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1、1,非金属化合物及其代谢产物的测定Determination of nonmetal compounds and their metabolites,第三章,2,本章介绍内容,3,一氧化碳Carbon monoxide,第一节,4,一、理化特性,一氧化碳（CO）是煤、木材、石油等含碳物质燃烧不完全的产物，为无色、无臭、无刺激性的有毒气体。在空气中爆炸浓度12%74%。水中溶解度很低，易溶于氨水。空气中较稳定。高温下和硫反应生成羰基硫(COS)，与过渡金属反应生成金属羰基化合物，对银盐、钯盐、钼酸盐、五氧化二碘等显示还原性。,5,二、代谢和生物监测指标,职业接触非职业接触：CO含量：火药爆炸后气
2、体：3060%；汽车废气：0.610；香烟烟雾：4%。,6,碳氧血红蛋白,CO与血红蛋白的亲和力比O2高250倍，与血红蛋白生成碳氧血红蛋白（carboxyhaemoglobin）。氧合血红蛋白的解离度比碳氧血红蛋大3000倍。正常人体内碳氧血红蛋白浓度大约为0.5，而吸烟者碳氧血红蛋白最高可达1520。中毒死亡可达90%,询问吸烟史,7,CO中毒,呼吸系统毒性，头痛、头晕、意识模糊、昏迷，并发脑水肿，呼吸衰竭休克致死！,8,HbCO含量 中毒症状评价接触水平时注意吸烟史、用药史、贫血等,生物监测指标：血HbCO,呼出气中CO浓度,BEI：HbCO为Hb的3.5%；CO 23.4ppm（均为班
3、末）；BEL：HbCO为Hb的5%（班末）。,9,CO的体内代谢,吸收后的CO绝大部分以原形由肺部排出，排出速度取决于从血红蛋白释放的快慢、肺通气量、吸入氧气的浓度和HbCO的浓度等。CO半排出期128409min，平均约300min。,10,三、样品采集及保存,呼出气 接触CO后3h临近班末进行，收集终末呼出气。按常规采集，收集在采样管或复合膜采气袋中，密封，带回实验室尽快测定。,11,血液 HbCO的生物半减期约为5h，应在接触CO3h后的班末或接触最高浓度时采集静脉血或末稍血。血样置于加肝素的密闭容器中，4保存可一周。用氟化钠作防腐剂。受检者在采样当天不能吸烟。,12,一氧化碳的生物监测
4、,呼出气中一氧化碳浓度：采用气相色谱法。但要求衍生，操作复杂。血液碳氧血红蛋白：采用分光光度法,13,四、血中碳氧血红蛋白的测定WS/T 42-1996,（一）分光光度法 1.原理：血液中含还原血红蛋白（Hb），氧合血红蛋白（HbO2），碳氧血红蛋白（HbCO）及微量高铁血红蛋白（MetHb）。用还原剂连二亚硫酸钠将HbO2和HbMet还原为Hb，血样中只有HbCO和Hb。HbCO 和Hb的最大吸收波长分别为420nm和430nm，测定血样在两波长下的A，用公式计算求得HbCO百分浓度 本法最低检测浓度为2%HbCO（0.02吸光度对应浓度，10l血样），测定范围2%70HbCO。,14,2样
5、品测定,冷藏血样室温放置，混匀。迅速取10ml，加入内盛15ml Tris溶液的具塞试管中(或直接取血10ml)，加入60mg连二亚硫酸钠，轻轻混匀放置10min，测其在420nm和430nm处的吸光度值。,15,结果计算,式中：X 血中碳氧血红蛋白的浓度，%；A420血样420 nm的吸光度值；A430血样430nm的吸光度值；K1HbCO420 nm吸光常数；K2HbCO430nm的吸光常数；K3Hb420 nm吸光常数；K4Hb430 nm吸光常数。,16,吸光度的加合性原则A420=K1.CHbCO+K3.CHbA432=K2.CHbCO+K4.CHbK2A420=K1K2CHbCO+
6、K2K3CHb(1)K1A432=K1K2CHbCO+K1K4CHb(2)(1)-(2):K2A420-K1A432=K2K3CHb-K1K4CHbCHb=K2A420-K1A432/K2K3-K1K4CHbCO=K4A420-K3A432/K1K4-K2K3CHbCO%=CHbCO/CHbCO+CHb,怎么来的呢？,17,3.摩尔吸光系数的测定,取不吸烟健康人血液（肝素抗凝），水稀释5倍，取0.3ml用稀释液（Tris）稀释至90ml。通氧气30min（流速30ml/min）。从中取4份，每份15ml于试管中；其中2份通氮10min除氧，得HbO2液。另2份通纯CO10min，得HbCO液。
