CRISPR基因编辑技术课件.ppt

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1、基因组编辑技术 姓名：学号：,自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。,1973年，斯坦利N科恩(Stanley N.Cohen)和赫伯特W博耶(Herbert W.Boyer)成功将蛙的DNA插入到细菌中。20世纪70年代，基因泰克(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因(这个基因是人工合成的)，最后生产出治疗糖尿病的胰岛素。1974年，加利福尼亚州索克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)的Rudolf Jaenisch通过将SV40 病毒的DNA注射到小鼠的囊胚

2、中,培育出了第一只转基因小鼠。,基因突变技术：物理诱变、化学诱变转基因技术：T-DNA插入RNA干扰技术：dsRNA、Artificial miRNA核外遗传技术：质粒、人工染色体同源重组技术：e.g.传统的基因敲除小鼠,无法控制突变位点不能精确控制外源基因插入位点对靶基因抑制不彻底、不特异难以稳定的遗传费时费力费钱，难以大量应用并引起一系列生物伦理的问题,现 状,基因组编辑技术,基因组编辑技术（genome editing）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。也称为基因打靶（Gene targeting）。技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，

3、切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。,历史1993年前ZFN就已开始出现，迄今已发展了20多年才有今天的成就；2009年底出现的TALEN似乎一夜之间呈现出取代ZFN的架势；2012年底CRISPR/Cas已显现出取代TALEN的巨大潜力，在2013年成为现实。荣誉2011年：ZFN，TALEN和Meganuclease2011年度方法（Nature Methods）2012年：TALEN 2012年十大突破（Science）2013年：CRISPR/Cas被认为是诺贝尔奖级别的成果，华人科学家张峰已因此获得生物医学大奖。,基因组编辑技术,

4、应用基因组巡航导弹，分子剪刀，DNA外科医生定点突变，定点修饰（包括得到转基因），转录调控基因治疗（如遗传病）,基因编辑的三大利器,ZFN(Zinc-finger nucleases,ZFN)TALEN（transcription activator-like effector nucleases)CRISPR/Cas(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases）,特异性DNA识别域,非特异性核酸内切酶,+,8,ZFN原理,ZFN=蛋白的DNA识

5、别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般34个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。,9,核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA,两条ZFN之间具有被称为“间隔区”的spacer结构，该结构的长度以56bp为宜，7bp也能正常工作，合理的“间隔区”设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳的工作空间。,ZFN技术的缺陷,DNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但是其识别的序列长度比较有限。因为ZFN剪切的过程不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应；如果出现脱靶，可

6、能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。另一方面，该手段在细胞内部操作的精确程度不足，则可能会引起相关基因突变，引发癌症等。ZFN 作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。而现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻。到目前为止，ZFN技术只能用于体外操作（in vitro），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。,TALEN,TALEN（Transcription activator-like effectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作

7、技术。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonas sp.(黄单胞菌)的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。,TALEN原理,典型的 TALEN由一个包含核定位信号（NLS）的N端结构域、一个包含可识别特定 DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左

8、右），每个TAL蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA,全长为34aa的Tal 蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。NG可以识别T HD可以识别C NI可以识别A NN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。,TALEN原理,TALEN的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域；然后非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB）；再通过DNA的自我修复

9、，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。,TALEN原理,TALEN介导的基因编辑,TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的Fok I临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。,TALEN的技术特点,任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上打靶效率高，可完全替代RNAi技术脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应技术简单，只需按照常规构建质粒方法构建Tale

10、n质粒,CRISPR/Cas 9 背景,CRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌内，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列(既CRISPR序列)和CRISPR相关基因，这一序列首先由日本学者于1987年首次发现(1)，于2002年被Jansen等将正式命名(。,CRISPR-Cas系统简介,CRISPR-Cas系统的研究历史1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。200

11、2 年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th

12、 基因实现了定点突变。同年Mali 利用CRISPR/Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定点插入。,由这些序列和基因组成的系统我们称之为CRISPR/Cas系统，而在这个系统中常用到的核酸内切酶为Cas9,所以通常称该系统CRISPR/Cas9 系统。利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。,CRISPR/Cas 9 背景,CRISPR/Cas 9概述,CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。,CRIS

13、PR-Cas系统的结构,CRISPR-CAS 系统的组成主要包括:由不连续的重复序列R(repeat)与长度相似的间区序列S(spacers)间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L(leader)以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。,Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,CRISPR/Cas系统的基本结构,CRISPR系统通常包括：由不连续的重复序列（repeats，R）与长度相似的间区序列（spacers，S）间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列(leader，L)以及一系

14、列的CRISPR相关蛋白基因(cas)。Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它不需要形成二聚体才能发挥作用。,CRISPR的转录与加工,CRISPR簇首先转录成长的转录体，即（crRNA），然后逐步被加工成小的 crRNA。,CRISPR/Cas 9作用机理,CRISPR/Cas 9作用机理,CRISPR/Cas 9系统靶向要求,最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。,CRISPR/Ca

15、s 9基因编辑实验流程图,CRISPR/Cas 9的技术应用,应用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。能够在真核细胞中发挥作用，使真核基因组中的特异性位点发生双链断裂。,近日，中国科学家利用基因编辑技术CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。,CRISPR/Cas 9的技术应用,三大基因修饰技术比较,CRISPR/Cas 9系统的优势,操作简单，靶向精确性更高。sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。编码sgRNA 的序列不超过100bp，因此比构建TALE

16、Ns和ZENs更简单方便，用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。基因修饰率高，CRISPRs基因敲入的效率为51%-79%，TALENs的效率为0%-34%。基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等无物种限制,可实现对靶基因多个位点同时敲除。实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。(ZFNS一个靶点成本6000),CRISPR/Cas 9系统的评价,参考文献：1 Y.Ishino,H.Shinagawa,K.Makino,M.Amemura,A.Nakata,Nucleotide sequ

17、ence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli,and identification of the gene product.Journal of bacteriology 169,5429-5433(1987).2 R.Jansen,J.D.A.v.Embden,W.Gaastra,L.M.Schouls,Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.Molecular microbiology 43,1565-1575(2002).3方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇.CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术J.生物化学与生物物理进展,2013,08:691-702.4李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞.CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术J.遗传,2013,11:1265-1273.5沈彬.利用CRISPR/Cas9进行基因编辑D.南京大学,2014.,谢谢欣赏欢迎批评指正,