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1、第五章 发酵工艺条件的确定,主讲人：刘萍,第三章 发酵工艺条件的确定,第一节 培养基的选择和确定第二节 培养条件的确定,第一节 培养基的选择和确定,一、培养基的营养成分二、培养基的用途三、发酵培养基的选择四、培养基成分的营养与作用五、培养基确定方法六、正交试验在培养基确定中的应用,一、培养基的营养成分,微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现的。所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑
2、上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。,微生物的营养来源,（1）能源 自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚铁盐。异养菌：碳水化合物等有机物，石油天然气和石油化工产品，如醋酸。,（2）碳源：碳酸气；淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等石油、正构石蜡，天然气醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品,（3）氮源豆饼或蚕蛹水解液，味精废液，玉米浆，酒糟水等有机氮尿素，硫酸铵，氨水，硝酸盐等无机氮气态氮,(4)无机盐磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等其他矿盐铁、锰、钴等微量元素其他（5）特殊生长因子硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等,二、培养基的用途,筛选菌种保藏菌种检验杂菌培养种子发酵生产,（一）、培养
3、基的分类（二）、发酵生产中的培养基类型,（一）、培养基的分类,（1）按培养基组成物质的化学成分合成培养基、天然培养基。（2）按物理性质固体，液体（3）按用途选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等,（1）天然培养基 是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。适合于各类异养微生物生长，而一般自养微生物都不能生长。,（2）合成培养基,是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精 确，重复性强，可以减少不能控制的因素 适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究
4、工作。但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长。,（3）半合成培养基,多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此，在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。,（1）液体培养基：常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。根据微生物对氧的要求情况，分别作静止或通风搅拌培养。在菌种筛选工作和菌种培养工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养微生物在液体培养基中生长的情况有时也可
5、用作鉴定菌种的参考。,生理代谢菌种筛选,种子培养,发酵培养,（2）固体培养基分类：斜面试管、平板等是在液体培养基中加入凝固剂配成的，最常用的凝固剂是琼脂。,作用：固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可缺少的。在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中，用来培养霉菌等的固体种子和发酵培养基是由麸皮等农作物加无机元素等制成的。,增殖培养基：可以配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。鉴别培养基：是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。选择培养基：是在培养基内加入某种化学物质以抑制不
6、需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。,（二）、发酵生产中的培养基类型,工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为：斜面培养基种子培养基发酵培养基摇瓶培养基,1斜面培养基,作用：这是供微生物细胞生长繁殖用的，包括细菌，酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸曲培养基等。这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。,特点：1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成孢子。3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。,2种子培养基(包
7、括摇瓶种子和小罐种子培养基)：,培养种子的目的：1.扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。,种子培养基特点：1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,3发酵培养基,发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。（1）根据产物合成的特点来设计培养基：对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足
8、细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。,（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。（3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。,三、发酵培养基的选择,(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。(2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。(3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。(4)有利于提高
9、产物的合成速度，缩短发酵周期。,(5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。(6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。(8)有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。,发酵培养基的设计和注意事项,1提供必要的营养成分：培养基成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求。2配制合适的浓度：可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。3.主成分与其他成分的配比。,4控制合适的pH：微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要定的pH环境，
