生化分析仪的基础与应用全解.doc

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1、 生化分析仪的基础与应用生化分析离不开生化分析仪。所谓生化分析一般是指以吸光光度分析为基础的（有的包含离子选择电极等测定方法）、具有样品取样及加试剂、混合、保温反应等测定。分析过程监控和数据处理及输出能力的半自动或全自动仪器。它们的分析方法都以仪器和试剂为基础，以方法学为指导标准来规范，以试验参数来联系体现。所以，首先必须了解仪器、试剂和方法学的原理及特点，其次是利用方法学评价对仪器、试剂及参数在实践中作评价，以保证分析的精密度和准确度，提高成本效益。实验证明，单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律可用下式表示为 A

2、KCL 式中：A（E）吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）； K某溶液的消光（吸收）系数； C溶液的浓度； L光程，即溶液的厚度。 可见、收光谱法的定量基础是朗伯比尔（Lambert-Beer）定律： A=lgI o/ I t =-lgT=lg1/T 吸光系数即当一束强度为L的平行单色光通过一个含有浓度为C的吸光物质、厚度为L的吸收他时，光的一部分被吸收，光强度从IO减小至It。当吸光系数k一定时，透过光与浓度或厚度呈指数函数关系，但吸光度（absorbance，A）与浓度或厚度呈简单的正比关系。 在浓度、厚度、单色光波长、溶剂及其温度等相同条件下，不同吸光物质的吸光度不同，即它们的吸光系数（

3、absorptivity）不同。是物质的特性常数，它只和该物质分子在基态和激发态之间的跃迁几率有关。它的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度，常用的表示方式是摩尔吸光系数（molar absorptivity）。摩尔吸光系数即1摩尔浓度的溶液在厚度为 1cm时的吸光度。在吸光度与浓度之间的直线关系中，吸光系数是斜率，其值愈大，测定灵敏度愈高。 应用注意点： 1由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，Beer定律成立的重要前提之一是单色光，即只有一种波长的光。但在实际测定中，入射光常常并非严格的单色光，常有不同波长的辐射同时存在。此种多色辐射是使测定中吸光度的变化偏离Beer定律（常

4、为负偏离）的主要光学影响因素。单色光的纯度可用谱带宽度（bandwidth）衡量。单色光源是用分光光度计由单色器或滤光片从连续光谱的多色光中选择的、最大吸收波长max在内的一小段波长范围的复合光。以谱带宽度较小、吸收峰较宽的max作为测定条件。 2Beer定律一般适用于稀溶液的测定 有两层含义：被测物的浓度不宜过大，其吸光度应在相对测量误差较小的区域；溶液在反应中存在化学平衡，受浓度、pH、溶剂和温度等因素的影响。 3介质不均匀引起偏离 当待测试液是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光因一部分散射损失，使透光率减小，实测吸光度增加。 比浊法及免疫浊度反应的特点 比浊法与可见、紫外吸收光谱法不同，

5、它们不是测定澄清溶液而是测定悬浮液或胶体溶液中物质的浓度，分析的光学基础是分散颗粒对光的反射、折射、散射和吸收等多种作用。生化分析仪通过免疫比浊法等技术，架起临床生化与现代免疫技术的桥梁，免疫化学法的应用日益广泛。 1比浊法的分类及原理在光源的光路方向上测量透射光（实际包括透射光和散射光）强度与入射光强度的比值和被检溶液中颗粒浓度间的关系，称为透射比浊法（turbidimetry）。在光路的一定角度（一般为5o90o）方向上测量散射光强度和被检溶液中颗粒浓度间的关系，称为散射比浊法（nephelometry）。 透射比浊法的计算公式是： In（IOI）b令=23kclgI o/ I kbc 即

6、当一束强度为I o的平行光通过一个散射颗粒浓度为c混浊介质厚度为b的稀的悬浮液后，人射光被吸收和散射，光强度衰减至I，在浊度系数为时，透过率与颗粒浓度呈线性关系。 散射光强度与悬浮液或胶体溶液中的颗粒质点大小、入射光波长大小及二者的比例有关。颗粒直径接近或大于光源波长时，常呈透射光和光路上的向前散射光，其散射光强度与入射光强度的关系遵从Mie散射理论，光散射随波长的变化小。颗粒远小于光源波长（d小于005）时常呈偏离光路方向、900对称分布的散射光，其散射光强度与人射光强度的关系符合Rayleigh散射定律，波长愈短，散射光愈强。 一般比浊法的灵敏度不如可见、紫外吸收光谱法，但免疫浊度法的敏感

