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1、硕士学位论文酸性蛋白酶高产菌株选育及应用研究一、 概述本项目2004年获得河南省科技攻关项目的立项支持，项目编号：0424240040。酶是生物细胞原生质合成且具有高度催化活性的蛋白质。人类早在认识酶之前就知道利用酶为生产和生活服务，例如酿造、鞣革及制造奶酪等已经有几千年的历史。1897年Bchner发现磨碎的酵母仍然能够使糖液发酵产生酒精和二氧化碳。二十世纪初，有更多的酶被发现和分离提纯，注意到了某些酶的作用需要有低分子物质（辅酶）的参加，并陆续认识了很多酶所催化的反应。1926年Sumner第一次从刀豆中分离出脲酶并获得了该蛋白质的结晶。30年代，J.Northrop又连续分离出结晶的胃蛋
2、白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。今天已有500种酶得到结晶，2000多种酶得到鉴定，200种左右商品酶已经开发，但工业上应用的酶仅有50多种。二次世界大战后抗生素工业的通风搅拌发酵技术的利用，使微生物酶制剂工业得到迅速发展。20世纪40年代末，生产-淀粉酶的液体深层发酵首先在日本实现了工业化生产，标志着现代酶制剂工业的开始。20世纪50年代后期遗传工程、蛋白质工程等现代生物技术的研究成果，促使世界酶制剂工业持续地高速发展，成为生物工程四大主导产业中最早产业化的高技术产业。由于酶制剂是一种绿色高效生物催化剂，具有高效、节能、安全和环保等特点，对酶制剂应用产业开发新产品、提高质量、节能降耗、保护环境
3、重要意义；因此，这一产业的发展受到各国政府的高度重视，有着广阔的发展前景。国际酶制剂市场目前保持着9的增长速度，2010年世界酶制剂年销售额达160亿美元，目前已有一大批可用于工业发酵生产的各种胞外酶的微生物，如芽孢杆菌、大肠杆菌、放线菌、毛霉、黑曲霉、青霉、酵母等。商品化的酶品种数量主要有糖化酶、-淀粉酶、-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、凝乳酶、脂肪酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、a-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、延胡索酸酶、青霉素酰化酶、溶菌酶、链激酶、漆酶、植酸酶、复合酶等等。应用范围覆盖洗涤剂、纺织、酒精、白酒、啤酒、味精、
4、有机酸、淀粉糖、制药、制革、饲料、造纸、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等诸多领域，创造工业附加值数千亿多元。我国自1965年建立起第一个专业酶制剂工厂，由于不断引进技术、资金和设备，酶制剂工业得到迅猛发展，产量由1965年的10吨增长到2010年的219万吨，平均每年以20以上的速度增长，产值达6亿多元，应用范围愈来愈广泛。我国酶制剂工业与发达国家相比，存在的差距主要有：（1）技术研究与开发滞后，基础理论研究与技术开发研究严重脱节，科研资金力度不够且分散，科研技术转化能力不强。（2）行业规模小而分散，市场调控能力弱，我国现有100多家酶制剂生产企业，企业数量占世界三分之一还多，但销售额仅占世
5、界酶制剂销售额5，企业规模小、产品的市场覆盖率低，导致企业对市场的调控能力普遍较弱，企业间无序的价格竞争使整个行业经济效益下滑，使企业在技术创新、新品种开发、设备更新等方面力量不足，严重制约了酶制剂产业的可持续发展。（3）产品结构不合理，技术落后。我国酶制剂产品主要是以糖化酶、淀粉酶、蛋白酶为主，三者加起来占据全国酶制剂产量的97，全国一半以上企业生产品种单一，抗市场风险非常弱。（4）酶制剂的应用开发力度不够，制约了酶制剂企业的市场开拓能力。酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为3000040000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶
6、、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。国外关于酸性蛋白酶的研究和生产从20世纪初就开始了。乞今为止，已发现不少微生物可以产生酸性蛋白酶，如黑曲霉（Aspergillus niger）、大孢子黑曲霉突变株（A. niger var. macrosporus）、斋藤曲霉（A. saitoi）、宇佐美