10、在最适pH值下有利于加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的pH适合于微生物生长或产物合成所需。,pH的具体控制方法1.可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH，但更应在配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分，使其pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要。2.还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况.,3.控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸盐作为磷的成分；或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质。,4避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深
11、褐色物质。这种物质不被微生物利用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌，而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此二者也不宜直接配成培养基。,5注意代谢调节物的影响：有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。前体物质诱导剂阻遏物抑制剂金属离子,(1)添加有关前体物质：,前作物质：是指当添加到发酵培养基中的某些化学物质基本上不改变其分子结构而直接进入产物中的小分子物质，从而在一定条件下控制产物的合成方向和提高产量。在发酵中添加前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量，如苯乙酸及其衍生物被认为是青霉素的前体物质。,(2)添加诱导物：,
12、目前工业用微生物酶多数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物。在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导物，例如淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。只有添加这些物质的培养基，才能获得高产。,(3)注意阻遏物或抑制剂的影响,培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物均能影响酶的合成，降低发酵产量。有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物的产量，最早利用抑制剂提高中间代谢物产量的例子是甘油发酵中加入亚硫酸钠。在培养基配制时必须注意加入有益的抑制剂，而避免混入有害的抑制物。,6.金属离子的影响：有些种类的发酵生产对金属离子相当
13、敏感，因为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活剂。因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用，而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的，这些在培养基配制时都必须予以注意。,四、培养基组成物质的营养与作用,碳素化合物氮素化合物 水 微量元素(无机盐类)生长因子,碳素化合物营养源对微生物生长发育的影响,(1)碳素化合物的作用构成菌体成分的重要元素，产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料，同时又是化能异养型微生物的能量来源。,（2）碳源种类糖：单糖中的己糖，寡糖中的蔗糖、麦芽糖、棉子糖，多糖中的淀粉、纤维素、半纤维素、
14、甲壳质和果胶质等，其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。有机酸如糖酸、柠檬酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、酒石酸等。,醇类中甘露醇、甘油、低浓度的乙醇。脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等低级脂肪酸都可用作碳源。油酸和亚油酸等高级脂肪酸可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用，低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长，但浓度较高时往往有毒害作用。正烷烃：一般是指从石油裂得到的14C至18C的直链烷烃混合物。,葡萄糖：是最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要。,糖蜜：是制糖厂生产糖时的结晶母液，是蔗糖厂的副产物。含有较丰富
15、的糖、氨素化合物和无机维生素等，是微生物工业的价廉物美的原料。淀粉：一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。来源丰富，价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀。,油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，氧化成水和CO2。因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。,(2)氮素化合物,氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。氮素一般不提供能量，但硝化细菌却能利用氨作为氮源和能源。就某一类微生物而言，由于其合成能力的差异，对氮营养的需要也有很大区别。,氮的来源可分为无机氮和有机
16、氮：有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。,有机氮源特点：含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子。,玉米浆：是玉米淀粉生产中的副产物，其中固体物含量在50。还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素。由于玉米浆的来源不同，加工条件也不同，因此玉米浆的成分有较大波动。,无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。微生物对其吸收利用比有机物快，所以也称速效氮。利用无机氮时应注意引起的pH变化。,实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、
17、酵母膏等作为有机氮源，工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。,(3)水,（1）水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。（2）渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的；（3）水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。（4）水的比热高，能有效地吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升。（5）水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度。,(4)微量元素(无机盐类),无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功用是：构成菌体成分；作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；
18、作为自养菌的能源。,无机元素包括主要元素(又称大量元素)和微量元素两类，这是依据微生物对它们需要量的大小划分的。主要元素有P、S、Mg、K、Ca等；微量元素有Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Co、B等。当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料等都含有微量元素。,磷：是核酸和蛋白质的必要成分，也是ATP的成分。在代谢途径调节方面，起着重要作用。促进微生物生长，但过量时，许多产物的合成受抑制。,钙：培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀。可分别消毒或逐步补加。镁：处于离子状态时，是许多酶的辅酶的激活剂，不但影响基质的氧化，也影响蛋白质
