铁皮石斛4CL基因的克隆与序列分析毕业论文.doc
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1、安 徽 农 业 大 学毕 业 论 文(设计) 论文题目 铁皮石斛4CL基因的克隆与序列分析 姓 名 学 号 学 院 生命科学学院 专 业 生物技术 中国合肥二零一四 年 五 月目录中文摘要1关键词11.材料与方法21.1 试验材料21.2 试验试剂21.3 试验方法21.3.1 铁皮石斛总RNA 的提取与cDNA 第一链的合成21.3.2 引物设计21.3.3 铁皮石斛4CL基因cDNA核心片断的获得21.3.4 5RACE 和3RACE 扩增21.3.5 铁皮石斛4CL基因全长cDNA的克隆31.3.6 序列分析32. 结果与分析32.1 铁皮石斛总RNA提取质量的检测32.2 铁皮石斛4C
2、L基因核心片段的克隆与鉴定32.3铁皮石斛4CL基因的RACE扩增与序列鉴定42.4 铁皮石斛4CL基因全长cDNA的克隆与鉴定52.5 氨基酸序列序列比对和进化分析53. 讨论7参考文献8Abstract9Keywords9致 谢9铁皮石斛4CL基因的克隆与序列分析摘要:本试验采用同源扩增技术和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends RACE)技术对铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase 4CL)基因进行克隆。根据基因的保守性,利用NCBI数
3、据库中其他植物的4-香豆酸:辅酶A连接酶的氨基酸保守区设计简并引物。序列分析表明,该基因全长为1650bp,编码549个氨基酸,具有4CL基因家族的特异序列。系统进化树分析显示,4CL的氨基酸序列进化方向与植物基本保持一致,符合从低等到高等、从简单到复杂的演变过程。对铁皮石斛4CL 基因的克隆,为进一步研究4CL基因参与的植物次生代谢途径奠定了基础。关键词:铁皮石斛;4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL);基因克隆 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生草本植物,因表皮呈铁绿色而得名。按形态、产地等分类,石斛属植物可分为铁皮、金钗
4、、霍山、黄草、环草、马鞭等数十个品种,其中以铁皮石斛最为珍贵。研究表明铁皮石斛具有生津养胃、滋阴清热、护肝利胆、明目强腰的功效,此外还具有抗肿瘤、降血糖、增强机体免疫力、抗氧化衰老等疗效。在植物界,铁皮石斛素有“软黄金”“千金草”之盛誉,是民间传说中的“救命仙草”,国际上称其为“药界大熊猫”。野生铁皮石斛多生于海拔1003000m之间的山地半阴岩石或树皮上,喜温暖湿润气候和半阴湿的环境,不耐寒1。由于它生长及繁殖条件十分苛刻,自然产量极为稀少,更因环境破坏,过度采挖,致使野生资源濒临绝种。 研究铁皮石斛的代谢途径与调控,有助于更好地开发利用铁皮石斛的市场价值。 苯丙烷类化合物生物代谢途径是一条
5、与碳循环有关的最主要的次生代谢途径之一。在植物中,该途径的各种分支途径可以产生许多天然产物如黄酮、类黄酮、木质素、色素、芪类、酚酸类化合物等2。作为该代谢途径中关键限速酶之一的4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase 4CL),控制着苯丙烷类化合物代谢途径向不同的方向进行,处在总途径向各分支途径的转折点。前人的研究结果表明,4CL基因在植物与环境的相互作用中也起着重要作用。经研究证实,除了多糖外,铁皮石斛中的酮类、芪类物质也具有重要的药理活性,如-紫罗兰酮具有抑制肿瘤生长的作用3;芪类化合物是一种抗菌的植物抗毒素,具抑菌抗氧化抗肿瘤等多种生物活性4,
6、Li Yan 等5,6曾从铁皮石斛茎中分离得到27个芪类及其衍生物。因此,研究铁皮石斛中的4CL基因,对解析铁皮石斛次生物质代谢调控及人类健康事业具有重要意义。 本文主要研究铁皮石斛4CL基因的克隆及其序列分析。以铁皮石斛为实验材料,参考其它植物4CL基因的序列,利用DNAstar软件设计简并引物,克隆铁皮石斛4CL基因cDNA片段,利用RACE ( rapid amplification of cDNA ends )技术获得该基因的3和5末端序列,进而获得该基因的全长cDNA。同时利用GenBank数据库和Blast软件等对所得序列进行分析,为进一步研究4-香豆酸:CoA连接酶在石斛次生代谢
7、途径中的作用提供理论依据。1.材料与方法1.1 试验材料铁皮石斛茎叶,取自安徽农业大学生命科学学院。1.2 试验试剂 RNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司),Taq 酶、PMD18-T vector、 dNTPs和RACE cDNA Amplification Kit(均购自TAKARA 公司),Escherichia coli DH5 (由实验室制取培养),柱式胶回收纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司);引物合成以及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。1.3 试验方法1.3.1 铁皮石斛总RNA 的提取与cDNA 第一链的合成 称取0.1g铁皮石斛叶片在液氮中研磨, 按
8、照RNA 提取试剂盒说明书进行总RNA 的提取,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量。 取2gRNA,根据cDNA 第一链合成试剂盒操作说明书,合成cDNA 第一链。1.3.2 引物设计利用DNAMAN 6.0软件,根据NCB I数据库中其他植物的4CL 基因的保守区设计引物 (表1)。表1 引物名称及序列Table1. Names and seqences of the primers引物用途引物名称引物序列(5-3)核心片段4CL-SGTNGCNCARCARGTNGAYGGNGA4CL-ASTCNGCNGGGNGSNACYTGRAANCC3 RACE3-inTTTGACCTCGTGAA
9、GTTGATGG3-outATGTTCTGCTCTGCGTGCTT5 RACE5-inTTAGCCGTAAGCGTATCCTG5-outCTATGGGAGGCACAAATGGCCDS 全长CDS-SATGGGCTCAATTTCGCCGGAATTCCDS-ASTCACTGTGTCAGACCATTCTGGAC1.3.3 铁皮石斛4CL基因cDNA核心片断的获得 以所得到的铁皮石斛cDNA第一链为模板进行PCR 扩增,产物经回收、纯化后连接到pMD18-T 载体上,转化后,选择阳性克隆菌液送到公司测序。利用NCBI 的BLAST 工具对所测序列进行同源性比对,确认所获序列是否为目的基因片段。1.3.