7、度约为50ngrnl。聚合剂（如聚乙二醇600010000）可提高免疫复合物的形成速度。胶乳增强免疫浊度法（latex enhanced turhidimetric immunoassay）由于采用颗粒较大、折光性强的胶乳，将抗体经吸附或共价交联反应固定于胶乳表面，增加抗原抗体凝聚体积，减少透过光，使灵敏度提高到近1ngml水平。散射比浊法的灵敏度比透射比浊法高，但干扰因素较多。比浊法的精密度相近，变异系数为155。目前，由于技术发展，两种比浊法的灵敏度和特异性已接近，而全自动生化仪的自动化程度和精密度要胜于专用散射比浊仪，故透射免疫比浊法在临床上的应用日益广泛。速率法的灵敏度和特异性都优于终

8、点法，但终点法的稳定性较好。2免疫浊度反应的特点抗原抗体反应与其他化学反应不同，在免疫浊度反应中，抗原抗体复合物的生成量和生成颗粒的大小，与反应体系中抗原抗体的比例关系极大抗原相对不足时，生成的免疫复合物沉淀量少；抗原抗体比例合适时，复合物生成量达到峰值；抗原过量时，复合物反而再溶解，沉淀量下降。临床上免疫比浊法多用抗体测定抗原，保证抗体足量、防止抗原过量是基本的方法学条件。要使在临床常见的高抗原浓度范围内（至少高于正常参考上限 50 ）抗体也足以与之反应，只有这样，抗原抗体复合物的生成量才随抗原的增加而递增，光散射的强度才与抗原量成比例。抗体不足时，测定结果往往偏低。 3应用注意点 （l）若

9、悬浮颗粒本身具有特征吸收，则吸收作用是主要的，宜选择最大吸收波长作比浊测定；若悬浮颗粒本身无特征吸收而介质对人射光有吸收，则测定必须选择在高透光度的波长区。若悬浮颗粒小（粒径小于35nm），溶液浊度小，透射比大于90%，不宜选用透射比浊法，应选择散射比浊法测定。 （2）透射比浊时，35100nm大小的微粒在波长290410nrn下有最大吸收峰，免疫复合物的大小大致在此范围。散射比浊时，较大的散射光角度适用于35100nrn大小的微粒，较小的散射光角度适用于100800nrn间的微粒。血浆中的白蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白等微粒直径多在50nrn以下，其散射光是对称的。IgM、乳糜颗粒、免疫反应初期

10、产生的抗原抗体复合物等颗粒的直径在50-400nrn，都属颗粒直径接近或大于光源波长这一类，其散射光是不对称的。 （3）非特异性光散射的影响：免疫浊度法常受内源性光散射的干扰。血清中的乳糜微粒、VLDL、LDL以及反应体系中的颗粒都会产生杂散光，影响比浊灵敏度。为避免上述影响，样品组分的比例，透射比浊法宜在3以下，散射比浊法应在05以下。所用的试剂要澄清，必要时经022m滤膜过滤。应作试剂空白和样品空白。（4）带现象（zone phenomenon）的影响：抗原或抗体过剩使免疫复合物部分或全部解离的现象，称为带现象。免疫浊度测定中常表现为抗原过剩时免疫复合物形成的量反而下降，又称钩状效应（ho

11、ok effect）。克服办法主要是：采用高质量试剂，设置仪器监测，减少血清用量。（5）伪浊度的影响：即不是特异性抗原抗体反应产生的免疫复合物形成的浊度。形成原因复杂，主要是抗血清存在的非特异性交叉反应性杂抗体成分，增浊剂浓度过高和反应时间掌握不当，样品本身的浊度处理不当，试剂污染和变质，比色杯不洁，等等。 （6）校准与计算：应选用适当的校准品及浓度作剂量反应曲线。曲线往往有截距或呈S形，不成直线。自动生化分析仪多推荐5点或6点定标，然后选择适当的数学模型作曲线拟合，如 IngitLog变换或 y dcx bx2 ax3的 3次方程回归曲线。更换试剂批号时也必须重新校准曲线。 （三）均相酶免疫

