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1、 毕业论文肉鸡巴氏杆菌与大肠杆菌二联油乳灭活苗的研制与试用The invention of vaceine for broiler form the oil emulsion of Pasteurella and escherichia coli and Chinese herbals学 生： 指导教师： 院 系：动物科技学院动物医学系专 业：动植物检疫 班 级：2007级 论文提交日期：2011年6月9日 目录引言31 材料与方法41.1 材料41.2方法41.2.1 巴氏杆菌菌液培养51.2.2 致病性大肠杆菌菌液培养51.2.3 疫苗制备51.2.4菌苗检验52 结果62.1 菌苗检验结
2、果62.2免疫效果的测定结果见表63讨论64结论7参考文献8致谢9肉鸡巴氏杆菌与大肠杆菌二联油乳灭活苗的研制与试用 摘要：以多杀性巴氏杆菌和致病性大肠杆菌菌株制备鸡巴氏杆菌+大肠杆菌二联油乳灭活菌苗，经免疫实验表明，该菌苗在免疫后第14天即可产生坚强的免疫力；攻毒实验表明，该菌苗对大肠杆菌和巴氏杆菌保护率均为96%，免疫效果良好。临床证明该菌苗能有效地控制巴氏杆菌与大肠杆菌在鸡群中的流行，可进行推广应用。关键词：巴氏杆菌；大肠杆菌；研制；试用The invention of vaceine for broiler form the oil emulsion of Pasteurella and
3、 escherichia coli and Chinese herbals Abstract: From pasteurella(C481) and pathogenic Escherichia coli O78,vaccine for rabbit is made. The experimenls of irnmunity carried out in labs shows that the effieiency of pasteurella and pathogenic Escherichia coli are both 96 percent and the effect is excel
4、lent. The Vaccine can generate immunity quickly，which lasts long and prevents the pasteurella and escherichia coli from spreading among the rabbits. Therefore，the vaccine can be widely used in rabbit breeding farms. key words: Pasteurella；Seheriehia coli；development；on probation.引言从八十年代起步到九十年代的大规模兴起
5、，再到当代肉鸡业规模的不断发展壮大。中国的肉鸡产业发展成为农牧业领域中产业化程度最高的行业，其总体规模已占世界第二位，占鸡肉总产量的70%。2001年，中国的肉鸡产量为940万吨，其中白羽肉鸡产量为658万吨，占世界肉鸡产量的11%，占中国肉类产量的14.4%，肉鸡2001年出口40.2万吨，出口肉鸡熟食12万吨，虽然只占到鸡肉产量的8%，但直接带动了中国肉鸡32%的生产量；近年来，尽管国外肉鸡产品每年进口约80万吨左右，但是中国肉鸡产量仍以5%10%的速度持续增长。肉鸡的人均消费从84年0.9kg/人，发展到目前5.1kg/人，成为仅次于猪肉的第二大肉类消费品1。随着现代人们生活水平质量的日
6、益提高和市场经济的迅速发展，人们对畜禽肉质品的消费需求，越来越严格，但目前在养殖业中，许多化学物质如抗生素和有机化合物被用于预防疫病或作为饲料添加剂而频繁应用，便造成了耐药性病原微生物的增加，畜禽产品中药物残留增多，给人民的生命健康带来了严重的负面影响。抗生素添加剂的长期使用，使许多病原微生物均产生了耐药性，同时在畜禽及其产品中留下了药物残留，从而对畜禽疾病的防治和人类身体健康都产生了不同的影响2。大规模集约化肉鸡饲养小区的建设给防控造成了一定难度，并且在近来的临床诊疗中发现，肉鸡巴氏杆菌与大肠杆菌病日趋严重，常用药物对其极不敏感，是当前严重危害肉鸡业发展的两大疾病3。鸡巴氏杆菌病又称鸡霍乱或