7、曲霉（A. usamii）、泡盛酒曲霉（A. awamori）、微紫青霉（Pen. janthinellum）、常规青霉（Pen. frequentens）、杜邦青霉（Pen. dupoti）、宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti）、小孢米曲霉突变株（A. oryzacvar. microsporus）、根霉（Rhizopus sp.）、微小毛霉（M. pusillus）、粘红酵母（Rhdotorula glutinis）、粟疫霉（Endothia parasitica）、血红色陀螺孔菌（Trametes sanguinca）、芽枝霉（Cladosporium sp.）等。19
8、03年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的柔制。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外开始对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年国外科学家发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌产酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉发酵物中筛选出一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年国外科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出一种酸性蛋白酶菌株，并对该
9、酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前为止，国外科学家对酸性蛋白酶的结构和功能等已经进行了广泛系统的研究。微生物产酸性蛋白酶我国从上世纪60年代就开始研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。近年来国内在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种。目前用于酸性蛋白酶生产的菌种主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它们突变株。钱玉英等（19
10、94年）用60Co射线诱变处理黑曲霉CPu菌株，获得突变菌株6042，产酶活力比出发菌株提高近4倍。章剑林等（1995年）以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性白酶的菌株S3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为2.5，最适温度为50，90下恒温4h的酶活比出发菌株高64.2%。黄遵锡等(1999年)以黑曲霉YM3019为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株A-1-1，产酶活力约是原始出发菌株的4倍。李永泉等（1999年），对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究。戚淑威等（2006年）对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢
11、必峰等（2007）采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。王云（2008年）通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究。 国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌种生产。早期生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析、板框压滤、气流（沸腾）干燥、粉碎、化验、包装制成工业级酸性蛋白酶。随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用，近几年生产了食品级酸性蛋白酶制剂。食品酸性蛋白酶发酵与工业级相同，只是后提取不同，成熟发酵醪进