19、的合成。以硫酸镁加入，但在碱性溶液中会形成沉淀。,(5)生长因子,广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。与微生物有关的维生素主要是B族维生素，这些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。凡是缺少合成生长素类物质的微生物(即缺少了合成生长素过程中的某种酶)，统称为营养缺陷型。,五、培养基确定方法,（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根
20、据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。,（2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。,（3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。注意培养过程中的pH变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pH，不断调整配比来适应上述各种情况。,（4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。其次再确定各种重要的金属和非金属离子对
21、发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内pH可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。,（5）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。,（6）根据生产和科学研究的需要选择培养基 工业上，液体深层培养具有占地面积小、发酵效率高、操作方便、易于机械化相自动化生产、降低劳动强度等优点。所以，发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行液体发酵，并根
22、据微生物对氧气的要求，分别作表面静止培养或深层通气培养。,实验室或制种车间进行固体培养常采用试管、扁瓶和培养皿。工业生产中也常采用固体原料，如小米、大米、铁皮、马铃署等直接制作斜面，或在茄子瓶表面培养霉菌、放线菌。具有设备简单、投资少、易推广等优点。大规模生产中，固体培养的缺点是占地面积多，劳动强度大，生产稳定性差。,(7)根据经济效益选择培并基原料 考虑经济节约，尽量少用或不用主粮，努力节约用粮，或以其他原料代粮。糖类是主要的碳源。碳源的代用方向主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖。同时，使用稀薄的培养基，适当减少碳氮配比 石油作为碳源的
23、微生物发酵不但可以生产以粮食为碳源的发酵产品。,有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料。代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉、黄浆水或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、菌体、酒糟，以及各种食品工业下脚料等。这些代用品大多蛋白质含量丰富，贷源充足，价格低廉，便于就地取材，方便运输。,正交试验在培养基确定中的应用,正交表因素水平,第二节 培养工艺的确定方法,一、培养条件二、菌种扩大培养,温度 pH值 氧种龄接种量,一、培养条件,1温度,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直
24、接影响其生长和合成酶。机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。微生物可生长的温度范围较广，总体说在-1095。,温度,任何微生物的牛长都需要有最适的生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的生产现实意义。,2pH值,培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的pH范围。微生物通过其活动也能改变环境的pH值。发酵过程中，控制发酵液的pH值是控制生产的指标之一，
25、pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。,培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后产生NH3，则pH上升；阳离子(如NH4、K+)被吸收或有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。,3氧,微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸)，兼性厌气菌则两者兼而有之。不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量
26、的要求也不相同。,通风和搅拌,通气可以供给大量的氧。通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。通气量的多少，最好按氧溶解的多少来决定。只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧量时，菌体才能正常地生长和合成酶。因此随着菌体繁殖，呼吸增强，必须按菌体的吸氧量加大通气量，以增加溶解氧的量。,搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有助于搅拌，使其效果更好。,一般来说，若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大，而且在这些因素确定下，培养基的粘度越小，氧的溶解速度也
27、越大。搅拌可以提高通气效果，但是过度地剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，液膜表层的酶容易氧化变性，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。,种龄与接种量,种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。接种量的大小直接影响发酵周期。,大量地接入培养成熟的菌种的优点：1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，2.节约了发酵培养的动力消耗，3.并有利于减少染菌机会，一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地移人代谢废物，反而会影响正常发
28、酵。,二、菌种扩大培养,工业微生物菌种培养的类型,工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为嫌气性发酵。通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。,(三）主要培养方法及特点,1种子扩大培养阶段(1)液体培养法 包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距)、三角瓶容量、装料量有
29、关。(2)表面培养法 包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。(3)固体培养法 包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。,2大规模生产阶段,(1)表面培养(2)固体培养(3)液体深层培养(4)载体培养,(1)表面培养,表面培养是一种好氧静置培养方法针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液(气固界面向培养基内传递，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。,这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如