12、分析酶联免疫分析利用免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对抗原或抗体进行测定，均相酶免疫分析（homogeneous enzyme immunoassay）是其中的一类。在均相酶免疫分析中，最常用的是酶放大免疫分析（enzyme multiplied immunoassay，EMIT）。其原理是：当酶标抗原（半抗原）与相应抗体结合，生成酶标抗原抗体复合物后，对标记酶产生调节作用，使酶的构象改变，酶活性抑制、恢复或增强，酶催化的信号随之发生改变；酶标抗原抗体复合物与游离酶标抗原同处一相，不需分离步骤就可测定酶活性，计算出被检抗原（半抗原）的含量。常采用酶标抗原与未知抗原对特异性抗体的竞争反

13、应：抗原与标记酶结合使酶的活性抑制或激活，再与相应抗体结合后其酶活性被激活或抑制，未知抗原和酶标抗原与抗体形成竞争体系。 均相酶免疫分析目前主要用于检测小分子半抗原，如某些激素、药物或代谢产物，也逐渐用于大分子物质，如血清 IgG测定。测定药物的灵敏度一般为 0 5 2gml。方法简便、快速，准确性和重复性好，但影响酶活性的因素也必然影响酶联免疫分析。 克隆酶供体免疫分析（cloned enzy。 donor immunoassay，CEDIA）是有发展前途的均相酶免疫技术，灵敏度比一般酶免疫法高。其原理为：用基因工程技术制备称为酶供体（ED）和酶受体（EA）的两肽段。ED和EA独立存在时无酶

14、活性，但在合适条件下可以自动装配并聚合成具有酶活性的四聚体。ED标记申抗原小分子或抗原大分子后，不影响其与EA的装配，但当相应抗体存在时，抗原抗体结合后形成的空间位阻使酶的装配受阻，使用竞争结合模式即可检测末知的半抗原或抗原。 (四)酶促反应的特点： 由酶催化的反应称为酶促反应。以酶作为试剂来进行分析测定，或通过酶促反应测定待测酶的活性，具有高效、专一、温和、灵敏的特点，广泛用于生化分析。试剂中的酶活性（浓度）在反应过程中始终不变。下面仅对酶活性测定知识作介绍。 1酶活性测定 生物体内含有成千种酶，存在于细胞中。当细胞通透性增加或细胞破裂时，会使体液中酶浓度增加，因此测定体液中特别是血液中酶浓

15、度的变化有助于临床诊断疾病、判断预后和观察疗效。血液中的酶含量甚微，一般每毫升含量在微微克（Pg）到毫微克（ng）水平，因此要直接测定酶含量是非常困难的。虽然近年免疫学技术发展迅速，可以对某些酶直接进行测定，但目前临床仍以测定酶活性间接推算酶的含量。 酶活性的大小，是在一定条件下通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量引起的吸光度变化，即测定酶促反应的速率来获得的。一般情况下，产物和底物的浓度变化是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好。这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，反应时间通常又很短，尤其在酶活性很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易精确；

16、反之，产物从无到有，只要测定方法灵敏，准确度可以很高。所以，酶活性测定大多数采用测定产物生成速率的方法。2酶促反应三阶段酶促反应是一个可逆反应，其反应全过程的速率并不都与酶活性成正比。将酶促反应过程中测得的产物或底物的变化量对时间作图，得到酶促反应时间进程曲线， 图中产物P或底物S的浓度变化曲线的斜率就代表酶反应速率。酶促反应一般分为三阶段。 （1）延滞期（lag phase）：底物与酶混合、反应启动后的一段短时间内，产物从零开始逐渐生成，处于较低水平，反应速度较低，未达到待测酶最大反应速度；另外，在酶偶联反应中，指示酶的反应必须有一定量测定酶的产物堆积才能进行；这些都使酶反应要稍待一定时期后

17、，吸光度才有明显的线性变化，这一时期称为延滞期。延滞期的长短不一，当反应体系中存在抑制剂或有干扰物质参与的副反应时，延滞期可延长；当样品酶活性过高或反应体系中存在激动剂时，延滞期可缩短。 在开始酶反应（即待测样品与基质混合）之前，应有一个预孵育期（preIncubation period），让所有可能干扰测定的反应充分进行，避免干扰待测酶活性。内源性产物被工具酶催化消耗，内源性底物也通过偶联反应充分消耗，然后加入底物启动反应。 （2）线性期（linear。base）：在反间应体系中底物大于酶饱和浓度的情况下，产物或底物的变化量随反应时间呈线性增减，即反应速度（单位时间内产物或底物的变化量）恒定