12、入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，加入防腐剂、稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂。二、酸性蛋白酶制剂的作用机理和酶学特性1、酸性蛋白酶的作用机理酸性蛋白酶是一种天冬氨基蛋白酶，分子质量为3040KD, 在其活性中心有两个天冬氨基残基，其代表性特征是能够在酸性或中性环境条件下水解动植物蛋白质，将两个疏水氨基酸打断，通过内切和外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸。微生物酸性蛋白酶对肽键两端的苯环和大的氨基酸基团有较高的专一性，酸性蛋白酶的催化机理是酸碱催化作用，由活性位点的两个天冬氨酸在酸性或碱性条件下交替发挥作用，其中一个天冬氨酸失去质子，另一个天
13、冬氨酸则被质子化。由于饲用酶进行催化反应在畜禽消化道内进行，故其作用条件必须与动物消化道生理条件相适应，而通常猪和家禽消化道内温度为40 左右，而胃pH1.53.5，小肠pH57，与酸性蛋白酶作用的一些基本参数相吻合。畜禽尤其是幼龄动物的消化道内蛋白酶分泌体系发育不健全而在生长的中后期，自身虽有内源酶，但尚显不足，当采用高蛋白饲料饲养时，因其对饲料蛋白质消化能力较差而易引起腹泻等疾病。尤其是断奶仔猪，消化道发育不成熟，消化酶分泌系统不健全，特别是胃酸分泌不足，免疫功能低下，加上断奶时的生理、营养和环境应激反应，对饲料的营养成分不易消化和吸收，对病原微生物的抵抗力较弱，易造成正常肠道菌群平衡紊乱
14、，经常出现较高的腹泻率，导致早期生长受阻。若在饲料中添加酸性蛋白酶，则能补充内源酶的不足，使高分子的蛋白质降解为低分子的肽、胨及各种氨基酸，而易被畜禽消化吸收，从而降低饲料对断奶仔猪消化道的刺激，降低应激反应，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进生长。 2、酸性蛋白酶的酶学特性酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的化合物，不同微生物菌种分泌的酸性蛋白酶虽具有一些共同的性质，但在底物pH值、特异性、抑制剂、激活剂等方面均存在着一定的差异。(1)pH对酶活及酶稳定性的影响酸性蛋白酶在pH2.06.0之间较为稳定，但不同的微生物所产酶的最适作用有所不同。曲霉属酸性蛋白酶最适作用pH值为2540，稳定pH值
15、为1.56.0。斋藤曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2030，稳定pH值为1.56.0。米曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为3040，稳定pH值为3.06.0。宇佐美曲霉所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2.5，稳定pH值为2.03.5。青霉属所产酸性蛋白酶最适作用pH值为2030，稳定pH值为1.56.5。酸性蛋白酶对pH值的要求，与酶活性中心的羧基有关。 （2）温度对酶活性及稳定性影响 酸性蛋白酶一般在50以下较为稳定，但也随产酶微生物的不同而有所差异。如根霉属所产酸性蛋白酶在30下只能保持30分钟，而曲霉属的斋藤曲霉所产酸性蛋白酶在50稳定，55处理10分钟才会失活。黑曲霉Vs、V315
16、菌株所产酸性蛋白酶在80保温2小时 后仍有90%的酶活力存在。青酶属产的门冬氨酸蛋白酶，最适pH值条件下，50时达到最大酶活。酵母菌所产酸性蛋白酶经60处理后还剩少许酶活力，经70处理后酶活完全丧失。（3）金属离子对酶活力的影响Ag 对酸性蛋白酶有轻度抑制作用，当其浓度为5mol/L时，酶活下降15% ;Cu2、Mn2对其有激活作用，当Cu2的浓度为0.02mol/L时，对酶有明显的激活作用；Cu2、Mn2 和Al3同时添加时，对酶有协同作用，使酶活提高1倍；Ca2本身并不抑制酸性蛋白酶的活性，但它可作为其它物质的辅助因子而对某些酸性蛋白酶产生抑制作用。液体酸性蛋白酶，长时间存放碳钢罐中失活较
17、多。（4）抑制剂对酶活力的影响通常酸性蛋白酶的活性中心肽段是基本相似的，抑制剂主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸钠。霉菌来源的酸性蛋白酶通常并不受胃蛋白酶抑制剂对-溴苯的抑制，但却对N-溴代琥珀酰亚胺和高锰酸钾敏感。此外，并非每种酸性蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制剂(S-PI) 抑制,这可能与酶的活性部位含酪氨酸以及色氨酸有关。三、酸性蛋白酶高产菌株（Aspergillus nigerY06）的选育研究1、材料和方法1.1实验材料1.1.1 出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger）中国工业微生物菌种保藏中心提供，CICC编号：3.43091. 1. 2培养基1. 1.
