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1、烟台大学本科毕业论文有机磷阻燃剂与DNA相互作用的光谱法研究年 级: 2010级学 号: 201060506222姓 名: 专 业: 海洋渔业科学与技术指导老师: 二零一四年六月摘 要脱氧核糖核酸(DNA) 包含所有必需的遗传信息，是控制细胞结构和功能的主要物质。它的两条互补链通过 Watson-Crick 碱基对相连接构成双螺旋分子，其在生命过程中起着非常重要的作用。DNA 是许多有机污染物的主要作用靶，其结构在很多条件下可以被破坏，尤其是和小分子相互作用，所以 DNA 可以用于许多类型疾病的治疗。小分子与 DNA 相互作用的研究已成为生物化学和生命科学中热门的研究课题之一。本论文应用荧光、
2、紫外-可见等光谱技术对有机磷阻燃剂与生物大分子的相互作用进行了研究。选用BDE-47（2，2，4，4 -四溴联苯醚）这种有机磷阻燃剂的主要成分来研究其与DNA的作用方式。从而揭示环境污染物对DNA的影响，呼吁人们减少有机污染物的使用，营造良好的生态环境。关键词：有机磷阻燃剂；小分子；DNA；紫外吸收光谱；荧光光谱Abstract Deoxyribonucleic acid (DNA) contains all the genetic information required, is the main material control of cell structure and function
3、. Two complementary strands of double helix molecule on which it is connected via the Watson-Crick base, which plays an important role in the life process. DNA is the main role of many organic pollutants of the target, the structure can be destroyed under many conditions, especially the interactions
4、 between small molecules, so DNA can be used to treat many types of diseases. Study on the interaction of small molecules with DNA biological chemistry and life science has become one of the hottest research topics in. The interaction of visible spectroscopy using the fluorescence, UV - on organic p
5、hosphorus flame retardant and biomacromolecule was studied. Using BDE-47 (2, 2 , 4, 4 - four polybrominated diphenyl ether) the main component of the organic phosphorus flame retardants to study its interaction with DNA method. To reveal the effects of environmental pollutants on DNA,cal;led on peop
6、le to reduce the use of organic pollutants, and create a good ecological environment.Keywords: organic phosphorus flame retardant;small molecule;DNA; ultraviolet absorption spectrum; fluorescence spectrum目 录摘 要IVABSTRACTV第1章 绪 论11.1 本论文的背景和意义11.2 本论文的主要方法和研究进展11.3 本论文的主要内容11.4 本论文的结构安排1第2章 各章题序及标题小2
7、号黑体22.1 各节点一级题序及标题小3号黑体22.1.1 各节的二级题序及标题4号黑体22.2 页眉、页脚说明22.3 段落、字体说明22.4 公式、插图和插表说明2结 论5致 谢6参考文献7附 录 1 标题8附 录 2 标题9绪论1.1 引言随着经济社会的发展和人们生活水平的提高，物质生产水平的需求越来越大，阻燃科学技术应运而生，阻燃科学技术是为了适应社会安全生产和生活的需要，预防火灾发生，保护人民生命财产而发展起来的一门科学。阻燃剂是阻燃技术在实际生活中的应用，它是一种用于改善可燃易燃材料燃烧性能的特殊的化工助剂，广泛应用于各类装修材料的阻燃加工中。经过阻燃剂加工后的材料，在受到外界火源