18、不变，这一时期称为线性期或恒态期，亦称零级反应期。在此期，反应速度不受底物和产物浓度的影响，只与酶活性浓度呈线性关系。测定酶活性都在零级反应期进行。 (3）偏离线性期：随着反应时间的延长，反应体系中的底物不断消耗，酶不能被其饱和，以及可逆反应、产物抑制、酶变性失活等原因，致酶促反应速度下降，产物或底物的变化曲线渐趋平坦，这一时期称为偏离线性期，亦称一级反应期。在此期，反应速度不仅与酶活性浓度有关，还受底物浓度影响，与底物浓度成正比，因此不能准确反映酶的真正活性，产物浓度与反应时间不呈线性关系。 二、自动生化分析仪的基本结构及工作原理 (基本结构) 1按照反应装置的结构，自动生化分析仪主要分为流

19、动式（flow system）、分立式（discrete system）两大类。 （l）流动式：指测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应在同一管道流动的过程中完成，这是第一代自动生化分析仪。 （2）分立式：指各待测样品与试剂混合后的化学反应都是在各自的反应杯中完成的，其中有几类分支。 l）典型分立式自动生化分析仪：此型仪器应用最广。 2）离心式自动生化分析仪：每个待测样品都是在离心力的作用下，在各自的反应槽内与试剂混合，完成化学反应并测定。由于混合、反应和检测几乎同时完成，它的分析效率较高。 3）袋式自动生化分析仪：是以试剂袋来代替反应杯和比色杯，每个待测样品在各自的试剂袋内反应并测定

20、。 4）固相试剂自动生化分析仪：亦称为子化学式自动分析仪，是将试剂固相干胶片或滤纸片等载体上，每个待测样品搞加在相应试纸条上进行反应及测定。操作快捷、便于携带是它的优点。 生化分析仪的正确应用只是掌握了测定技术原理还不够，还需要对具体仪器的工作流程及测定计算方法有足够了解。1一般工作流程工作流程可以通过仪器的测定周期来考察。重点关注比色杯空白读数点（CB）、加样品点（S）、各试剂加液点（R、R2、）、试剂空白读数点（RB）、各测定读数点（P）、各点时间间隔及周期总时间等。每个仪器一般都在反应转盘的固定位置和反应测定周期的固定时间设置样品、试剂和稀释的加液位，以及（始点测定吸光度一始点空白吸光度

21、）。如HITACHI7170在P1至P34周期为10分钟具体工作流程如图2-2所示 图2-2 2数据处理计算方法 仪器在各个吸光度读数点读取的吸光度数据，并不一定都纳入浓度计算。仪器往往根据仪器定义和操作者设定的要求，对吸光度原始数据作计算处理，转换成所谓的反应数据，再按系数或公式作浓度计算。举例如下： （1） HITACHI 7170的终点法：测定点（AX）吸光度计算为（AX AX-l）2，实际吸光度=吸光度数据10000。 （2） OLYMPUS AU600试剂空白数据： PO点试剂空白（RB） PO点吸光度一比色杯水空白（WB）；任一测定点试剂空白（RBX）=该点吸光度一比色杯水空白（W

22、B）。 （3） Monarch 1000两点终点法的反应数据=（终点测定吸光度一终点空白吸光度）（始点测定吸光度一始点空白吸光度） （4）AU600终点法（带试剂空白，END法）的反应数据=终点吸光度一PO点吸光度（试剂空白，RB）。终点法（不带试剂空白，ENDI法）的反应数据=终点吸光度一比色杯空白（WB）。 （5）AU600两点法（自身空白）的反应数据二（加第二试剂后测定点读数-PO点读数）（加第二试剂前测定点读数-Po 点读数）。 1仪器运行前操作程序主要进行仪器的基本设置。 (1) 试验项目设置：对试验名称、编码、试验组合（profile）、试验轮次（round）、必要时包括试验顺序等

23、设置。 （2）各试验的参数设置：包括试验间比值、结果核对等参数的设定。 （3）试剂设置：根据有关试验参数设置各试验的试剂位、试剂瓶规格，必要时设定试剂批号、失效期等。 （4）校准品设置：对校准品的位置、浓度和数量等进行设置。 （5）质控设置：根据质控要求设置质控物个数、质控规则、质控项目及相应质控参数等。 3测定结果的检查分析 (1)要了解和熟悉仪器的各种警示符号的含义与作用：在正确设定参数的前提下利用各种警示符号能提高我们发现问题和解决问题的效率。 （2）要熟悉和灵活运用仪器的相关操作屏（界面）：如用反应过程监测观察反应时间进程曲线；用校准追踪（calibration trace）回顾分析校