18、 2. 1分离及斜面培养基斜面培养基为PDA培养基和察氏培养基, 分离培养基是在察氏培养基中加入1%的酪蛋白。PDA培养基：取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂（煮沸2030分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，加葡萄糖 20克，琼脂 15-20克，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，自然PH，分装试管，加塞、包扎，（121）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。察氏培养基：硝酸钠3g 、磷酸氢二钾1g 、硫酸镁(MgSO47H2O) 0.5g 、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g 、蒸馏水1000mL ，加热溶解，自然PH，分
19、装后121灭菌20min。 。1. 1. 2. 2固体发酵基础培养基麸皮：豆粕：玉米淀粉100:9:2，每1 kg 培养基中添加硫酸铵 1.5%, 水750 ml, 调pH6.5。1. 1. 2. 3液体发酵培养基豆饼粉3.65% , 玉米粉0.625% , 鱼粉0.625%, 硫酸铵1.0% , CaCl2 0.5% , Na2HPO4 0.2%, 豆饼水解液6%, pH5.5。2、实验方法2. 1菌种的分离和纯化采用常规稀释分离法。2. 2菌株的诱变处理2. 2. 1紫外线诱变处理用接种环取新鲜PDA斜面上的黑曲霉孢子少许, 加入无菌水中进行稀释,用血球计数板进行计数, 使每毫升溶液中孢子
20、量约为5000 个, 取0.1 ml涂布初筛平板, 30培养4 h, 让孢子萌发, 紫外灯预热30min后，将平皿放置距离紫外灯30cm处分别照射4 min、6 min、8min、1 0min、12min，随后用5mL无菌生理盐水将平皿上的菌洗脱，适当稀释后，涂布于分离平皿，以黑布包裹30培养3-4天，从长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种。 2. 2. 2 亚硝基胍诱变处理用接种环取新鲜PDA 斜面上的黑曲霉孢子少许, 加入无菌水中进行稀释, 用血球计数板进行计数, 使每毫升溶液中孢子量约为5 000个, 取3ml孢子悬液, 加入等体积的亚硝基胍溶液, 充分混合, 于
21、31振荡处理1h, 取出稀释涂平板, 31培养5d, 挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验。2. 3固体培养方法挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50g培养基的500 ml三角瓶中, 培养温度为31, 培养时间5d, 测定酶活。2. 4液体培养方法挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50ml 液体培养基的500ml三角瓶中, 培养温度为31, 培养时间3d, 测定酶活。2. 5固体培养方法挑取一环生长在PDA 斜面上的新鲜孢子接入装有50g培养基的500ml三角瓶中, 培养温度为31, 培养时间5d, 测定酶活。2. 6液体培养方法挑取一环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有5
22、0ml液体培养基的500ml三角瓶中,培养温度为31,培养时间3d,测定酶活。2. 7 酶活测定方法酸性蛋白酶酶活力的测定采用河南省瑞特利生物技术有限公司产品企业标准（QHRS 018-2011）相关方法。3、菌株选育结果3.1 紫外线诱变为了提高菌体的发酵水平或改良生产菌，过去经典的理化诱变育种技术仍然广泛的被采用，本实验采用紫外诱变的方法照射原菌，稀释分离后涂布在分离平皿。紫外照射孢子成活率结果如表1所示。表1 紫外照射孢子成活结果照射时间（min）04681012活菌数（个ml）5000325021001350500100成活率（%）100654227102为了筛选在固体培养条件下产酶高