8、攻击时，能够有效地阻止、延缓或终止火焰的传播，从而达到阻燃的作用。主要适用于有阻燃需求的塑料，延迟或防止塑料尤其是高分子类塑料的燃烧。使其点燃时间增长，点燃自熄，难以点燃。阻燃剂是塑料产品中最重要的添加剂。巨大的市场需求有望进一步扩大，预计在今后几年中，年消耗的增幅将超过3。有机磷阻燃剂占阻燃剂总消耗量的14和总价值的23。这类产品增幅大，且不成比例，这既是因为防火保护提出相关要求，也是因为这类产品具有出色的化学和物理性能。阻燃剂种类繁多，数量巨大，随着其在生产生活中的广泛应用而大量存在甚至暴漏于环境之中，严重污染了我们的生态环境，阻燃剂的分解速度慢，分解时间长，造成了巨大的环境压力。它们可以
9、在环境介质中存留数十年甚至更长时间,通过土壤、大气、水体等环境介质,借助多种途径进入人体并持续蓄积,严重危害人类健康、环境以及生态系统安全。有机磷阻燃剂由于其出色的化学和物理性能而应用最为广泛，俨然已成为环境污染物的重要组成部分。实验表明有机磷阻燃剂对人类和动物具有致癌、致畸、致突变性及遗传毒性的物质，因此,对有机污染物分子致病机理的探讨自然引起了广泛的重视,在化学、环境及生命科学的基础性研究中具有重要意义。1核酸(DNA)的识别与损伤在基因转录、细胞信息传递、疾病的产生等生命过程中起着非常重要的作用，如何采取有效的方法针对环境中有机磷阻燃剂与特定基因DNA的作用机制进行探索和预测,己成为生命
10、化学领域中急需解决的问题,对于理解生命运动的化学本质和疾病的发生发展、外源性物质的风险评估、促进基因靶标的发现具有重要科学价值和现实意义。因此,我们希望通过深入理解环境中有机磷阻燃剂的作用机制,结合化学、环境和生命科学等多学科进行合作研究,揭示传统生物学所难以发现的新规律,造福于人类的健康事业,促进我国经济可持续发展。目前对环境中有机磷阻燃剂与DNA的基因研究大都尚未从分子水平上研究环境有机磷阻燃剂对DNA的损伤机制。研究表明,在体外能与DNA发生作用的分子大多进入人体细胞后会对人体基因产生一定的影响，本文通过现代分析手段在分子水平上研究有机磷阻燃剂小分子与靶标DNA之间的相互作用,希望从分子
11、水平上认识环境污染物的致毒机理,并对评估其危害提供理论依据。1.2 有机磷阻燃剂的特点阻燃剂是能够提高可燃物的难燃性或自熄性的一种助剂，在各类阻燃剂中，磷系阻燃剂特别是有机磷系阻燃剂占有重要地位。本世纪就开始了对有机磷阻燃剂的研究，随着合成方法的不断改善，合成的品种也不断增加。如40年代末期由美国Eastman合成的三乙基磷酸酯（EtO)3P(O),用于聚酯树脂的阻燃；60年代广泛使用的THPCP+(CH2OH)4Cl- ，用于工人服装、军队制服和医用物品中。同期瑞士Ci-ba-Geigy公司开发并生产了N-羟甲基二甲氧基粼酰基丙酰胺，简称CP，主要用于纤维素的阻燃。70年代以后，开发的品种不
12、断增加，给有机磷化合物的应用开阔了广阔的前景。2有机磷系阻燃剂是一种阻燃性能较好的阻燃剂，它具有阻燃增塑双重功能，并可代替卤化系阻燃剂，具有一定的发展前景。近年来，研究人员针对阻燃剂的缺点研究开发的膨胀型阻燃剂，其活性成分之一为磷。含膨胀型阻燃剂的高聚物热裂或燃烧时，表面形成一层膨胀炭层，具有阻燃（炭的极限氧指数达60）、隔热、隔氧功能，且生烟量少，也不易形成有毒气体和腐蚀性气体，有效地克服了有机磷系阻燃剂的缺点。1.3 有机磷阻燃剂的种类有机磷阻燃剂品种繁多，用途广泛，性能可调。磷酸酯类是主要的磷系阻燃剂，添加型为主。分为含卤与无卤两大类，合成简单，与材料相容性好，兼有阻燃与增塑两种作用。主
13、要包括膦酸酯、氧化膦、亚磷酸酯、鏻盐系列、次膦酸盐。3膦酸酯具有类似磷酸酯的性质，热稳定性很高，具有耐水耐溶剂性，阻燃性能持久。环状膦酸酯性能更优，主要用于聚酯纤维、聚氨酯泡沫塑料和热固性树脂的阻燃。化氧膦是一类很稳定的有机磷化合物，可阻燃聚酯、聚碳酸酯、环氧树脂和聚氨酯、聚苯醚等。由于含磷量高，所以添加量小。主要品种有正丁基双（羟丙基）氧化膦（FRD）、三羟丙基氧化膦（FR-T）、环辛基羟丙基氧化膦（CODPPO）、对二（2，2-氰乙基氧化膦甲基）四甲基苯（RF2699）。亚磷酸酯品种远不如磷酸酯多，主要用于抗氧化、稳定剂、防老剂，用于阻燃剂的较少。应用实验结果表明，它是一种热稳定性很高、阻
14、燃效果好，同时具有增塑剂和抗氧剂特性的新型阻燃剂。鏻盐系列是具有R4PX结构的含磷有机化合物，其代表性品种是四羟甲基鏻硫酸盐（THPS，以磷化氢的循环利用）。THPS属于反应性阻燃剂，能保持纤维的原有强度和柔软性，可用于军用棉布、防雨布和工作服的阻燃处理。次膦酸盐是近年开发的新磷系阻燃剂，可用于热塑性塑料（如PA、PBT）、纤维及纺织品的阻燃，特别适用于薄壁电子元器件、透明制片及薄膜。1.4 双螺旋DNA的生物功能 所有活的有机体，无论作为物种或个体来说，都是千差万别的。有机体含有不同种类和数目的蛋白质和酶，因而具有不同的形态和代谢类型，然而主宰着蛋白质和酶结构的却是另一类生物大分子核酸。核酸