10、4 5RACE 和3RACE 扩增 根据4CL基因cDNA核心片段的测序结果设计5RACE 和3RACE 的基因特异引物(表1)。利用通用引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)和特异引物分别进行5RACE和3RACE 扩增。将扩增的产物经回收、纯化后连接到pMD18-T 载体上,送到公司测序。1.3.5 铁皮石斛4CL基因全长cDNA的克隆 根据所获得的铁皮石斛4CL基因的保守区片段、5和3 端序列,进行序列拼接,得到4CL基因全长cDNA 的拼接序列。根据拼接序列,分别在5 端和3 端设计引物(表1),然后进行PCR 扩增,获得全长cDNA的 克隆,送到公司进行双向测序。1.3.6 序列分
11、析 利用DNAman 6.0软件进行序列比较和构建进化树。2. 结果与分析2.1 铁皮石斛总RNA提取质量的检测 利用琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量。如图1所示,使用改良RNA提取法所提取的铁皮石斛总RNA质量较好,28SrRNA和18SrRNA两条带比较清晰,亮度对比鲜明,无其他明显杂带,点样孔干净,说明总RNA在提取过程中没有被降解,大小完整,也没有蛋白质、DNA等其他杂质的污染,可以满足后续实验。 图1 铁皮石斛总RNA凝胶电泳图Fig.1 Gelelectrophoresis of RNA extracted from D.officinale2.2 铁皮石斛4CL基因核心片段的
12、克隆与鉴定 如图2所示,通过RT-PCR扩增技术,从铁皮石斛的cDNA 中扩增预期片段,目的片段大小约400bp,与Marker的比对可以看出扩增出的条带大小符合预期片段大小。胶回收产物经TA克隆和测序后得到该基因核心片段长度为356bp, 利用NCBI数据库中的Blast工具,对该基因核心片段进行同源性比对分析, 发现该序列与其他植物的4CL的核酸序列相似度较高, 说明所获片段为铁皮石斛4CL基因的核心片段。 1 2 3 4 5 6 7 M 图2 铁皮石斛4CL基因核心片段的扩增产物 Fig.2 The amplification products of 4CL gene core frag
13、ment from D.officinaleM: DNA 标准分子量; 1-6. PCR 扩增产物;M: DNA Marker; 1-6. PCR products2.3铁皮石斛4CL基因的RACE扩增与序列鉴定 用琼脂糖凝胶电泳进行检测3 RACE 扩增片段,电泳结果如图3所示,通过与Maker比对,可以看出3RACE扩增片段大小约为1kb。将扩增片段进行胶回收后,用PMD18-T vector连接转化,克隆测序,得到一条大小为1140bp 的片段。利用Blast工具将所得片段进行同源性比对,发现该片段与多种植物的4CL基因核酸序列相似性达80%以上,且含有终止密码子,说明3端序列完整。 用
14、琼脂糖凝胶电泳进行检测5 RACE 扩增片段,电泳结果如图4所示,通过与Maker比对,可以看出5RACE扩增片段大小约为800bp。将扩增片段回收后,克隆测序,发现该片段与核心片段有重复序列,与引物设计相符,说明这个序列为铁皮石斛4CL基因的5端序列, 测序长度为823 bp。 图3 4CL基因cDNA3端的扩增产物 Fig. 3. 3RACE product by agrose geleletrophoresis 图4 4CL基因cDNA5端的扩增产物 Fig. 4 . 5RACE product by agrose gel eletrophoresis2.4 铁皮石斛4CL基因全长cDN
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