23、的菌株, 经紫外线诱变处理后, 得到10O余株突变株。这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出20株先经三角瓶液体发酵产酶测定,获得10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选，菌株产酸性蛋白酶活力如表2所示。其中5株产酶较高, 分别为z-10株9284 U / g （干基）、z-09 株8887 U / g （干基）、z-12 株8645 U/ g （干基）、z-17 株8199U / g （干基）、z-08株8018 U / g （干基）。表2 菌株产酸性蛋白酶活力菌株编号z-03z-05z-08z-09z-10z-12z-1
24、5z-17z-18z-20酶活力（umg）7985772580208775923587647503814771337980酶活力（umg）7996774680158998933285237589825072568005平均值（umg）79917736801888879284864575468199719579933.2 亚硝基胍诱变选择经紫外线诱变产酶最高的z-10菌株用亚硝基胍进行进一步诱变处理, 由酪蛋白平板初筛得到菌株36 株, 经摇瓶复筛得到菌株10株, 此10株再经三角瓶固体发酵复筛。酶活超过2.5万U/g （干基）的菌株有4株, 基中二株产酶最高, 分别为Y06株36134 U/
25、g （干基）、Y05株34324U/g（干基）。选择酶活最高的菌株Y06株进行酸性蛋白酶生产性试验。亚硝基胍诱变的结果如表3所示。表3 亚硝基胍诱变的菌株产酶情况菌株编号Y02Y05Y06Y08酶活力（umg）26832341003594031080酶活力（umg）26893345483632831056平均值（umg）26863343243613431068四、影响酸性蛋白酶菌株（Aspergillus nigerY06）产酶因子的研究1 材料与方法1.1 材料菌种，黑曲霉Y06，本项目选育保藏于河南省瑞特利生物技术有限公司。12 培养基和培养方法(1)基础培养基、查氏培养基。(2)培养方法
26、按要求配制发酵基质，调节初始含水量和pH后，取150 g分装于1 000 mL三角瓶中，在01 Mpa压力条件下灭菌30 min后，冷却接种，接种量为3%，于不同条件下发酵84h，干燥后，进行酶活的测定。2、固体培养基组分对酸性蛋白酶菌株产酶的影响(1)不同比例碳源对酸性蛋白酶菌株产酶的影响按不同比例将玉米粉添加到基础培养基（麸皮：豆粕：玉米淀粉100:9:2）中，以补充碳源，于3O、初始pH值为65和含水量为38%条件下发酵，观察补充玉米粉对酸性蛋白酶活性的影响，结果见图1。由图1可以得出，酸性蛋白酶菌株产酶最大时玉米粉添加量为2.0 ，此后随着玉米淀粉添加量的增加，基质易结团而影响氧的传递
27、，酸性蛋白酶急剧下降。(2)不同比例氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的影响为了使菌株生长更好，并对菌株产酶进行诱导，在培养基中添加豆粕粉作为补充氮源，于33 、初始pH值为65和含水量为38%条件下发酵，考察其对酶活产生的影响，结果见图2。从图2可以看出，在培养基中添加不同比例的豆粕粉，对酶活的产生都有促进作用，随着豆粕粉含量的增加，产品的酶活力有上升的趋势，在9时酶活力达最高值。(3)水分含量对酸性蛋白酶菌株产酶的影响对于固态发酵来说，控制培养基的水分是固态发酵过程中的重要环节之一。适宜的含水量，使得培养基有合适的疏松度，颗粒间存在一定空隙，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖
28、。过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，则使基质膨胀程度降低，水的活度低，从而抑制菌体生长。含水量过高过低都对黑曲霉生长繁殖及孢子的形成不利，从而影响酸性蛋白酶活性。本研究将黑曲霉分别接种到初始pH 值为65，含水量分别为3O、34、38、42、46和5O的固态发酵培养基上，在33下进行发酵培养试验，结果如图4。结果表明含水量38%时酸性蛋白酶菌株产酶达最高值。(4)pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响为了研究发酵培养基的pH值对酸性蛋白酶菌株产酶活性的影响，根据固体培养基难以调节pH 特点，我们利用缓冲溶液对培养基用水的pH值进行调整。实验在培养基初始含水量为3