7、出血性败血症，是由巴氏杆菌引起的一种急性败血性传染病。鸡霍乱病是一种发病率高、传染速度快、死亡率大的传染病，一旦爆发，可引起重大的经济损失4。该菌在自然界中广泛分布，在饲养管理不良、气温突变和鸡抵抗力降低时即可引起发病。该病肉鸡、鸭、鹅等能够互相感染，且一年四季都能发病。大部分病鸡精神沉郁，食欲减退或绝食，饮欲增加；垂头缩颈，两翅下垂，羽毛松乱，严重时呼吸困难，死前张口呼吸。有的病鸡口鼻有浆液性、黏液性分泌物流出；鸡群中许多鸡表现摇头，鸡冠、肉髯呈暗红色或青紫色，排灰绿色或灰白色稀粪，体温升高到4243，最后发生痉挛而死亡，多数病程13天。病鸡腹膜、皮下组织及腹部脂肪小点出血；心包内积有不透明
8、毖黄色液体，心冠脂肪出血明显；肺瘀血和出血；肝脏肿大12倍，质脆，呈黄棕色，表面有灰白色针尖状坏死点；脾肾充血、肿大，质地变软；肌胃出血显著，肠道尤其是十二指肠呈卡他性出血性肠炎，肠系膜出血，肠内容物含有血液；气囊和肠管表面有黄色干酪样渗出物4。鸡巴氏杆菌病的治疗一般单纯采用抗生素治疗，虽能控制病情，但疗程长，一般在57天后才能恢复正常。如采用鸡多杀性巴氏杆菌制成的灭活菌苗，则效果甚好，能使鸡群较快地恢复健康，缩短病程，一般35天即可控制病情5。肉鸡大肠杆菌病是危害养鸡业的重要细菌性疾病，发病率10%以上，病死率极高。我国每年因大肠杆菌病死的肉鸡，经济损失达1亿多元6。 肉鸡大肠杆菌病是由大肠
9、杆菌引起的一种常见多发病。其中包括脐带发炎、卵黄吸收不良、大肠杆菌性腹膜炎、气囊炎、眼炎等多种疾病。各种年龄的鸡均可感染，但因饲养管理水平、环境卫生、防治措施的效果，有无继发其它疫病等因素的影响，本病的发病率和死亡率有较大差异。集约化养鸡在主要疫病得到基本控制后，大肠杆菌病有明显的上升趋势，已成为危害鸡群主要细菌性疾病之一，应引起足够重视7。 大肠杆菌在自然环境中，饲料、饮水、鸡的体表、孵化场、孵化器等各处普遍存在，该菌在种蛋表面、鸡蛋内、孵化过程中的死胚及毛液中分离率较高。因经构成了养鸡全过程的威胁。急性败血型病例呈急性死亡，雏鸡死前健康，嗉囔充满食物。实质器官肿大出血，肝呈铜绿色，肝表面有
10、灰白色坏死灶。气囊炎经常和支原体病并发，表现呼吸道症状，呼吸困难，喘气，呼吸锣音，张口伸颈等。胸、腹等气囊壁增厚呈灰黄色，气囊膜上有数量不等的纤维素渗出物或干酪样物，呈淡黄色或黄白色。肠炎，病鸡排淡黄色、灰白色或绿色混有血液的稀粪便。小肠黏膜充血、出血。脐炎双称脐带炎、大肚脐，发生在1-6日龄内雏鸡，病鸡精神沉郁，食欲不振，腹部大，脐孔及周围皮肤发红，水肿，形成结痂或脐带残留等。肉芽肿，心、肝、十二指肠及肠系膜有黄白色大小不等的肉芽结节，肠粘连，肝表面有大小不一的坏死灶。关节炎，关节肿大，关节液中有纤维素，关节液浑浊。尿酸盐型，脑炎主要发生在雏鸡，病鸡呈昏睡状，有神经症状如望星星，扭头，腿麻痹
11、，瘫痪等。排黄色、灰白色及绿色恶臭稀便。大脑有黄白色坏死灶8。本次研究制备肉鸡巴氏杆菌与大肠杆菌二联油乳灭活苗，旨在有效地预防肉鸡巴氏杆菌与大肠杆菌病的发生，降低养肉鸡用药成本，减少药物防治这两种病引起药物残留，提高鸡肉的质量，具有非常重要的现实意义。1材料与方法1.1 材料（1）肉鸡，购自北京安定泰和孵化厂（2）多杀性巴氏杆菌(c一481)菌种9，购买于中国兽医药品监察所，批号（G190E40）（3）大肠杆菌O78菌种10，购买于中国兽医药品监察所，批号（010521）（4）化妆品级10#白油、司班一80，吐温一80、硬脂酸铝，购买于天津大学化学试剂商店。（5）胶体磨，型号 JMS-180,
12、厂家 廊坊市盛通机械有限公司。1.2方法1.2.1巴氏杆菌菌液培养 培养基为加人0.1%裂解血球全血和0.1%葡萄糖的马丁肉汤11。将真空冻干保存的C一481菌种在马丁肉汤中复苏后，通过兔体一代复壮，然后无菌采集发病兔的肝脏，用平板划线法接种到血液琼脂平板上，于37培养24h后选择3个以上典型、光滑、F0型菌落，接种到改良马丁琼脂斜面上，于37培养24h后作为种子，将种子再接种到上述液体培养基内，于37培养24h后，经过纯种检验后即可作为种子液使用。制菌苗液是用上述马丁肉汤培养基加人2%种子液，装成浅层，于37培养24h，培养过程中每隔2h震荡一次。1.2.2致病性大肠杆菌菌液培养 将真空保存
