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1、概 念,从广义上说：凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可以称为蛋白质的化学修饰。包括两个方面：（1）侧链基团的改变；(2）主链结构的改变，前者属于化学修饰的范畴，而后者则属于基因重组和定点突变的方法。,蛋白质化学修饰的意义,改变蛋白质的药代动力学调节蛋白质的稳定性以及活性改变蛋白质的空间构象,化学修饰的原理,影响蛋白质化学修饰反应进程的因素有：1 蛋白质功能基的反应性（亲核性）1.1 基团之间的氢键及静电作用1.2 基团之间的空间位阻2 修饰剂的反应性2.1 选择吸附2.2 静电相互作用2.3 位阻因素,化学修饰的方法学,1 试剂的选择 水解稳定性；蛋白质的修饰位点，反
2、应类型以及专一性；修饰剂的大小；连接键的稳定性、毒性和抗原性；修饰后是否需要进一步的分离；是否适于建立快速、方便的分析方法；是否能够简便经济的合成或购买,反应条件的选择 考虑因素包括pH、反应温度、反应介质以及缓冲液组成 允许反应顺利进行 不能造成蛋白质的不可逆变性 有利于专一性修饰蛋白质,修饰反应的类型,酰化及其相关反应烷基化反应氧化还原反应芳香环取代反应,蛋白质的PEG修饰,聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)修饰又称分子的PEG化(PEGalation),是目前蛋白质化学修饰最重要的技术之一,是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径。,PEG是由
3、乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料,分子组成为HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH;PEG链还可以与马来酸酐进一步共聚形成梳状的PEG衍生物,简称PM。PEG分子中存在的大量乙氧基能够与水形成氢键,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余的羟基通过适当方式活化后可与各类蛋白分子相偶联。,由于PEG无毒,具有良好生物相容性和血液相容性,使它成为一种被广泛使用的生物修饰材料。对于各种具有药用潜能的蛋白来说,采用PEG修饰的目的主要有以下三个方面:(1)增加稳定性,延长血浆半衰期;(2)降低免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。,1 增加稳定性和延长血浆半衰期 一些
4、以注射方式使用的药用蛋白,由于在血液中存留的时间过短,在很大程度上限制了其正常药效的发挥。通过PEG修饰,一方面增加了分子量,降低了肾脏的排泄速率;另一方面,偶联的PEG链在蛋白分子表面产生空间位阻效应,减弱了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用,从而有效地延长了蛋白在循环系统内的保留时间。,2降低抗原性和免疫原性 通过PEG修饰来消除免疫反应活性,将异源性蛋白转化为非免疫原性的药用蛋白,主要是利用无免疫原性的PEG分子链与蛋白表面的基团相偶联,进而在蛋白表面形成一道屏障,将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状PEG具有更强的屏蔽功能,因而在这方面的应用更为普遍。,3降低毒副作用 通过基
5、因重组技术获得的大规模生产的TNF-a,IL-2 和IFN-g等是一类很有前途的抗肿瘤新药。但由于它们的血浆半衰期短,为达到显著的临床治疗效果不得不加大使用剂量,这就常常引起严重的毒副作用。近年来发现,利用PEG修饰技术对这些蛋白进行处理后,能够大大增加其血浆稳定性,降低使用剂量;或在大的使用剂量下降低毒副作用。近年来,PEG修饰已成为提高其抗肿瘤效能、降低毒副作用的有效手段。,PEG对蛋白药物修饰的研究及应用进展 蛋白药物的PEG修饰已卓有成效，国际知名的制药公司已经或正在积极推进蛋白药物的PEG修饰，1991年第一种用PEG修饰的蛋白药物PEG-ADA被FDA批准上市，近几年上市的有PEG
6、-IFN、PEG-G-CSF、PEG-生长抑素。目前处于临床前研究的PEG修饰的蛋白药物有几十种，处于临床实验的有：超氧化物歧化酶（即将上市，Enzon公司）、白介素-2（期，Chiron公司）、水蛭素（期，BASF AG公司）、抗-TNF-a抗体片段（期，Pharmacia公司）、牛血红蛋白（期，Enzon公司）、抗-PDGF抗体片段（期，Celltech公司）。,TNF-a是一种颇有价值的肿瘤治疗药物,它具有协同的抗肿瘤效能:一方面直接表现为对肿瘤细胞的细胞毒作用;另一方面可激活宿主的抗肿瘤应答并选择性地引起肿瘤组织内部的微循环障碍。但是,TNF-a在体内的清除速率很快,要产生明显的抗肿瘤
7、效果需要非常大的使用剂量,由此常引发一系列严重的毒副作用,包括发热、组织炎症和组织损伤,甚至是致命的内毒素性休克样综合征。要将其转化为一种有效的抗肿瘤药物必须有效地降低毒副作用,PEG修饰正是为达到这一目的。研究表明,利用mPEG 5000对TNF-a进行化学修饰,通过对修饰条件的优化处理,不仅能够有效减少毒副作用,还可提高其抗肿瘤活性。当赖氨酸残基被修饰的程度分别为29%和56%时,其抗肿瘤活性分别增加了4倍和100倍。与天然TNF-a相比,修饰产物的分子量明显增大,延长了药物的有效作用时间,降低了毒副作用,促进了它作为抗肿瘤药物的应用。,PEG修饰蛋白及其应用,展 望,目前，存在的问题是修饰剂反应性及选择性比较低，修饰以后的蛋白质均一性差，活性低。发展方向：研制新型高效的化学修饰剂；建立分析修饰蛋白质的简便、准确、灵敏和快速的方法；对修饰过程的机理获得更清晰的认识。,