29、8%，温度为33条件下发酵84 h，观察发酵培养基pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，黑曲霉固态发酵最适pH值为6.5。结果见图4。(5)温度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响温度是固态发酵一个重要的可调节参数，它是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移出，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行为寻求合适的发酵温度，本项研究以酸性蛋白酶发酵培养基含水量为38% 、pH值为65的条件下培养84h，对27 、30 、33 、37和40不同温度分别进行发酵培养，测定酶活力，证明酸性蛋白酶菌株产酶发酵最适温度为33，结果见图5。（6）不同铵
30、盐不同浓度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响铵盐作为重要的无机氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的生产有很重要的作用，生产中常常加入一些铵盐来促进黑曲霉菌的产酶，本研究分别加入不同浓度的氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵进行发酵试验，发酵结果如图6。由图6可以看出少量的硫酸铵对产酶有促进作用，但随着浓度的增加产酶量有下降的趋势。氯化铵的浓度对产酶基本没影响。碳酸氢铵随着浓度的增加对产酶有很大的阻遏作用。（7）不同磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响磷酸盐在酸性蛋白酶的生产很重要。在使用麸皮，米糠等有机磷含量丰富的原料时，添加一定的磷酸盐时会出现明显的促进效果。本研究对磷酸氢二铵、磷酸氢二钾进行实验。，通过改变无机磷的种类和含
31、量，于33 、初始pH值为6.5和含水量为38条件下发酵，研究不同浓度磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，结果见图7。添加磷酸盐有利于促进酸性蛋白酶菌株的产酶，且添加02% 的磷酸氢二钾对酸性蛋白酶菌株的产酶促进最大。3、酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线固体发酵采用基础培养基（麸皮：豆粕：玉米淀粉100:9:2）、含水量38%、初始pH值为6.5、添加02%的磷酸氢二钾和硫酸铵在33进行发酵培养，研究发酵进程曲线，结果如图8。由酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线可以看出，024 h发酵产酶速度较缓；2460 h酸性蛋白酶产酶迅速增加，发酵时间达到72h后，进程曲线趋于平缓，84 h酶活力最高，其酸性蛋白酶活力
32、（干基）达到36500 Ug，为了缩短发酵周期，发酵最适时间为72h。五、酸性蛋白酶酶活力稳定性研究黑曲霉产的酸性蛋白酶因其最佳反应pH 较低, 与畜禽体内消化系统基本一致, 用于饲料添加剂添加饲料中, 可以有效的弥补畜禽肠道内源蛋白酶分泌不足, 提高蛋白质消化率, 降低畜禽代谢性腹泻的发生。近年来, 随着饲料工业的快速发展, 酸性蛋白酶作为一种生物饲料添加剂表现出的潜能越来越被人们所关注。但酸性蛋白酶作为饲料添加剂, 它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、动物胃肠道胃酸的影响, 而且还受饲料中部分金属离子的影响,而这些过程中酶活极易受损, 从而影响其作为饲料添加剂的效果。本项研究对黑曲霉菌株
33、（Aspergillus niger ）所产酸性蛋白酶的稳定性进行了研究。1、pH值对酸性蛋白酶稳定性的影响酸性蛋白酶在一定pH 范围内酶活力比较稳定（如图9）。当反应环境pH为3.5, 酸性蛋白酶相对酶活力可以达到85%, 在pH为4.0 时, 相对酶活力最高达90%, 可以确定pH为4.0时是酸性蛋白酶最适反应pH值。pH值过高或过低明显影响酶活力,在pH 为5.0时, 相对酶活力只有65%, 在pH为2.5时, 相对酶活力也只有70%。2、温度对酸性蛋白酶酶活力和稳定性的影响酸性蛋白酶在不同反应温度下酶活力有很大差异（如图10）。一方面是当温度升高时, 酸性蛋白酶反应速率加快, 另一方面