15、在生物的生长、发育和繁殖等生命活动中起着非常重要的作用，同时，它与生命的异常现象，如肿瘤的生长和遗传性疾病等也有密切关系。因此，核酸是现代生物学、化学和医学的重要研究领域之一。4DNA即脱氧核糖核酸，是生物体中重要的一类生物大分子,对于生命遗传密码的翻译、转录、复制起着非常重要的作用，DNA是两性电解质,通常表现为酸性DNA的双螺旋结构有多种不同类型,分为A一DNA、B一DNA和Z一DNA。生物体中常见的是右旋B型DNA,它的骨架是由糖和磷酸酯组成，由糖环上所联结的碱基通过氢键配对而使其骨架形成反平行的双螺旋结构四种碱基分别是:腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶C)和胸腺嘧啶(T)在双螺旋的D
16、NA中,腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T),鸟嘌呤(G)和胞嘧（C)是通过Watson一crick氢键形成A一T、G一C碱基对而将其骨架连结在一起。另一方面,碱基平面可以通过-堆积的形式稳定双螺旋的结构,在DNA的双螺旋中形成一个宽而浅的大沟区和一个窄而深的小沟。DNA为白色纤维固体,微溶于水,其溶液粘度极高。双螺旋结构DNA在紫外吸收光谱中在26Onm左右处有最大吸收峰,并且在A260nm处和A280nm的吸光度比值大于1.8。由此来判断DNA的双螺旋结构是否形成完全。双螺旋DNA在一定的条件下,如升高DNA溶液的温度(热变性),改变其酸碱度(酸碱变性),或有尿素、甲醛、甲酞胺等变性剂存在时能破坏
17、DNA中的氢键,使有规律的螺旋型双链结构变成单链的、无规律的“线团”,此作用称为DNA的变性热变性的单链DNAssDNA)紫外吸收值急剧增加,粘度下降,生物活性丧失,可利用这些性质来判断DNA是否变性。未变性的双链DNA(dsDNA)的加热变性一般在较窄的温度范围内发生,很像固体结晶物质在其熔点突然熔化的情况,故通常把热变性温度称为“熔点”或解链温度。DNA水溶液加热变性时,双螺旋的两条链分开，如果缓慢冷却，则两条链可能发生特异的重组而恢复成双螺旋结构。 5在DNA的双螺旋中存在一个宽而浅的大沟区和一个窄而深的小沟区,外源性的生物活性分子可通过与双螺旋DNA结合来干预相关基因的表达,目前已成为
18、探讨疾病发生发展以及治疗人类疾病的新策略1.5 荧光及紫外-可见光谱法研究 本世纪60年代就发现了核苷酸、多聚核苷酸及核酸的紫外吸收。所有聚合态的核酸都在260 nm处有一个宽的最大吸收带，230 nm处的吸收最小，在200 nm以下的短波长区有另一最大吸收。吸光度比A260/A280和A260/A230是核酸质量的重要标准。比较纯的核酸A260/A280比值应该大于1.8；如果此值较小则表示有蛋白质杂质的存在，因为蛋白质通常对280 nm处的吸收有很大的贡献。而比值A260/A230应该为2或更高，此值低表示有蛋白质(肽键在次范围内有吸收)或其它杂质。如果核苷酸的平均分子量为330(A、T、
19、G和C核苷酸的平均值)，则天然双螺旋DNA的摩尔吸光系数()经计算为6600。事实上，该值因A-T、G-C碱基含量不同而在6300-7000之间变化。天然DNA在加热、碱性等条件下，两条脱氧多核苷酸链间的氢键会断裂，形成两条单链结构，这种现象称为DNA变性(denaturation)。DNA的吸收光谱具有增色效应(hyperchromicity)，即当DNA发生从双链向单链转化时其吸光度会增加。单链长度的缩短会引起进一步的增色，因为在单链DNA中仍存在部分碱基的重叠作用。对某一DNA来说，其紫外吸收程度(A260)是双链DNA 1.8，由此证明单链DNA已形成双螺旋结构。(2)不同浓度BDE-
20、47配置 将BDE-47按一定比例溶于磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L, pH = 7.4）中，配置成指定浓度（0、2、4、8、12、16、20 10-6 mol/L）的溶液。(3)紫外吸收光谱测量 将DNA稀释至2 10-6 mol/L，等体积混合DNA溶液与BDE-47溶液，测量DNA的紫外吸收光谱的变化，参比溶液为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH = 7.4），扫描范围为190 350 nm。(4) 荧光光谱测量 将DNA与溴化乙锭（EB）溶液混合，得到2 10-6 mol/L DNA与2 10-5 mol/L EB的EB-DNA体系，等体积混合EB-DNA溶液与BDE-47溶液，
21、测定荧光变化情况。激发波长为480 nm，发射光谱扫描范围为500 800 nm。 2.1.3 结果与讨论2.1.3.1 实验结果2.1.3.2 讨论表2-1 形状变化特征值及相应比例形状模型变化： 特征值编号特征值比例1比例210.01064259.62%59.62%20.00230512.91%72.53%30.0013477.55%80.08%40.0006833.83%83.91%50.0006453.62%87.52%60.0003922.20%70.0003241.82%91.54%80.0002381.34%92.87%续表特征值编号特征值比例1比例29-100.0002051.15%95.30%