7、立即将HbO2、HbCO制备液分别转入盛Na2S2O4试管中，放10min后测430nm和420nm的吸光度值作为计算用摩尔吸光系数。,一氧化碳,氧气,氮气,水稀释5倍,抗凝健康人血,用Tris稀释至90ml,通氧30min(30ml/min),通氮10min,通CO10min,各取15ml,立即将HbO2、HbCO制备液分别转入盛Na2S2O4试管中，放10min后测430nm和420nm的吸光度值作为计算用摩尔吸光系数。,摩尔吸收系数测定示意图,取0.30ml,19,Tris缓冲液,Tris即三羟甲基氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane。分子式：C4H11
8、NO3，分子量：121.14，为白色结晶体，溶于甲醇、乙酸等有机溶剂。,20,Tris-HCl的优点：对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。电泳电流小。缺点：pH值受溶液浓度影响较大，稀释十倍，pH值的化大于0.1；温度效应大，温度变化对pH值的影响大，即：pKa0.031，4时缓冲液的pH8.4，则37时的pH7.4，一定要在使用温度下配制 易吸收空气中的CO2，配制的缓冲液要盖严密封。此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。,21,磷酸盐缓冲液优点：容易配成各种浓度和pH的缓冲液，受温度影响小，抗稀释。缺点：与钙、镁离子及重
9、金属离子发生沉淀；会抑制某些生化过程，如酶的活性。电泳电流大。有机酸缓冲液（甲酸、乙酸、柠檬酸等）：天然的代谢产物。对生化过程产生干扰；易与Ca2+结合。硼酸缓冲液：碱性范围常用缓冲液；易与代谢物络合，尤其与糖类羟基生成复合物影响。,22,应用高纯氮和氧，否则微量一氧化碳干扰测定。连二亚硫酸钠遇水易分解，在空气中易被氧化，应以小瓶分装使用，避免接触空气和水分。可用I2标定。测定吸光系数必须采用新鲜血液，一次测定值在仪器波长稳定的情况下可以使用一段时间。测试液应尽量避免接触空气，及时测定，否则会造成结果偏低。,注意啦！,23,（二）氢氧化钠法,1原理 正常人血样在碱性条件下立即转变成草绿色（碱性
10、正铁血红素的形成），而存在碳氧血红蛋白会使颜色转变时间增长，颜色转变所需时间与碳氧血红蛋白浓度之间存在相关性，从变色时间大致估计出碳氧血红蛋白的浓度。,24,2滴氢氧化钠,转变时间测定,阴性,查表得HbCO,2测定方法,25,变色时间与碳氧血红蛋白浓度,26,其他的鉴定实验,1煮沸法 取血23ml水浴加热，发生凝固。一氧化碳血呈砖红色凝固体，正常血呈褐色或黑褐色凝块。简便快速，含量40才可测出。2硫化铵法 取水10ml，血5滴，硫化铵5滴混合，加少量10醋酸使微呈酸性，一氧化碳血呈玫瑰色，正常血为绿褐色。此法灵敏，含量在10即可检出。取正常血同时做对照试验，以作对比。,现场，快速！,27,五、
11、终末呼出气中一氧化碳浓度测定,（一）CO测定仪法 可用便携式CO测定仪(CO传感器）CO红外测定仪，利用CO对4.67m、4.72m波长的红外辐射具有选择性吸收的原理定量。CO电化学测定仪，CO分子在扩散式电极上氧化，电化学方法检测定量。（可与报警器配套使用）催化型可燃气体传感器 扩散型CO测定仪的原理是CO经扩散后遇到专用指示胶产生由粉红色至棕色的颜色变化而定量。,28,CO电极反应,工作极上CO+H2O CO2+2H+2e对极上 O2+4H+4e2H2O总反应 2CO+O2 2CO2 在工作电极上所释放的电子产生的电流与 CO 浓度成正比,29,气相色谱法,原理 在铁氰化钾存在下，加热使血
12、样中CO释放出来，在色谱柱上与其他气体分离，然后用热导池检测器测定，或转化为甲烷（H2）后，用火焰离子化检测器测定。用血量各为2ml和1ml。,30,第二节,二硫化碳Carbon disulfide,31,一、重要理化特性,二硫化碳能自燃。常温为无色透明。难溶于水，能溶于强碱和有机溶剂。易挥发、易燃、易爆、具腐蚀性，蒸气比空气重2.63倍。二硫化碳体内代谢产物2-硫代噻唑烷-4-羧酸（2-thio-thiazolidine-4-carboxylic acid，TTCA），是二硫化碳与谷胱甘肽结合所生成的特异性代谢产物。,32,二、毒性、代谢,CS2,80%,原形呼出,血液,肝肾,尿,代谢物,3