34、由于随着温度的升高使酸性蛋白酶逐渐变性而失去活性, 引起酶反应速率下降。酸性蛋白酶适宜的反应温度为3540, 在40相对酶活力表现出最高, 在低于30或者高于45时, 相对酶活力明显下降。因此认为40的反应温度是酸性蛋白酶最适宜的温度。酶本身就是一种具有生物活性的蛋白质, 一定温度必然引起蛋白质的变性从而使酶失活,随着温度的升高变性的时间越快, 酶失活也就越迅速。如图11所示，酸性蛋白酶在70时, 随着时间的延长酶活力开始下降。固体酶在烘箱中70保温至5min 保留有90%的相对酶活力,当时间延长至10min时, 剩余酶活有80%，30min时，剩余酶活仍有19.8%，这提示固体酸性蛋白酶有着
35、较好的抗高温性能。3、不同金属离子对酸性蛋白酶稳定性的影响金属离子对酸性蛋白酶活力影响较大，金属离子对酸性蛋白酶的调节作用是相对的, 一种金属离子对其具有激活作用, 而另一种则可能呈现抑制作用。离子浓度对酶活性也有着不同的影响, 往往是低浓度起激活作用, 而高浓度起抑制作用。图12表明, 在5.0 mmol/L 的浓度下, Mn2+和Cu2+对本黑曲霉所产酸性蛋白酶有强烈的激活作用, 分别达到对照酶活力的150%和120%, Fe3+对该酶表现出明显的抑制作用, 处理后的酶活力为对照的58%,而Fe2+、Ag+、Zn2+、Ca2+、K+和Mg2+对酸性蛋白酶有一定的抑制作用。六、酸性蛋白酶生产
36、工艺研究 在酸性蛋白酶的生产过程中，除了选择生产性能优良的酸性蛋白酶高产菌株外，还必须控制好各种工艺的生产条件，并且在发酵生产过程中根据情况对各项工艺条件进行优化，以最大限度地满足菌株生长、繁殖和产酶的需要。黑曲霉（Aspergillus niger ）生产酸性蛋白酶的工艺流程为：原始菌株分离纯化紫外线诱变选育菌株分离纯化亚硝基胍诱变选育菌株分离纯化选育菌株生产工艺优化传代试验选育菌株斜面菌种三角瓶菌种浅盘菌种 主原料混料（水、无机氮、无机盐）蒸料冷却接种发酵稳定化处理干燥粉碎包装检测成品粗酶抽提过滤盐析沉淀干燥粉碎包装检测成品图13 酸性蛋白酶的工艺流程七、酸性蛋白酶的质量指标本项目研究利用
37、黑曲霉（Aspergillus niger ）生产的酸性蛋白酶用于饲料添加剂，由于目前该类饲料添加剂没有国家标准和行业标准，根据中华人民共和国标准化法、饲料和饲料添加剂管理条例和GB 10648饲料标签的要求，制定了酸性蛋白酶河南省瑞特利生物技术有限公司产品企业标准（QHRS 018-2011），其质量指标为：表4 酸性蛋白酶的质量指标项 目指 标感官淡黄色至浅褐色粉末, 无变质、无结块、无异味、无异嗅。成品粒度 全部通过2.00mm分析筛酸性蛋白酶活力 u/g8000水分 %10.0砷（以总As计） mg/kg3.0铅（以Pb计） mg/kg10.0沙门氏菌数不得检出黄曲霉毒素B1 g /k
38、g10大肠菌群数 个/100g3000八、项目产品的创新点1、技术创新采用紫外线和亚硝基胍育种技术，筛选出酸性蛋白酶高产菌株-黑曲霉（Aspergillus niger ），菌株产酶的生产性能得到显著提高。2、工艺创新通过对黑曲霉产酸性蛋白酶生产工艺生产条件的试验研究，确定了酸性蛋白酶发酵生产的技术工艺，并对有关的技术参数进行了优化，制定了产品生产的操作规程，建立了一套国内领先的以黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶的生产技术体系。3.应用创新酸性蛋白酶产品通过多批次的试验研究，在饲料和畜牧养殖行业应用效果显著（详见附件一至附件七）。本产品具有降低饲料成本，防止腹泻，增强机体免疫力，促进畜禽生长，改善畜禽
39、产品品质，促进动物对微量元素的吸收，减少养殖过程氨气排粪，减轻环境污染等功效。本产品的使用效果达到甚至超过国内外同类产品的水平。本项目产品长期生产和应用，无污染物残留，符合绿色饲料添加剂的要求和国家大力发展生态农业和绿色食品的产业化政策，顺应了以非药物添加剂替代抗生素作为畜禽防病、促进生长的发展趋势，具有重大的推广应用价值，经济效益、社会效益、环保效益十分显著。九、产品的应用研究酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸条件下，通过内切和外切作用将动植物蛋白质水解为短肽和氨基酸，广泛用于食品、医药、制革工业、毛皮软化和脱毛处理。近年来，由于酸性蛋白酶具有能快速有效地协助动物分解饲料中的蛋白质，以补