30、醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。,固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。,(2)固体培养,固体培养具有以下优点：原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅
31、拌供给氧气节能。,(3)液体深层培养,用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。,深层培养基本操作的3个控制点,灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。,温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行
32、发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH而使加入的酸和碱均匀分散等。,几种深层培养法,放大法两步法控制培养法 分批发酵法(间歇发酵法)连续培养法补料分批培养法(流加法),放大法：,将微生物在摇瓶基础上逐级放大以实现大规模生产。在厌气发酵时问题归结为如何从大型发酵罐中除去发酵热。为此考虑
33、到如何利用发酵时生成的二氧化碳引起的液体流动和辅助搅拌，以提高冷却效率，这只需进行发酵罐传热面积的设计即可。,但在好氧培养中，大多以氧的供给为基准进行放大。一般从实验室规模到工厂生产要经过35级放大步骤。放大过程中应考虑：a氧传递速度相等。b比较搅拌桨叶顶端速度。c比较单位液量所需的搅拌动力。d混合时间相同。e雷诺准数相同。f通过反馈控制尽量能使重要环境因子一致。,两步法,两步法：酶制剂生产两步法的特点是将菌体生长条件(营养期)与产酶条件(自我繁殖期)区分开来。菌种先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养
34、成分或诱导物得到充分利用。在氨基酸的两步法液体深层培养中，每一步菌种和培养基等均不相同。第一步属有机酸发酵或氨基酸发酵。第二步是在微生物产生的某种酶作用下把第一步的产物转化为所需的氨基酸，这种生产方法又称为酶转化法。,控制培养法,了解发酵罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物生成的最优培养条件。用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将其结果作为反馈调节的信号，将环境(培养条件)控制于给定的基准内。这就叫做电子计算机控制发酵。目前已大量用于露天大罐啤酒发酵。,分批发酵法(间歇发酵法),
35、先将空罐杀菌，培养基装入发酵罐，接种之后进行培养，在培养过程中，培养基成分减少，微生物增殖。微生物周围的环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。此法不易染菌，但很难采用控制基质等浓度的方法来增大发酵生产能力。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。,连续培养法,在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，叫做连续培养法。其特点是能使微生物处于恒定不变的环境中进行长期持续的培养，该系统的稳态被叫做恒化器。同时包含了流入和流出，属开放系统，故变异菌株和杂菌污染随时间的延长而增大。从技术上也很难保证流入和流出速度的一致。连续培养用于废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发
36、酵等工业中。,补料分批培养法(流加法),在分批培养时，不断地供给培养基，但所需产物不到一定时刻不放出的方法，称为补料分批培养法。用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。,(4)载体培养,载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。,3影响种子培养的条件,菌种扩大培养的关键就是搞好种子罐的扩大培养。影响种子罐培养的主要因素包括
37、营养条件、培养条件、染菌的控制、种子的级数和接种量控制等。,泡沫,（1）泡沫的作用：培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和合成酶有关，泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收；妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵；由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率，甚至发生跑料，招致染菌，造成巨大损失。,（2）产生泡沫的原因通气和机械搅拌使液体分散和空气窜入，形成气泡；培养基中某些成分的变化或微生物的代谢活动产生气泡；培养基中某些成分(如蛋白质及其他胶体物质)的分子，在气泡表面排列形成坚固的薄膜。因此，气泡不易破裂，聚成泡沫层。,（3）
38、培养过程的消泡措施机械法化学法。发酵工业常用的消泡剂，有各种天然的动植物油及来自石油化工生产的矿物油、改性油、表面活性剂等。而新型的有机硅聚合物如硅油、硅树脂等，则具有效率高、用量省、无毒性、无代谢性，同时兼有提高微生物合成酶等多种优良特性，是一类有发展前途的消泡剂。泡沫的控制除了添加消泡剂外，改进培养基成分也是相辅相成的一个重要方面。,染菌的控制,（1）染菌的原因归结起来是：设备、管道、阀门漏损、灭菌不彻底；空气净化不好；无菌操作不严或菌种不纯等。,（2）染菌的控制必须加强接种室的消毒管理工作，定期检查消毒效果，严格无菌操作技术。如果新菌种不纯，则需反复分离，直至完全纯粹为止。对于已出现杂菌
39、菌落或噬菌斑的试管斜面菌种，应予废弃。在平时应经常分离试管菌种，以防菌种衰退、变异和污染杂菌。对于菌种扩大培养的工艺条件要严格控制，对种子质量更要严格掌握，必要时可将种子罐冷却，取样做纯种试验，确证种子无杂菌存在，才能向发酵培养基中接种。,种子罐级数的确定,种子罐的级数愈少，愈有利于简化工艺及控制并可减少种子罐污染杂菌的机会减少消毒及值班工作量减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。,确定方法,菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)孢子瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度发酵罐中种子培养液的最低接种量种子罐与发酵罐的容积比。随产物的品种及生产规模而定随着工艺条件的改变作适当的调整。,第三节 厌氧培养
40、,厌氧培养在发酵工业研究上是很重要的，发酵工业中的制酒等混合发酵过程有大量厌氧微生物的有益作用，特别是对己酸菌、丁酸菌、甲烷菌等的研究。细菌在有氧环境中进行代谢时，常产生超氧离子(O-)与过氧化氢(H202)，有强烈的杀菌作用。厌氧菌过氧化氢酶)和过氧化物酶，不能破坏超氧离子和H202，易被杀伤，-故在有氧时不能生长。,厌氧培养的方法,(1)深层穿刺分离培养：用一根18-20mm直径的玻璃管，截成180-200mm长，洗净烘干。一头塞入橡皮塞，加入2/3管长的营养琼脂，塞上胶塞或塑料帽，灭菌，凉至凝固。穿刺接|种或待分离物。培养后可见到生长的厌氧微生物菌落。此时拔出橡皮塞，用无菌刀切割，分离再
41、培养。此法对于一般厌氧微生物适用。,(2)深层穿刺与化学吸氧相结合：深层穿刺后，在培养基上部加一层非脱脂棉，再加一层脱脂棉，上面加入焦性没食子酸和Na2O3粉末的混合物，用胶塞或塑料帽盖紧。焦性没食子酸和Na2O3在有湿气(即水分)存在的条件下缓慢作用吸氧和放出CO2，造成厌氧状态，强化了厌氧条件。,(3)液体培养基法：液体培养基法主要是在培养基中加入一定的还原物质并隔绝空气。常见的有庖肉培养基法、硫乙醇酸钠法、牛心脑浸液培养基法等。(4)厌氧罐培养法：碱性焦性没食子酸法：焦性没食子酸与Na2O3反应可释放出O2并吸收环境中的氧。,厌氧箱培养法：厌氧培养箱由厌氧环境操作箱、恒温培养箱、高度真空传递箱、气路控制系统、箱架、瓶架等部分组成。培养箱的温度能自行调节控制，气路安排合理，能任意输入所需气体和准确调节流量。箱内备有紫外灯，可消毒操作室内空气。使用厌氧培养箱进行厌氧微生物分离培养时，整个操作过程可在正压O2或氮气下进行，使整个接种过程在无氧状态。因此，厌氧培养箱在分离，研究极端专性厌氧菌时更有其优势。,
