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1、草莓叶柄再生不定芽的研究 摘要: 目前植物转基因技术已成为植物定向遗传改良的主要手段,而建立稳定高频离体再生体系是实现遗传转化的基础和前提。本研究拟利用草莓的叶柄诱导不定芽，完善草莓的高效再生体系，为应用基因工程进行草莓品质改良的研究奠定基础。本试验采用Hinonine,Tudla,丰香，全明星，明星花五个品种，比较不同品种叶柄再生的差异。11个植物生长调节剂的组合，预期筛选出适合叶柄再生不定芽的最佳培养基配方，并对叶柄上、中、下，不同部位的诱导率进行比较。试验结果表明, 叶柄下部的诱导率比较高。Tudla这个品种叶柄再生性相对较高。对某一特定的品种来说,外植体基因型和外源激素种类及其合适浓度
2、是决定再生的主要因子。关键词：草莓;叶柄；不定芽再生；Study on Regeneration System for Strawberry petioles in vitro Horticulture 200305 Xie Hongjing Supervisor: Zhang Xueying Abstract: Nowadays, the gene transformation of plants has been one way of plant directional genetic breeding, and the establishment of high-frequency sy
3、stem is the base and precondition of genetic transformation.Strawberr petioles were investigated for factors affecting the regeneration of adventitious bud, and a highly efficient regeneration system of leaf in vitro was established .This experiment use Hinonine,Tudla,Fengxiang ,Allstar,Starflower t
4、o compare with the difference of the Strawberry leaf petioles. Eleven control conditions,choose the best one . And study the position of the Strawberry leaf petioles. The result showed that, the upper part of the Strawberry leaf petioles is better .and the tudal is the better breed.To a specific gen
5、otype, the genotype of explants and the type of exogenous hormones were the main factors affecting regeneration.Key word：Strawberry; Leaf petioles; Adventitious shoot regeneration;1.引言1.1 目的意义草莓(Fragaria ananassaDuch)是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物。以往草莓品种改良多采用常规杂交育种技术,但育种周期长,选择效率低,现代生物技术开辟了草莓育种新途
6、径。再加上草莓生长周期短,无性繁殖等特点,较适合用基因工程技术育种。目前,利用植物生物技术将目的基因导入草莓,实现以草莓作为植物反应器生产药用蛋白质从而获得具保健功能性鲜食水果,前景诱人。但利用现代生物技术对草莓进行定向遗传改良的前提,是建立高效、稳定的离体再生体系。1本研究以国内主栽草莓品种为研究对象,对影响草莓叶片、叶柄再生的主要组培因素进行了研究,为草莓遗传转化奠定基础。另外草莓是一种营养价值和经济价值较高的多年生草本果树，分布范围较广，因其色、香、味俱佳，深受消费者青睐。其栽培品种和类型繁多,据不完全统计,现在全世界约有草莓品种2 000多个。近年来,我国草莓生产发展迅速,提高草莓的品
7、质及其抗性,以获得更具经济价值的草莓新品种成为当务之急。植物基因工程作为现今植物改良育种的有效手段极大地推动了草莓育种工作的进程。自1990年以来,关于草莓遗传转化的研究,国内外已陆续有了一些文献报道,草莓成为继核桃、苹果之后第三个获得转基因植株的果树。2近年来，我国草莓栽培面积迅速增长，但目前生产中大量栽培的品种，多是从国外引入的，普遍存在着抗病虫能力差、抗逆性差及品质下降等问题，限制了草莓产业的进一步发展。因此迫切需要选育适合我国不同气候条件的、抗性强的优良品种。草莓栽培品种多为八倍体，遗传上高度杂合，杂交后代广泛分离，使优良性状很难集中在子代中。我国野生草莓种质资源非常丰富，有许多优良性