24、准曲，利用统计（statistics）了解不同日期段病人测定均值及数据分布；运用分析数据编辑察看和校正测定数据。 （3）校准的检查：要充分利用仪器设置的功能检测校正曲线图形、各校准点吸光度值（不能忽略试剂空白值及空白速率值）计算K值等的波动情况，以及以往的比较。必要时应进一步检查反应时间进程曲线。必须结合质控数据来把握实践条件。 （4）病人结果的检查：除了目测观察或用血清指数了解标本性状、注意和了解临床及诊断外，学会分析反应时间进程曲线及数据是重要的基本功。四基本测定方法 1终点法（end point method）根据反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其吸光度大小，对物质进行定量分析的方

25、法。对一般化学反应来说，反应完全（或正、逆反应动态平衡）、反应产物稳定时为反应终点。对抗原一抗体反应来说，是抗原和抗体完全反应、形成最大且稳定的免疫复合物时为终点。在反应时间进程曲线上为与X轴平行的区段。在测定计算方式上，一般分为一点法和两点法两种。 (1) 一点法（one point）：以试剂和样品混合之前的空气空白（GB）、水空白（WB）或试剂空白（RB）的吸光度值为测定计算基点，以反应终点的吸光度读数减去空白读数，得到反应吸光度。通过与相同条件下校准液反应吸光度的比较，求得测定结果。常与一点校准法配合使用，即采用一个校准浓度，校准曲线通过零点且成线性。也应用多点校准。 （2）两点终点法（

26、two point end）：即终点-始点法。以试剂和样品混合之后的某一时间点作为始点，以反应终点的吸光度读数减去始点读数。一定条件下可降低样品对反应或反应本身的非特异性干扰（主要指色度干扰）。常采用双试剂，多以加 R2前某一点作为测定始点；某些情况下，也可以加 R2后一点作为测定始点。若使用单试剂，主反应启动太快或仪器起始读数点受限时难以运用。 固定时间法（fixed method）与两点终点法的区别只是在：测定读数的末点不在反应平衡区段，而是根据方法学选择，如血清肌肝（苦味酸法）测定。 （3）三点终点法：即双终点法，在一个通道内一次进行两项反应相关的终点法测定，比如同测游离脂肪酸和甘油三酯

27、。某些仪器（如 HITACHI系列）设置此方法。 2连续监测法（continuous monitoting method）又称速率法（rae assay）即连续监测反应过程，根据所测定的产物生成或底物消耗的速度进行定量分析的方法。在反应时间进程曲线上为反应呈恒速区段（斜率保持不变），常用于酶活性线性反应期测定。 (1) 连续监测法：即零级反应速率法，亦称斜率法。在较长的反应时间区段内（至少90120秒），每隔一定时间（常为230秒）读取一次吸光度值，至少读取4点，得到3个A；一般将连续多次读数作最小二乘法处理，读数间隔时间太短的作带速率时间(TR）多点法处理，均取线性反应部分的读数，求出单位时

28、间内的反应速率Amin。此法必须以零级反应为测定计算的基础，因为只有在零级反应下，单位时间内的吸光度变化反应速率 Amin）才与酶活力呈正比。此法相对减少了分析误差，大大提高了分析速度和准确性。但是，半自动生化分析仪采用单样品连续监测，相当耗时。 应用连续监测法，首先应准备线性范围内的高、中、低浓度的样品，分别作反应时 （2）两点速率法：即所谓的拟一级速率法。在反应中选取两时间点t1、t2，读取吸光度A1、A2，计算（A1A2）（t1t2）=At。此方法与两点终点法的区别主要有两点：后一读数点反应未达终点，以速率计算结果。与连续监测法比较，其缺点在于人为确定t1、t2，不定因素较多，不能保证反

