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1、3,吸光光度法的基本原理,特点,灵敏度高：,测定下限可达,10,-5,10,-6,mol,L,-1,10,-4,%,10,-5,%,准确度,能够满足微量组分的测定要求：,相对误差,2,5,（,1,2,）,操作,简便快速,应用广泛,吸光光度法是基于被测物质的分子对光具,有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。,5,光的基本性质,(,电磁波的波粒二象性,),c,真空中光速,2.99792458,10,8,m/s,3.0,10,8,m/s,?,波长，单位：,m,cm,mm,?,m,nm,?,1,?,m=10,-6,m,1nm=10,-9,m,1?=10,-10,m,?,频率，单位：赫芝,(,周,)H
2、z,次,/,秒,n,折射率，真空中为,1,?,?,?,=,=,c,V,n,光的传播速度,:,波动性,6,X,Y,Z,x,电场向量,7,h,普朗克,(,Planck,),常数,6.626,10,-34,J,s,?,频率,E,光量子具有的能量,单位：,J(,焦耳,),，,eV(,电子伏特,),1eV=1.602,10,19,J,微粒性,光量子，具有能量,。,E,h,?,?,?,8,结论,:,一定波长的光具有一定的能量，波长越,长,(,频率越低,),，光量子的能量越低,.,单色光,：具有相同能量,(,相同波长,),的光,.,混合光,：具有不同能量,(,不同波长,),的光复合在,一起,.,例如白光,.
3、,=,=,=,c,V,E,h,h,h,n,?,?,?,波粒二象性,真空中,:,c,E,h,?,?,10,光学光谱区,远紫外,近紫外,可见,近红外,中红外,远红外,（真空紫外）,10nm200nm,200nm,380nm,380nm,780nm,780 nm,2.5,?,m,2.5,?,m,50,?,m,50,?,m,300,?,m,11,物质对光的吸收与发射,1.,电子相对于原子核的运动,-,电子能级,;,单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反,.,三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同,.,2.,原子核在其平衡位置附近的相对振动,-,振动能级,;,3.,分子本身绕其重心的转动,-,转动能
4、级,.,物质分子内部,3,种运动形式及其对应能级：,12,S,2,分子吸光与发光示意图,?,E,e,振,动,能,级,v,3,v,2,v,1,转动,r,3,r,2,r,1,S,1,S,0,紫外,荧光,磷光,T,2,T,1,可见,?,E,v,?,E,r,红外,单重态,三重态,13,光谱种类,原子光谱：吸收、发射、荧光,线状光谱,?,黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光,连续光谱,?,分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱,带状光谱,?,I,14,?,/nm,颜色,互补光,400,450,紫,黄绿,450,480,蓝,黄,480,490,绿蓝,橙,490,500,蓝绿,红,500,560,绿,红紫,560
5、,580,黄绿,紫,580,610,黄,蓝,610,650,橙,绿蓝,650,760,红,分子对光的吸收与吸收光谱,不同颜色的可见光波长及其互补光,蓝绿,16,光吸收基本定律,:,朗伯,-,比尔定律,朗伯定律,:,(1760),A,=lg(,I,0,/,I,t,)=,k,1,b,当入射光的,?,吸光物质的,c,一定时,溶,液的吸光度,A,与液层厚度,b,成正比,.,比尔定律,(1852),A,=lg(,I,0,/,I,t,)=,k,2,c,当入射光的,?,液层厚度,b,一定时,溶液,的吸光度,A,与吸光物质的,c,成正比,.,17,朗伯,-,比尔定律,意义,:,当一束平行单色光通过均匀、透明,
6、的吸光介质时，其吸光度与吸光质点,的浓度和吸收层厚度的乘积成正比,.,A,=lg(,I,0,/,I,t,)=,kbc,18,透光率,(,透射比）,T,（,Transmittance,）,t,0,=,I,T,I,A,=lg(,I,0,/,I,t,)=lg(1/,T,)=,lg,T,=Kbc,吸光度,A,(Absorbance,）,-,-,=,10,=,10,Kbc,A,T,I,0,I,t,入射光,透过光,19,吸光度,A,、透射比,T,与浓度,c,的关系,A,T,(%),c,A,=,kbc,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,-kbc,T,=,10,100,80,60,40,20,20,K,
