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1、代谢设计育种,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,2,1 代谢设计育种的策划2 育种方案的实施,代谢设计育种,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,3,1.代谢设计育种的策划1.1 目的产物代谢途径的组合（五段式）1.2 中心代谢流上节点的分析1.3 理想载流途径的推定 1.4 五字策略的应用,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,4,1.1 目的产物代谢途径的组合（五段式）,目的产物合成代谢的“五段式”,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,5,1.2 中心代谢流上节点的分析 代谢网络上的交叉点（代谢中间化合物）叫做代谢网络的节点。节点有刚性和挠性之分。挠性节点处的
2、流量分配容易发生改变，任何分支可以得到 100%的流量。刚性或弱刚性节点的流量分配比例不容易发生改变。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,6,S,S,P1,P1,P2,P2,P1 I,P1 I,P2 I,P2 I,P1 A,P2 A,强刚性节点,弱刚性节点,优,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,7,尽管代谢网络包含了大量的节点，但通常只有几个节点直接影响产物的转化率，称为主要节点。对赖氨酸生产来说，有五个分支点处流量的分配率受到培养条件较大的影响，它们是 G-6-P、F-6-P、PEP、PYR 及OAA。在这些分支点中，只有G-6-P 和 PEP/PYR，被认为是有用的主要
3、节点。通过扰动节点处代谢流量的方法可以做出判断。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,8,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,9,网络刚性是自然选择的结果，是细胞经济体系的保障作用的体现。刚性节点是由反馈调节和交叉激活等代谢自动调节机制来支持的，解除调节可望改变节点的性质。然而，代谢自动调节机制不但包括反馈调节和交叉激活。刚性节点的支持背景尚未弄清的时候，只好绕过该刚性节点，先解决其它节点的问题。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,10,根据文献和实验推测。实验包括离线推定和在线推定。,1.3 理想载流途径的推定,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,11,1.
4、4 五字策略的应用,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,12,节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。因此在应用“五字策略”制订育种方案时必须认真分析代谢网络和节点的刚性及其形成的机理，尽量采用协调（如：调节突变株）而不是一刀切（如：营养缺陷型突变株）的手段。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,13,2 育种方案的实施2.1 出发菌种的选定2.2 遗传操作方案的制定2.3 遗传操作方案的实施2.4 变异株培养条件的优化,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,14,调节机制简单：文献 遗传标记可靠：文献，实验 生长情况良好：实验，观察 有目的产物的生产潜力：哲学思辨 可
5、以获得 经费方面可行,2.1 出发菌种的选定,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,15,物理诱变 化学诱变 复合诱变 定向诱变 插入基因拷贝 插入途径基因组,2.2 遗传操作方案的制定,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,16,缺陷型突变株的获得 结构类似物抗性突变株的获得 结构类似物超敏性突变株的获得 分子生物学方法（略）,2.3 遗传操作方案的实施,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,17,营养因子、酶和功能性蛋白质 营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株 酶缺损突变株 输送体系缺损突变株 条件突变株,突变株的获得,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,18,（1）营养
6、因子：氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶（经离心途径合成）。（2）酶：中心代谢途径的酶（特别是与生长密切相关的酶）、向心途径的酶、离心途径的酶。（3）功能性蛋白：调节酶、专一性的输送蛋白、调节蛋白、以及 电子传递链的多肽成员、ATP 酶等。,营养因子、酶和功能性蛋白质,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,19,（1）营养缺陷突变株（2）渗漏营养缺陷突变株,MM,MM+F,CM,营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株检出,无营养缺陷,其他营养缺陷,F营养缺陷,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,20,结构类似物（代谢撷颃物）的选择：一、空间结构类似，二、对微生物有致死性或毒性（抑制生长）；绝大多数
7、情况下，结构类似物可被其“真身”解毒。三、有些抗生素、药物（包括中药）、诱变剂本身就是结构类似物（代谢撷颃物），但需确证。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,21,结构类似物的确定 生长抑制试验和敏感性试验“筛子”的设计 剂量的确定 筛选的具体方法的确定 高产株的检出,结构类似物抗性突变株的获得,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,22,结构类似物的确定及其抗性突变株的检出,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,23,生长抑制试验和敏感性试验,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,24,（1）根据反馈调节机制设计（2）同时要考虑协同调节机制等（3）要考虑实验的成本
8、问题（4）根据问题的轻重缓急设计,“筛子”的设计,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,25,（1）浓度梯度平板筛选法（2）纸片法（3）液体培养浓缩后涂布的方法（4）其他方法,筛选的具体方法的确定,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,26,（1）反馈调节的调节突变株：抗性（2）输送体系突变株：抗性（3）影响与底物的亲和能力的突 变株：超敏性（4）对入围的突变株进行产量形状 的筛选,高产株的检出,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,27,尽量从生物学的角度安排试验 尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条 件不一致带来的系统误差 每批摇瓶（生物）试验都要做对照 注重产量与菌体量之间的
9、的微妙 关系（生物机器的特殊性）,2.4 变异株培养条件的优化,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,28,对于发源于农产加工和农业化学的手工作坊式的发酵生产来说，要摆脱繁重的体力劳动，就必须走工业化的道路。于是，发酵生产首先向化学工业靠拢，通过向化学工程学习，用泵和管道输送替代了肩挑手提的人力搬运，以机器生产代替了手工操作，早已把作坊式的发酵生产成功地推上了工业生产的水平。发酵生产与化学工程的结合促成了发酵生产的第一次飞跃。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,29,生产实践已经证明工业发酵过程是一个随着时间变化的（时变的）、非线性的、多变量输入和输出的动态过程，按照化学工程的
10、模式处理工业发酵的问题，微生物细胞屈居于催化剂的地位，难以发挥其生产潜力。十多年来，我们从研究微生物的生命活动规律入手，把现代生物学关于能量转换的电子流动、物质流动和信息流动这三个基本观点引入了工业发酵，重新审视发酵工程。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,30,用生物学的眼光重新审视发酵工程，确认了发酵工程的生物学属性。从生物科学的高度在发酵工程领域首先提出了微生物细胞机器的新概念和新思路。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,31,（1）现代发酵工程依靠微生物来完成发酵工厂生产线上的不可缺少的加工（或转化）步骤，在这个意义上，微生物细胞就是工业发酵生产线上不可缺少的特殊机
11、器微生物“细胞机器”。因而，没有微生物就没有发酵工程，没有微生物细胞机器就没有现代发酵工厂。微生物是发酵工程的灵魂。,我们认为：,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,32,（2）微生物细胞机器与普通意义上的机器不同，必须在生产线上完成细胞机器的“在线制造”和“生产运行”的双重任务，因而，必须兼顾细胞机器的量和细胞机器的工作效率。,我们认为：,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,33,（3）微生物细胞机器按其自身固有的规律运行，因而，必须深入研究微生物细胞机器的工作原理，应顺自然规律，引导微生物为我们服务。,我们认为：,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,34,（4）发酵工程具有的生物学属性，现代发酵工程必须向生物学靠拢。发酵生产与生物学的结合酝酿着发酵工程的又一次革命性的飞跃。发酵工程将在生物学和化学的支撑下，进入新的发展阶段，成为生物工程的一个重要的组成部分。,我们认为：,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,35,我们认为：,必须全面地、历史地研究微生物的代谢。必须让微生物生理学家、发酵工程专家和自动控制专家三种头脑合而为一，互动地开展研究，才能做出新型发酵的开创新的工作。,2023/4/1,张星元：发酵原理（讲座）,36,尊重自然规律，活用自然规律，为人类造福，为世界消灾。,