29、应在t1t2期间呈线性，影响结果的准确性。 应在常规测定前先做预试验来确定线性时间段；若在选择的时间段内反应不成线性（如零级反应期短，仪器无法设置或测定），则只能改用终点法。优点在于方法简单，酶活力较低，测定吸光度值较小时，可增加测定时间段而不受仪器连续监测时间点的局限，减小了读数误差。 （3）速率B法：在一个通道内一次进行两项反应相关的速率法测定。它既可以是两项试验测定，也可用于干扰或及样品空白自动补偿。后一用途的原理是：利用仪器的微机自动处理，在第一反应（干扰反应）一直维持线性的前提下，可以从第二反应（主反应）速率中扣除第一反应速率的延续影响。如可用于消除胆红素转化为胆绿素后吸光度下降、对

30、肌酥苦味酸法测定的负干扰，等等。某些仪器（如 HITACHI系列）设置此方法。 3，空白（blank）校正在分光光度法中，常利用空白溶液来调节仪器的吸光度零点，或用来抵消某些测定的干扰因素。在生化分析仪测定中，除了采用双或多波长、两点法等排除背景干扰外，常要运用专门空白测定，以便从样品测定吸光度中扣除其影响。正确选择空白校正，对提高准确度起着重要作用。 （l）试剂空白：一般在方法类型和校准模式中，即分为有或无试剂空白两大类。试剂空白单独测定或与校准配合测定，并需预先装载去离子水样品杯或试剂空白架。校准或病人样品各测定点的吸光度，均要扣除相应测定点的试剂空白吸光度或空白速率值。 在不少仪器中，试

31、剂空白测定类似校准测定，并非在病人样品测定时实时测定。所以，要注意它的测定频率，避免因试剂批号或质量变化造成试剂空白的改变而引起计算误差。 （2）样品空白：主要为了消除样品本身混浊或色度的干扰。常采用空白通道法，测定校正结果=显色反应通道结果-空白通道结果。多数仪器须另外占用测定通道，分析速度减半，但去干扰的准确性应高于两点终点法。 三、自动生化分析仪的基本参数及应用 了解生化分析仪基本参数的原理，有利于仪器、试剂的正确使用，有助于正确分析和处理测定数据。但是，配套系统的原装分析参数不宜更改；采用非仪器配套的试剂及校准品体系时，参数修改要慎重。对于不同仪器、不同类型的反应分析程序，所显示的人机

32、对话分析参数的信息有所不同。 （一） 反应测定时间 多数全自动生化分析仪可以在整个测定反应周期内连续监测（如 HITACHI 7170常规测定周期 10分钟，监测 34点，OLYMPUS AU600固定周期 8分 15秒，监测 27点），但反应监测时间是指该时间内的测定读数要用于结果计算。它的设置与加样点、加试剂点（包括R1、R2）、监测时间（读数点）、读数间隔时间及试剂样品比例等有关，要结合方法学兼顾权衡。1反应时间（reactfon time）指仪器的一个分析周期中，试剂和样品混合到最末一点测定读数的时间。它对终点法尤其重要，是终点法的瓶颈。有的仪器有多个反应时间可选（如 HITACHI

33、7170），须预先选定。多数仪器为 10分钟左右，这对试剂提出了较高要求。不少终点法试剂（尤其手工法试剂）反应时间常常也在10分钟上下，测定时间没有余地，当样品浓度高或试剂质量下降时，均可致测定结果偏低。因此，终点法不宜采用标明反应时间接近和长于仪器最大反应时间的试剂盒。不得已时必须用接近测定范围上限的高浓度质控血清监测。2监测时间（读数点）和读数间隔时间各类型仪器不尽一致。离心式生化仪读数间隔时间短，监测时间也短。流动式生化仪读数间隔时间一般较长。分立式生化仪一般监测时间10分钟左右，间隔1030秒读数一次。有的仪器在整个测定反应周期全程读数，有的只读取指定时间（点）的吸光度。3加试剂点 采

34、用双试剂时，加 R2点决定 R1与样品的反应时间，也决定 R2与R1及样品的反应时间。一般仪器各5分钟左右。 HITACHI 7170有四个加试剂点，若采用双试剂，各5分钟，则加R2设在第3加试剂点。 4反应监测时间还要考虑延迟时间的长短、测定物质的浓度范围及相关临床价值。工作效率等因素。 （二）延迟时间 延迟时间（delay time）是指试剂与样品混合后到监测开始之间的时间。一般用于两点法和速率法，某些情况下也用于终点法。终点法应选择反应趋于平衡的时间（稳定期或平衡期）作测定，测定点前即所谓的孵育期。速率法的线性反应期之前即延迟期。正确选择延迟时间的长短，有利于准确测定，减少试验误差。设置