13、的O78冻干菌种分别在加5%葡萄糖的普通肉培养基中复苏后，以平板划线法接种到普通琼脂平板上，培养18h后选择3个以上典型大肠杆菌菌落，通过革兰氏染色法染色，再以相应的O血清作玻片凝集反确定菌型后，接种培养到含5%葡萄糖的普通肉汤培养基中37培养24h，经计数、纯检后备用。1.2.3疫苗制备水相:取多杀性巴氏杆菌（6109个单位）12、大肠杆菌菌液（61010个单位）13，1:1混合后加适量的福尔马林，37灭活24h，经无菌检验合格后备用，无菌蒸馏水与吐温-80按体积比3：1混合，充分振摇溶解，高压后冷却到常温，然后将菌液与吐温水溶液充分振荡混合均匀备用。 油相：白油中加2%硬脂酸铝，边加热边搅
14、拌至硬脂酸铝完全溶解，再把全量2%司班-80加入溶解了硬脂酸铝的白油中，搅拌至充分混合均匀，无菌条件下冷却到常温备用14。制苗时按照油相、水相2：l(体积比)的比例，先将油相倾入胶体磨内，在2 000 r/min转速下缓缓加入水相使之混合，然后在10 000 r/min转速下，是混合物通过胶体磨完全乳化，即成为均匀稳定的乳白色油乳佐剂苗。分装至灭菌疫苗瓶中,加塞、封蜡、贴上标签，置28保存备用15。1.2.4菌苗检验(1)粘度检验。在室温下吸取lmL油乳苗，测定垂直放出0.4mL所需要的时间16。(2)稳定性检验。取油乳苗于离心管中3ooor/min离心15min观察其分层现象。(3)无菌检验
15、。将疫苗分别接种于血液琼脂平板和血清肉汤中于37培养24一48h，观察有无细菌生长。(4)安全实验。选用30日龄健康肉鸡10只，每只大腿内肌肉注射所制菌苗3mL，观察7一14d记录肉鸡的反应情况。(5)免疫效果测定。将150只健康肉鸡平均分成五组，分别记为A、B、C、D、EA、B、C三组肉鸡分别肌注1mL菌苗，D、E两组肉鸡不注射菌苗15天之后进行攻毒，A、D组攻大肠杆菌，B、E组攻巴氏杆菌，C组不攻毒记录结果2结果2.1菌苗检验结果2.1.1粘度lmL吸管垂直放出0.4mL菌苗需26s，不超过15s，所制疫苗完全合格。2.1.2稳定性经3000r/min离心，油乳苗未出现分层现象，完全合格。
16、2.1.3无菌检验37培养24-48h后血液琼脂和肉汤均无细菌生长。2.1.4安全性检验10只接种鸡精神、体温均正常，食欲良好，无不良反应。2.2免疫效果的测定结果 表1 免疫效果的测定结果A B C D E 每组数量 50 50 50 50 50攻毒菌种 大肠杆菌 巴氏杆菌 不攻毒 大肠杆菌 巴氏杆菌存活数量 48 48 50 25 20保护率 96% 96% 100% 50% 40% 3讨论3.1本菌苗使用油乳为佐剂，既可激发机体的特异性免疫功能，又可增强机体的非特异性免疫功能，同时又能延长菌苗在机体内的存留时间，延长机体的免疫期，免疫效果明显优于氢氧化铝胶苗。3.2与活疫苗相比，优点：稳
17、定，易于保存和运输；不受循环抗体影响安全性好；能杀灭任何可能污染的生物因子。且油苗能使鸡群免疫水平整齐度教高，因为抗原含量高，所以接种油苗后，受机体中和抗体的影响小，另外接种油苗是逐只注射，漏鸡很少，免疫密度极高。3.3制苗全部用国产优质原料，价格低廉，菌苗粘度适中，无毒，佐剂免疫性能好，剂型稳定，宜于推广。3.4目前，养殖户多用药物治疗和防疫，即使有的鸡场用了疫苗也多是从病鸡体内分离的菌种，安全性比较差，本实验所制备的疫苗安全可靠，并可大规模生产。因此具有广阔的前景。3.5虽然本疫苗对制苗所用的巴氏杆菌和大肠杆菌的血清型对应的菌种保护率很高，但巴氏杆菌和大肠杆菌的血清型有很多，且各血清型之间
18、并无交叉保护作用，因此必须用疫病流行时病原菌所对应的血清型菌种所制的疫苗才具有保护作用。基于这一点，应尽量使疫苗中有更多的血清型的菌株，可以考虑制备基因工程苗。将具有不同血清型、能够控制合成不同致病性蛋白的基因结合到一种细菌上从而达到对多种菌株的免疫保护。4结论本实验研制的疫苗经实验室检验，表明疫苗粘度合格，稳定性好，无菌检验及安全性检验结果合格，免疫效果的测定结果表明疫苗的保护率在95%以上，因此肉鸡巴氏杆菌与大肠杆菌二联油乳灭活苗的研制达到了国家规定的标准17，可以用于推广使用。参考文献1李文晟,徐钟钧,孙德文.糖萜素与黄霉素对艾维茵肉鸡生产性能影响J.饲料广角,2003(2):12-13
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