40、充动物体内同源酶的不足，促进动物特别是幼龄动物对多种营养物质的吸收，促进其生长，增强机体抗病能力。随着集约化畜禽生产的发展，加剧了环境污染。其中，氮是污染环境的主要物质，因而提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，降低其排放就显得尤为重要。此外，由于我国蛋白质饲料资源严重缺乏，需要寻求非常规蛋白资源，而动物对非常规蛋白饲料的利用效率很低。因此，酸性蛋白酶被作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出巨大的潜在价值，越来越受到饲料、养殖和动物营养界的高度重视。本项目在研究过程中，对畜禽的等动物养殖过程中使用酸性蛋白酶的作用和效果进行了系统研究，其主要试验结果为：1、酸性蛋白酶对生长肥育猪生长性能
41、的影响研究（附件一）本项目试验结果表明，在生长猪日粮中添加微生态制剂、酸性蛋白酶、微生态制剂与酸性蛋白酶合用分别提高了生长肥育猪日增重6.5、7.5、14.0，日采食量提高4.8、5.3、10，料肉比分别下降1.6、2.2、3.68%，提高经济效益0.82、0.6、1.35。酸性蛋白酶和微生态制剂合用，具有无污染、无毒副作用等特点，能显著提高猪的日采食量、日增重、提高抗病能力、增加经济效益。其组分来源于天然，应用效果显著，具有抗生素所不具有的优点，符合绿色环保饲料的要求。2、酸性蛋白酶对仔猪的影响研究（附件二）酸性蛋白酶具有快速有效地协助动物分解饲料中的蛋白质，补充动物体内同源酶的不足，促进动
42、物特别是幼龄动物对多种营养物质的吸收，促进其生长，增强机体抗病能力。本研究结果表明酸性蛋白酶在促进仔猪生长和提高仔猪饲料利用率以及预防疾病方面具有重要作用。本试验中，开始诱食前，试验组仔猪腹泻率比对照组有高出的趋势，但自7日龄开始，含有酸性蛋白酶的试验组仔猪的腹泻率有低于对照组的趋势。断奶后，酸性蛋白酶增强仔猪抗应激能力的优势更加明显，添加含有酸性蛋白酶的试验组仔猪的抗病能力明显增强，腹泻发生率极显著地低于对照组（P0.01）。研究表明酸性蛋白酶能够改善仔猪肠道环境，减少断奶后饲料对仔猪的应激，促进仔猪的健康，提高其抗病性能，降低仔猪腹泻率。3、酸性蛋白酶对蛋鸡生产性能的影响研究（附件三）本项
43、试验结果表明在蛋鸡饲料中添加0.02%的酸性蛋白酶可极显著提高蛋鸡的日产蛋率和日产蛋总量和料蛋比，该组日产蛋率比对照组高6.83%，组日产蛋重比对照组高6.8%，组日均料蛋比比对照组下降6.45%。结果表明：在日粮中添加0.02%酸性蛋白酶不能使每枚鸡蛋的平均蛋重提高，但可以使组日产蛋量的提高和组日均料蛋比的下降。 试验结果表明，在日粮中添加0.02%的酸性蛋白酶，该组的蛋黄占整个蛋的百分比，比对照组提高了3.27%，提高幅度显著；该组的蛋壳厚度比对照组下降4.65%，且下降幅度显著；该组蛋的哈氏单位比对照组提高了2.24%，但差异不显著。本试验结果表明，在饲料中添加0.02%的酸性蛋白酶，比
44、对照的饲养毛利提高10.98%，显著地提高了商品蛋鸡的饲养效益，增加了养殖户的收入。在饲料中添加0.02%的低聚木糖后，虽然该组蛋鸡的产蛋率显著提高，但每日的采食量并未增加，因此酸性蛋白酶能提高蛋鸡对饲料的消化吸收率。4、酸性蛋白酶与微生态制剂及抗生素对肉鸡肠道菌群和生产性能的影响研究（附件四）本项目研究表明，酸性蛋白酶可有效提高畜禽生产性能。与抗生素对照组比较，在肉鸡日粮中添加酸性蛋白酶均显著提高了肉鸡空肠乳酸菌数量，而且酸性蛋白酶与抗生素及微生态制剂联用均有效的促进了空肠乳酸菌的增殖，以添加0.02%酸性蛋白酶0.005%微生态制剂效果最佳，可以认为酸性蛋白酶和微生态制剂对乳酸菌的增殖有协
45、同作用。5、酸性蛋白酶对犊牛腹泻的影响研究（附件五） 本试验添加10g/(d.头）组在减少腹泻方面的效果不及添加5g/(d.头）组。可能是由于过量添加造成的负面影响，具体原因有待进一步研究。6、酸性蛋白酶和微生态制剂配伍在肉兔饲料中的应用研究（附件六）酸性蛋白酶与微生态制剂混合物进入肠道后可产生一定的协同作用。微生态制剂与酸性蛋白酶的配伍使用既可发挥益生菌的生理性细菌活性，促进肉兔饲料中蛋白质的吸收，又可选择性的增殖有益菌，从而使益生菌作用更持久。 肉兔饲料中同时添加0.02%的酸性蛋白酶和0.2%的微生态制剂，可使肉兔的生长速度、成活率、饲料报酬和经济效益得到较大提高，对肉兔无任何毒副作用，是理想的肉兔绿色饲料添加剂。