35、一般根据试剂盒的说明书，还应考虑本室的仪器特点和工作程序。 1仪器特点 比如半自动生化仪多为流动比色池，要考虑泵速、进样管长短。反应液粘稠度及混合情况，以及室温、反应液温度同反应要求温度间的温差，等等。全自动生化仪的测定读数设置方式不同，直接以“秒”设置，或以测定点设置，测定点间隔时间不一样，需要灵活掌握。 2试剂及方法学 （l）试剂组成：在酶活性的连续监测法时，若试剂含工具酶数量多、偶联反应多，则激活反应时间一般较长，延迟时间也较长，如肌酸激酶（NAC法）延迟时间常设置120180秒；若试剂中底物经待测酶催化，其产物可以直接测定的，则延迟时间较短，如 -谷氨酰转移酶（GGT）设定 30 60

36、秒。同一项目同一方法，但试剂配方不同，其反应快慢等特征也可能不同，如白蛋白测定。白蛋白与溴甲酚绿（BCG）为即时反应，10秒钟内已完成，其后、球蛋白等也将与BCG发生反应，所以孵育时间不能延长。但在同一测定时间，BCG浓度、缓冲液种类、pH和表面活性剂不同的试剂，测定结果可能差异明显。（2）样品异常成分干扰：有的试验项目需要用工具酶将内源性代谢产物耗尽，比如丙氨酸氨基转移酶活性测定试剂中须有足量的乳酸脱氢酶（LDH）。如果使用单试剂，正常血清样品延迟时间60秒即可；但当内源性酮酸增多（如酮症酸中毒）时，试剂内LDH常常不能在60秒内完全将其清除，剩余酮酸会进入监测期干扰测定，使测定结果偏高，所

37、以延迟时间应增至90120秒。采用双试剂，则可在加入R1后即进入预孵育期。 （3）方法学要求：比如肌酐（Jaffe氏法）测定的特异性不强，一般认为反应前20秒左右为乙酰乙酸等快反应干扰物呈色，后约80100秒为蛋白质等慢反应假肌酐呈色，2060秒肌酐呈色反应占主导地位。采用两点法或速率法可减少干扰，但具体取多长的延迟时间，应根据试剂和仪器读数特点来评价决定。 3工作程序要在保证准确性的前提下，合理设置参数，提高工作效率。最突出的例子是半自动生化仪上酶活性连续监测法的延迟时间设定。由于只能单份样品逐一测定，若延迟时间全部设置在仪器内，每个延迟时间加监测时间至少1分钟以上，守候时间较长。工作量大时

38、，可以根据仪器控温、加样及读数和试剂特点以及室温情况，将延迟时间挪一部分到机外，套式操作，但要确保机内延迟时间未需进入线性反应期。4要兼顾延迟时间和监测时间反应时间是有限制的。在速率法和两点法中，延长延迟时间必然缩短线性监测期，减小测定的线性范围，也易发生底物耗尽。 （三）样品量、试剂量与稀释量 有关参数包括样品量、试剂量、稀释（水）量、最小反应体积和最大比色杯容量等。如 HITACHI 7170反应体积 180 380l，最大体积 570l。 BT224半自动生化仪流动比色池容积33l，吸液量200990l，最适体积500l。1 最小反应体积在仪器光度读数要用于结果计算时，反应液液面高度不低

39、于光度计光径的最小体积。它保证仪器的正确读数和计算，也是仪器测定精度和经济性的指针之一。在有的仪器中，它以反应体积的下限表示，有的则专门标明最小反应体积。在单试剂测定中，样品与试剂的总体积不得少于此参数。在双试剂测定中，若R1与样品的反应读数不纳入结果计算，R1的加液量可不考虑此参数，如连续监测法；否则应考虑它对结果的影响，如终点法在加 R2之前读数，并以此来扣除试剂或样品空白时。在半自动生化仪中，最适吸入量相当于最小反应体积。它与进液管道长度、流动比色池容积、吸液泵抽吸力大小和液体粘稠度有关，它要保证光度检测不受空泡和前后样品携带污染的干扰。因此，吸入体积不能任意降低，必要时应加大反应液量和