8、状。但其染色体倍性较低，绝大多数为二倍体，少数为四倍体、五倍体或六倍体，与栽培草莓间的遗传差异较大，难于在常规育种中直接利用。为了选育出优良的品种，人们正积极探索将多种育种途径结合起来，特别是把现代生物技术与常规育种方法相结合，以提高育种效率，加速育种进程。近年来，基因工程取得了很大的进展，草莓遗传上的高度杂合性、染色体的多种倍性和丰富的野生草莓资源，使得转基因操作成为草莓育种的一种重要手段。应用基因工程技术进行草莓品种改良，建立一个高效的再生体系是基因工程的基础。本研究拟利用草莓的叶柄诱导不定芽，选用Hinonine,Tudla,丰香，全明星，明星花五个品种，为了完善草莓的高效再生体系，为应
9、用基因工程进行草莓品质改良的研究奠定基础。1.2 国内外研究近况 草莓的叶片和叶柄是以两种方式形成再生芽，一部分是由愈伤组织形成层细胞局部快速分裂形成的；一部分不经过愈伤组织直接经表皮细胞脱分化形成的。柯善强3等（1988）以Alkotar 幼嫩的叶片为材料离体培养，发现MS+BA1.5mg/L-2.5 mg/L+NAA0.1 mg/L的培养基上可以直接诱导不定芽，同样可继代培养丛生芽。宋国庆4等对红丰草莓叶盘进行不定芽诱导发现MS+BA1.0 mg/L+IAA 2.0mg/L上的叶盘成芽率最高，可达79.1%，叶柄在MS+BA1.0 mg/L+IBA1.0 mg/L上的再生频率为50.3%，
10、在MS培养基上再生苗生根效果好。张志宏5等通过“弗吉尼亚”等品种的叶片再生研究，发现TDZ与生长素类物质配合使用对叶片的再生效果明显优于6-BA。孙瑞芳等研究表明草莓的基因型不同再生能力不同，星都一号的叶柄再生不定芽能力最强，全明星的叶片及叶柄再生不定芽的能力都比较强。叶柄取3-5mm长为宜，不定芽多从叶柄周缘愈伤组织处形成，少数可从切口边缘直接再生。2. 材料与方法2.1 试验材料供试品种为Hinonine,Tudla,丰香，全明星，明星花五个品种的组培苗,用MS+BA0.5mg/L(单位下同)+IBA0.1和MS+BA 0.8+IBA 0.1作增殖培养基。叶片和叶柄取自在MS培养基生长30
11、天的组培苗,叶柄切成5mm的小段。2.2培养基及培养条件用MS(Murashige&Skoog,1962)无机盐、B5(Gamborg等,1968)维生素、蔗糖30mg/L和琼脂7.0g/L,加不同组合的植物生长调节剂(PGR),调节pH值至5.8, 然后分装到100ml的无菌广口瓶中在121条件下灭菌20分钟, ,每瓶装3040mL制成草莓叶柄的再生培养基。接种叶柄后,暗培养4天,然后转到16/8小时光暗条件下培养,温度为252,每两周更换一次培养基。当芽苗长至12cm时,置MS培养基上延长生长与生根约4周后,开瓶练苗1周,洗净根部的琼脂,移入装有花卉营养土的小盆,置温室内,并用塑料薄膜覆盖
12、保湿1周。2.3 植物生长调节剂的组合植物生长调节剂分别设定BA 0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L；IBA 0.25mg/L、0.5mg/L 、1.0mg/L、2.0mg/L。具体方案见表1。表1 诱导培养基（单位：mg/L） 处理BAIBA处理BAIBAC1 1.50.25C71.50.5待添加的隐藏文字内容2C21.50.5C82.00.5C31.51.0C93.00.5C41.52.0C101.01.0C50.50.5C112.01.0C61.00.53结果与分析3.1外植体基因型对芽分化的影响实验发现，所用的五个品种均在芽分化培养基上培养1
13、-2天后，伤口出现黑色，7天左右均能在伤口处形成可见愈伤组织，Tudla愈伤率达到100%，丰香、全明星、明星花、Hinonine，愈伤率达到80%以上。全明星常形成粉红色愈伤组织；丰香愈伤形态较小并且多呈黑色；Hinonine，明星花愈伤组织形态较小；全明星和Tudla愈伤致密而且绿。叶柄接种后两周左右,叶柄两端伤口处可见绿色愈伤组织,4周左右愈伤组织中开始分化出小芽,6周时芽的分化达到高峰,分化的叶柄顶部分化出芽,少数叶柄两端均可分化出芽,每个再生叶柄分化芽数为3-5个。,每个再生叶柄形成芽的数目则随时间的推移增长加快。相同分化培养基上不同基因型草莓外植体再生情况列表如下。（见表1）表1
14、相同分化培养基上不同基因型草莓外植体再生情况品种外植体数愈伤数再生率/%Tudla303032全明星30226.7丰香30220明星花302713.3Hinonine30293.3注：每个处理3个重复，每个重复含有10个外植体3.2不同外源激素及其种类对草莓再生的影响不同激素种类和浓度配比是决定植物离体细胞脱分化与再分化的关键外因, 植物生长调节剂调控着草莓的离体形态建成反应。控制着细胞的再分化方向。在诱导草莓叶柄分化的试验中,大多数的不定芽发生都经历了愈伤组织阶段。实验设立不同浓度把BA以及IBA与不同生长素组合对草莓叶柄再生的影响,见表2。试验发现,Tudla在MS+BA 05 mg/L+
