性消减杂交技术是1996年DiatchenkO等14建立的。该方法是基于Lukyanov等提出的抑制PCR效应15。这个方法的关键特征是，同时进行标准化于消减步骤，标准化步骤使目的样品中的DNA片段含量相等，消减步骤则排除了所比较的2个样品中的一致序列16。SHH除去了任何需要物理方法分离单链（ss）DNA与双链（ds）DNA的中间步骤，只需要1轮消减杂交，即可以使差异表达的DNA片段富集1 000倍以上。该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用17。4鱼类基因文库构建及其应用鱼类基
15、因组文库的构建对鱼类功能基因的研究具有重要意义。Quiniou等18利用pBeloBAC11载体建立了斑点叉尾鮰（Letalurus punctatus）含有53 500个克隆的BAC文库，平均插入片段长度为113165kb，具有7.2倍的斑点叉尾鮰单倍体全基因组覆盖率。这个BAC文库已经用于斑点叉尾鮰基因组物理图谱的构建和重要生长性状基因的鉴定研究19。Luo等20构建了含有313 344个克隆、覆盖护士鲨（Gingly- mostoma cirratum）全基因组11倍的BAC 文库，其平均插入DNA片段长度144Kb，通过BAC末端测序不仅发现了在其他动植物基因组中普遍存在的LINEs和
16、SINEs结构，而且还发现了护士鲨所特有的2个重复元件NSRE1和NSRE2。进一步分析表明，该基因组文库适用于构建护士鲨的基因组物理图谱。鲤鱼是我国重要的养殖鱼类之一，是基因组最大的鱼类，在进化上也具有重要的研究价值。耿波21首次构建了黑龙江野鲤的BAC文库，该库含有46 656个克隆，插入片段大小在50300Kb之间，平均大小在100Kb左右，覆盖鲤鱼全基因组2.45倍，克隆载体为pEZBAC，大小为7.2Kb。获得的BAC克隆，保存在378块96孔板和27块384孔板中。使用8对引物（8种基因）对黑龙江野鲤BAC基因组文库进行筛选，并建立了2步3维PCR、荧光原位杂交技术和染色体显微切割
17、技术等BAC文库筛选和基因组分析方法。黑龙江野鲤BAC文库的构建，为进一步开展鲤鱼基因组、功能基因组及蛋白质组研究建立了基础。cDNA文库的构建是研究基因表达和鉴定的主要手段之一。杨明等22以细菌攻毒的真鲷鳃组织为材料，分离出mRNA，合成双链后，回收5004 000 bp cDNA片段，构建了ZAP表达型cDNA文库。初级文库的容量为1.75105个重组子，扩增文库的滴度达到1109pfu/mL，随机挑选噬菌斑的插入片断在5002 000bp之间。鲍宝龙等23通过探针杂交筛选斑点叉尾鮰BAC基因组文库，利用引物步移的方法对阳性克隆BAC047_K12进行序列测定，得到2815 bp的SCYA
18、126基因组序列。序列分析表明，SCYA126基因由2个外显子和1个内含子组成。赵艳景等利用鲨鱼再生24h的鲨鱼肝组织，分离了再生肝组织的总RNA，成功构建了鲨鱼再生肝组织cDNA文库，这为后续通过差异显示技术获得鲨鱼肝再生差异表达基因的EST序列获得差异表达基因的cDNA全序列，进而研究它们的功能，奠定了一个良好的工作基础24。李旭霞等以日本七鳃鳗唾液腺为材料，应用Gubler和Hotffman技术方法，构建以pBluescriptSK（+）载体为基础的日本七鳃鳗唾液腺cDNA筛选文库。该文库保留了日本七鳃鳗唾液腺中蛋白质的分子信息，为进一步研究其组分和作用机理奠定了基础25。梁利群等利用抑
19、制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2 000个克隆。对其中480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为8598；另外的13个克隆为未知新基因序列26。鲍宝龙等采用抑制差减杂交法，以变态前的牙鲆仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA，建立了变态早期的差减cDNA文库，并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减文库的平均插入片段558 bp左右，阳性率为81.8。随机测定的45个克隆，在剔除假阳性克隆后，共得到22个不同的基因27。5展望基因组文库具有十分广泛的用途，如用于
20、分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、基因组工程和基因组物理图谱构建等研究，对于重要的濒危物种或珍稀物种的基因组文库的构建非常重要。在构建基因组文库时，由于BAC具有容量大、稳定遗传、易于操作的载体系统，在E.coli中的复制受到严格控制而保持低拷贝（一般为每细胞单拷贝或2个拷贝）。因此BAC是基因组文库构建的主要首选载体。但是，由于基因组文库的构建过程比较复杂，耗时长，耗资较高，所以不适合一般的基因鉴定和筛选研究。cDNA文库由于是不含内含子的表达基因文库，可直接从中筛选到所需的目的基因，克隆全长基因进而开展基因功能研究，因此构建cDNA文库是研究功能基因组学的基本手段之一。通过构建
21、cDNA表达文库不仅可以保护濒危珍稀生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。因此，cDNA 在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是水产分子遗传学研究工作中最常使用到的基因文库，cDNA文库的构建将在鱼类分子生物学方面起到更多的作用。6参考文献 1 晓虹，金黎明. 细菌人工染色体文库的构建及应用J.生物技术通报，2005，16（6）：668-671. 2 方德福.医学分子生物学字典M.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，19
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