40、吸入量。2最大比色杯容量这个参数含义明确。在有的仪器中，它以反应体积的上限表示，有的则专门标明最大比色杯容量。反应液超过此体积，将致液体外溢，仪器测定系统被污损。 3样品试剂比例样品与试剂的比例（SV：RV），也可表示为样品体积分数-样品体积与反应液总体积的比值（SVTV），是方法学基本参数。酶活力测定中，样品在总体积中的比例应在10以下。一般说来，待测物质在样品中含量低的、生理波动范围大的，样品用量较大。如 Trinder反应测定血清葡萄糖、胆固醇等，样品试剂比例多为1： 100，测定血尿酸或高密度脂蛋白胆固醇，常增加为1：5 0；ALT和AST的样品试剂比例多为1：10至1：20。方法灵敏

41、、吸光度高的实验方法，样品试剂比例小，如白蛋白BCG法，样品试剂比例常为1：200。肌酐Jaffe氏法监测时间短，吸光度值较低，样品试剂比例多为1：10。一般应以试剂说明为准，不宜轻易改动。 （1）改动样品试剂比例，影响一系列方法学参数。若比例增大，则线性范围缩小，线性反应时间缩短，样品内源性干扰、基质效应增加，旁路反应会增强，方法特异性也下降。若比例减小，检测信号偏低，信噪比（噪音信号）增大，当仪器精度不高时，会加大测量误差。 （2）改动样品试剂比例，对某些反应有影响。如碱性磷酸酶（ALP），有文献报道：当样品试剂比例从1：25降至1：50时，酶活力测定值增加，再低于1：50时不再增加，这一

42、效应可能是较高稀释度下ALP多聚体解聚的结果。体液样品稀释也可能对测定结果产生影响。 l）大多数蛋白质在浓溶液中的分子构象比稀溶液中稳定，样品稀释可影响酶的稳定性。 2）降低样品中内源性抑制剂或激动剂的浓度，如以蒸馏水稀释血清，可能因降低血清中淀粉酶的激动剂氯离子的浓度，致测定淀粉酶结果偏低；随血清稀释倍数增加，肌酸激酶测定活力增加，可能与降低样品中AMP、胱氨酸等内源性抑制剂有关。 （3）双试剂时要兼顾R1、R2 和样品三者的比例，尤其不宜改动试剂间的比例。4稀释（水）量在加样或加试剂时，加入去离子水或可以指定的液体。它的主要用途有两个，一是用于浓缩试剂的稀释或样品、校准品的稀释；二是在样品

43、加量小的时候用来冲洗样品探针，减小携带误差，但用量不宜太多，以免稀释试剂影响反应。要把稀释水量纳入样品试剂比例和反应液总体积考虑，必要时，干粉试剂复溶也要考虑此因素临床实验室的质量要求临床实验室质量要求即分析试验的医学实用性要求，通常以允许总误差形式来表示临床实验室质量要求。总误差概念：在常规测定中每个标本测定结果均有误差，这个误差包括了对方法学评价时的各种类型的随机误差和系统误差，因此测定结果与真值的差异是随机误差RE和系统误差SE的总和，即总误差TE 。总误差必须在临床可接受的低水平范围内，这种检测方法才能用于常规检查。一、如何制定允许总误差允许总误差：用TEa表示，它被规定为95%样品的

44、允许误差限度，即95%的患者样品其误差应小于这个限度。制定的允许总误差既反映临床应用与解释结果的要求，称为医学效用限度，又应基本符合实验室所能达到的技术状态。因此，需要由临床医学专家和临床实验专家共同研究决定。一根据参考值与参考范围制定的标准来考察二根据临床观察制定的标准来考察三根据生物学变异制定的不精密度的标准来考察四根据实验室技能状态制定的标准来考察二、建立分析质量规范 由IFCC/IUPAC/WHO/三机构于1999年在瑞典斯德哥尔摩举办的“建立全球检验医学质量规范的策略会议”上提出的一致性声明（草案），即本次大会达成一致的主要结论是：1评价在特定临床情况下分析性能对临床决定的影响。2评价在一般情况下分析性能对临床决定的影响：（1）基于生物变异分量的数据;(2)基于临床医生观点分析的数据。3团体专家的专业性推荐：（1）来源于国家和国际专家团体的推荐 （2）来源于地区性或个别专家的推荐4性能目标有以下决定：（1） 政府机构（2） 室间质量评价(EQA)计划的组织者。5基于当前技术水平的目标：（1） 由室间质评或能力验证计划数据证实（2） 当前关于方法实施可行发表的文章。