7、吸光系数,Absorptivity,a,的单位,:L,g,-1,cm,-1,当,c,的单位用,g,L,-1,表示时，用,a,表示，,A,a b c,?,的单位,:L,mol,-1,cm,-1,当,c,的单位用,mol,L,-1,表示时，用,?,表示,.,?,摩尔吸光系数,Molar Absorptivity,A,?,b c,1%,1cm,E,当,c,的单位用,g,100mL,-1,表示时，用,表示,A,bc,，,叫做比吸光系数,.,1%,1cm,E,1%,1cm,E,21,吸光度与光程的关系,A,=,a,b,c,0.10,b,0.20,2b,0.00,光源,检测器,显示器,参,比,22,吸光度
8、与浓度的关系,A,=,ab,c,0.10,c,0.20,2,c,0.00,光源,检测器,显示器,参,比,23,吸光度与波长的关系,A,=,a,bc,0.00,红,0.10,红,0.00,光源,检测器,显示器,参,比,蓝绿光,红光,24,朗伯,-,比尔定律的适用条件,1.,单色光,应选用,?,max,处或肩峰处测定,.,3.,稀溶液,浓度增大，分子之间作用增强,.,2.,吸光质点形式不变,离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件,(,酸度、浓度、介质等,).,25,溶液浓度的测定,A,?,b c,工作曲线法,(,校准曲线,),朗伯,-,比尔定律的分析应用,0 1.0 2.0 3.0 4.0,c
9、,(mg/mL),A,*,0.80,0.60,0.40,0.20,0.00,A,x,c,x,26,吸光度的加和性与吸光度的测量,A,=,A,1,+,A,2,+,+,A,n,用参比溶液调,T,=100%,（,A,=0,），再测样品溶,液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，,溶剂、试剂对光的吸收等,。,0,0,1,2,2,1,=,lg,=,lg,=,-,=,lg,I,I,I,A,A,A,A,A,I,I,I,参,参比,液,比,试,试液,27,分光光度计的主要部件,光源：,发出所需波长范围内的连续光谱，,有足够,的光强度,稳定。,?,/nm,钨灯（,热辐射光源,）,400,600,800,100
10、0,氙灯,（,气体放电光源,）,氢灯,强,度,28,氙灯,氢灯,钨灯,29,单色器：,将光源发出的连续光谱分解为单色光的,装置。,棱镜：,依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,.,玻璃,350,3200nm,石英,185,4000 nm,入射狭缝,准直透镜,棱镜,聚焦透镜,出射狭缝,白光,1,2,800,600,500,400,30,光栅：,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的,等宽度等,间距,条痕,(600,、,1200,、,2400,条,/mm),。,利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。,波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便,.,平面透射光栅,反射光栅（广泛使用）,光栅衍射示意图,M,
11、1,M,2,出,射,狭,缝,光屏,透,镜,平面透,射光栅,31,吸收池,(,比色皿,),：用于盛待测及参比溶液。,可见光区：光学玻璃池,紫外区：石英池,检流计,（指示器）：,低档仪器：刻度显示,中高档仪器：数字显示，自动扫描记录,检测器,：利用光电效应，将光能转换成,电流讯号。,光电池，光电管，光电倍增管,32,硒光电池（,Barrier-layer photocell,）,适用于,300-800 nm,在,500-600 nm,范围最灵敏。,Se,阴极,Au,，,Ag,半导体,h,?,阳极,33,光电管,(,Phototube,),h,?,（片）,红敏管,625-1000 nm,蓝敏管,20
12、0-625 nm,34,光电倍增管,(,Photomultiplier Tube,PMT,),1,个光子可产生,10,6,10,7,个电子,160-700 nm,35,吸光光度法仪器主要差异比较,可见光,（,380,780nm,）,紫外光,（,200,380nm),中红外,（,2.5,50,?,m,),光源,钨灯,碘钨灯,320,2500,氢灯,氘灯,180,375,硅碳棒,（红外线）,吸收池,材料,玻璃,（,350,3200,）,石英,（,185,4000,）,NaCl,晶体,36,1.,单光束分光光度计,可变波长单光束紫外,-,可见分光光度计示意图,分光光度计的基本类型,37,2.,双光束分光光度计,参比池,检测器,滤光片或,单色器,放大器,样品池,光源,h,v,光子检测器,反光镜,反光镜,透明部分,扇形镜,正面图,扇形镜,反光镜,栅镜,双光束型可以消除光源强度变化的影响,.,38,多通道仪器,（,Multichannel Instruments,）,光电二极管阵列,(,通常具有,316,个硅二极管,),photodiode arrays(PDAs),同时测量,200,820nm,范围内的整个光谱,比单个,检测器快,316,倍,信噪比增加,316,1/2,倍,.,3.,其他类型分光光度计,纤维光度计,将光度计放入样品中,原位测量,.,对环境和过,程监测非常重要,.,