15、IBA 05 mg/L再生效果好,尤其是叶柄下部的再生率高达60%,平均再生芽数610个，而叶柄上部和中部的平均出芽数也能达到17和18。在MS+BA 15 mg/L+IBA 10 mg/L中，上中下部位的出芽率均能达到30%， 在MS+BA 15 mg/L+IBA 05 mg/L中再生效果也比较好，平均出芽率均能达到110。总的来说Tudla的出芽情况在五个品种中是最好的,培养30天左右叶柄愈伤形态最大,颜色深绿色。明星花在 MS+BA 15 mg/L+IBA 025mg/L中，也柄下部的出芽率达到25%， 在MS+BA 10 mg/L+IBA 05 mg/L中，叶柄生长愈伤后直接长根，根系
16、在上中下部位生长都非常明显。全明星的愈伤长的普遍偏小，但在MS+BA 15 mg/L+IBA 20 mg/L中，上中下部位均有出芽，出芽率达到10%，品均再生芽数210。丰香愈伤率较高，能达到80%以上，但是愈伤形态较小，黑色，只有个别出芽，芽的长势也比较弱。Hinonine愈伤都非常小，只有在MS+BA 05 mg/L+IBA 05 mg/L出现异常，愈伤大，而且颜色鲜绿，出芽率达到10%。表2不同培养基对草莓叶片诱导不定芽的影响培养基（mg/l）Tudla全明星愈伤率（%）出芽率（%）愈伤率（%）出芽率（%）MS+BA1.5+IBA0.251000200MS+BA1.5+IBA0.5100
17、30500MS+BA1.5+IBA1.0100101003.3MS+BA1.5+IBA2.01001096.76.7MS+BA0.5+IBA0.51006073.30MS+BA1.0+IBA0.510001000MS+BA1.5+IBA0.51006.71000MS+BA2.0+IBA0.51000900MS+BA3.0+IBA0.5100083.30MS+BA1.0+IBA1.010001000MS+BA2.0+IBA1.010001000培养基（mg/l）丰香明星花Hinonine愈伤率（%）出芽率（%）愈伤率（%）出芽率（%）愈伤率（%）出芽率（%）MS+BA1.5+IBA0.25100
18、070.62500MS+BA1.5+IBA0.5100053.3013.30MS+BA1.5+IBA1.060084.3013.30MS+BA1.5+IBA2.096.7090016.70MS+BA0.5+IBA0.573.309002010MS+BA1.0+IBA0.590043.3096.70MS+BA1.5+IBA0.583.3043.3076.70MS+BA2.0+IBA0.590010016.773.30MS+BA3.0+IBA0.593.3058.3093.30MS+BA1.0+IBA1.0100055093.30MS+BA2.0+IBA1.093.31093.312.5700注
19、以上统计的数据均为叶柄再生培养4周左右，随着时间推移出芽率还在继续增长。4.讨论本实验表明像多数植物一样,草莓植株再生频率的高低也因基因型及所用的植物生长调节剂的配比而异。在本试验条件下,Tydla品种和全明星的再生能力显著地高于丰香、Hinonine,各自获得最高再生频率所需的生长调节剂组合也不同。本试验的结果显示,同一基因型同一组织和器官的不同部位的再生能力不尽一致,而且对培养条件的要求也有差异。试验表明，草莓叶柄的下部和中部的再生能力明显比上部好。资料显示叶圆盘的再生能力高于叶柄,而且达到最高再生频率(79.1%)时所需的BA浓度高于叶柄,这也许与叶片和叶柄中内源植物生长调节剂的含量及其
20、利用能力的差异有关。在其他园艺作物,如猕猴桃与菠菜上,叶柄的再生能力高于叶片。本试验还表明,同一基因型的同一组织同一部位在不同的生长调节剂种类及浓度配比不同的情况下，草莓叶柄的愈伤率和出芽率也表现出显著的不同。通过试验表明，Tudla的最佳培养基配方为MS+BA 05 mg/L+IBA 05 mg/L。全明星的较好的培养基配方为MS+BA 15 mg/L+IBA 025mg/L。5参考文献1 张利义,高遐虹,于同泉,王有年.草莓离体再生体系的研究J 北京农学院学报2004,19(2);572 吴雪梅,汤浩茹.草莓叶片培养研究进展J 果树学报2004,21(6);5986023 柯善强，洪树荣. 植物激素对草莓叶片不定芽形成的影响J 南京农业大学学报1992,15(2);21284 宋国庆,肖兴国,李绍华草莓叶片和叶柄再生体系的建立J落叶果树,2000,(2):5-85张志宏,吴禄平,代红艳草莓主栽品种再生和转化的研究J园艺学报,2001,28(3):189-1936魏源文,张向军,陈丽娟草莓叶片再生体系的建立J广西农业科学,2004,(1):17-187闫华晓,赵辉,崔德才影响草莓叶片植株再生因素的研究J山东农业大学学报,2003,34(2):177-1808董淑英,李世润,刘元勤草莓离体培养产生匍匐茎研究北方园艺,1999,126(3):28-29