13、3,二硫化碳在体内代谢途径,34,三、CS2的生物监测指标,班末尿中TTCA可作为接触CS2的生物指标。周末、班末尿中TTCA的浓度高于工作周第一班末的尿样。呼出气中二硫化碳浓度也可作为生物监测指标BEI:TTCA 5mg/g肌酐（班末）；BEL:TTCA 2.2mg/g肌酐（班末）。,35,样品采集,1.尿样 尿样采集时间为工作班末或周末。采集后尽快测定，置于8冰箱中可保存1周。2.呼出气 常规采样。,36,四、CS2及其代谢产物的测定方法,呼气中CS2用气相色谱法测定（WS/T41-1996）。碘叠氮化钠褪色法：尿中CS2的代谢产物催化碘还原成碘离子，根据碘褪色所需时间及尿样中肌酐含量计算
14、。灵敏度低、特异性差。HPLC法：定量测定尿中TTCA。TTCA很少商品出售，需自己合成。非职业接触者尿中不含TTCA。,37,五、TTCA的高效液相色谱法,1.原理 尿样经盐酸酸化后，用乙醚萃取TTCA，浓缩后进样HPLC，经反相C18柱分离，紫外检测器273nm测定。以保留时间定性，峰高定量。,38,3.样品处理及测定,1ml经离心后的尿样,漩涡混匀2min,3000rpm离心10min,乙醚 5ml,0.1ml 2mol/L HCl,乙醚层40水浴氮气挥干,0.20ml甲醇溶解后HPLC分析,39,4.仪器操作条件,色谱柱：反相C18柱；柱温：室温；流动相：甲醇水冰乙酸14.584.51
15、流速：1.5ml/min；紫外检测波长：273nm。,40,尿样TTCA液相色谱图,本法最低检测浓度20g/L（尿样1ml）,41,5.注意事项,TTCA的制备方法 1.12g碳酸钾/6ml水 0.96g L胱氨酸，温热至全溶，冷至室温后，加CS2 1.2ml，强烈搅拌24h。反应完全后，调pH1.0，以100ml乙醚分3次提取，然后用3ml10HCl洗涤。用无水硫酸镁干燥乙醚层，再真空干燥，得粗品TTCA。用1:1HCl加热溶解，再用少许活性炭脱色，趁热过滤，滤液冷却后，析出无色针状结晶TTCA（mp180），烘干即可。,42,六、呼气中CS2的GC法测定,1.原理 将终末呼出气收集在双阀气
16、管中，直接进样，或将样品富集在高分子多孔微球吸附剂上，热解吸后进样，经OV-17色谱柱分离，FID检测器检测，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。OV17:苯基(50%)甲基硅酮phenyl methyl silicone(50%),43,2.样品采集、保存和处理,受试者正常呼吸1min后，将双阀采气管两端活塞打开，采样管一端含入口中，向管内深吐气，吐气完毕关上两端活塞。室温存放，24h内分析。当浓度太低时，需将样品富集，方法是：将采气管一端接TenaxGC管，另一端接100ml注射器，用6倍于采气管体积的空气或氮气以200ml/min速度冲洗，将管内样品富集在Tenax GC管中测定。,44,
17、3.仪器操作条件,色谱柱：1m3mm不锈钢柱，填充OV-17（丙酮溶剂），Chromosorb W AW DMCS（80100目）=5+100。柱温：70；气化室温度：120；检测室温度200；载气：N236ml/min；助燃气：air 220ml/min；燃气：H2 175ml/min。检测器：FID；140解吸3min。Chromosorb W AW DMCS即经酸洗（AW）并经二甲基二氯硅烷（DMCS）处理过的多孔性高分子微球W（chromosorb W）。,45,4.样品测定,直接进样：用注射器从采气管中抽取呼气样1.00ml直接进样；重复3次，以标准曲线法定量。浓缩进样：将已富集样品的Tenax GC管的进气端作为出气端，联接在色谱柱进样口。控制热解吸时间为3min进行测定。标准曲线法定量,46,CS2 GC图谱,47,5.注意事项,采集不同阶段的呼气结果不同，为保证结果准确，采集肺泡气，即收集呼出气最后的200ml左右。富集样品测定时，冲洗用气量不少于采气管容积的6倍；冲洗用气的温度不高于室温；热解吸时间不少于3min，以保证样品完全转移和完成样品的瞬间释放。,
