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1、急性心肌梗死的临床生化指标及检测方法,郑欣宁，郑思涵，杨芳芳，李金泽,医学检验3班,概述,一、概述,心血管疾病是危害人类健康及生命的严重疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是主要的心血管疾病，全球每年有1700万人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死。急性心肌梗死既往在欧美常见，美国3584岁人群中年发病率男性为71%，女性为22%，每年约有150万人发生急性心肌梗死，45万人发生再次心肌梗死。在我国，本病虽不如欧美多见，但近10年来，急性心肌梗死的发病率呈明显上升趋势，目前已接近国际平均水平。,AMI
2、是指急性心肌缺血性坏死，大多是在冠脉病变的基础上发生冠脉血供急剧减少或中断，使相应的心肌严重而持久地急性缺血所致。通常原因为在冠脉不稳定斑块破裂、糜烂基础上继发血栓形成导致冠状动脉血管持续、完全闭塞。AMI发病突然，急性期死亡率约为30%。对其早期诊断，以便进行及时有效的治疗，是减低急性心肌梗死的死亡率和合并症、提高患者生存率的关键。,诊断AMI的条件有：临床症状、心电图异常和生化指标等。但大约1/3的AMI病人早期临床症状不典型，约1/2的病人心电图不能出现特征性ST段改变，此时生化指标的改变在AMI诊断和指导治疗中就显得非常重要.目前，研究人员已基本弄清楚急性心肌梗死患者血清中一些生化指标
3、发生的变化及其规律。,二、诊断AMI的常用生化指标,肌酸激酶及其同工酶乳酸脱氢酶及其同工酶肌红蛋白和碳酸酐酶心肌型脂肪酸结合蛋白糖原磷酸化酶BB超敏C-反应蛋白其他,、肌酸激酶及其同工酶,肌酸激酶（CK）AMI患者血液中CK常在发病后46小时开始升高，1824小时达峰值，3天左右降至正常。进一步的研究发现，CK的灵敏度仅为22%，且由于CK并非心肌所特有，在非心脏手术或骨骼肌、平滑肌损害患者血清中CK也会升高，所以其特异性仍较差。,肌酸激酶同工酶（CK-MB）CK-MB在AMI发病46小时开始升高，1224小时达高峰，可为正常的20倍，约2天降至正常，对AMI诊断具有较高的敏感性，其阳性率在9
4、0%以上。在相当长时期内，CK-MB被誉为诊断AMI的“金标准”。但CK-MB并非心脏所特有的酶，正常人骨骼肌中也有少量CK-MB，且CK-MB诊断时间窗口短，其敏感性和特异性都不尽如人意。尽管如此。,、乳酸脱氢酶及其同工酶,乳酸脱氢酶（LDH）LDH在AMI发病后24小时开始升高，34天达高峰，持续12周消失。影响LDH的因素较多，充血性心力衰竭、肿瘤、骨骼肌疾患等均可使LDH升高。所以，通常不用LDH作为AMI早期诊断指标，而适用于诊断病程已超过23天的病例。,乳酸脱氢酶同工酶（LDH1）AMI后LDH1在68小时增高，35天达峰值，持续714天。以LDH1/LDH21和CK-MB15 I
5、U/L作为AMI的诊断标准，其阳性率前者(52.2%)明显高于后者(30.4%)。随发病时间延长，LDH1/LDH2比值逐渐升高，至24小时达高峰，持续2周，该比值的阳性率还在95%以上。因此，该比值测定对心肌梗死的早期及晚期的诊断均有一定价值。,、肌红蛋白和碳酸酐酶,肌红蛋白（Mb）Mb最早可在梗死后1.5小时开始升高，512小时达到高峰，24小时恢复正常。Mb的诊断特异性低，因肌肉损伤、肾功能减退以及长期肌注、开胸手术等因素均可使之升高。Mb对心肌特异性不高，但Mb是心肌缺血损伤后升高最早的指标之一。与CK共同为适合于AMI的早期诊断指标，且Mb阴性有助于排除AMI。另外，由于血中Mb能迅
6、速被肾脏清除，所以测定Mb还有助于观察AMI病程中有无再梗死发生，以及梗死有无扩展。,肌红蛋白/碳酸酐酶比值（Mb/CA III）胸痛发生2小时内，Mb和Mb/CA III显示出相当高的灵敏性，分别为40%和60%，在26小时内，这两项指标的敏感性比CK-MB更高。在骨骼肌损伤时，Mb和Mb/CA III均升高，但Mb/CA III保持恒定，而心肌损伤时，Mb/CA III明显升高。同时测定血清Mb和CA III，用Mb/CA III比值有利于区别Mb是来源于心肌还是骨骼肌。测定Mb/CA III在AMI诊断中具有较高的灵敏性和特异性，是诊断心肌损伤的早期标志物之一。,、心肌型脂肪酸结合蛋白,
7、心肌型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）血清H-FABP在AMI早期(03小时)即可检测到。H-FABP自上世纪90年代起开始作为诊断AMI的早期诊断指标，它对诊断AMI的敏感性、特异性和准确率均较高。但目前临床应用还不广泛，它与肌红蛋白一样，缺少对心脏的特异性。,、糖原磷酸化酶,糖原磷酸化酶BB（GPBB）GPBB主要存在于心肌细胞和脑细胞中，在正常生理条件下，GPBB在心肌细胞中以GPBB-糖原复合物的形式与肌浆网紧密结合。当心肌缺血缺氧时，糖原分解加速消耗，使与之结合的GPBB由结合型变为游离型，心肌细胞中释出来。GPBB被认为是最为敏感的诊断AMI的指标之一，其特异性与CK-MB相似。,、
8、超敏C-反应蛋白,C-反应蛋白（CRP）C-反应蛋白是一种急性时相反应蛋白，对疾病的诊断虽无特异性。但其血浆水平上升是各种原因引起的炎症和组织损伤的灵敏指标，且在很长一段时间可保持稳定。HS-CRP可作为心血管危险事件发生进行的预测指标。HS-CRP水平3-5mg/L可作为心肌梗死危险性分级的较佳临界点。在冠心病患者中HS-CRP升高提示冠状动脉病变可能与炎症反应有关。,、其他,其他的用于判断心肌损伤的生化标志物还有如门冬氨酸氨基移换酶(CAST)、肌球蛋白重链(MHC)和轻链(MLC)、肝细胞生长因子、B型钠尿肽(BNP)、脱氧核糖核酸酶以及-羟丁酸脱氢酶等。但由于其特异性或敏感性原因，使得
9、这些心肌损伤标志物的临床应用受到了一定的限制。,从总的趋势来看，随着医学科学研究的进展，心肌损伤的血液生化标志物已从早先的以酶活性为主的检测（如 AST，LD及其同工酶、CK及其同工酶等）发展到目前的以蛋白质质量浓度为主的检测，包括多种早期标志物和晚期标志物，随着这些新的灵敏、特异的心肌损伤标志物的广泛应用，以酶活性为主的检测项目在诊断心脏疾病时已逐渐少用以至不再应用。另外，多种标志物的联合使用可以使各种标志物互为补充，弥补单一标志物的某些不足。,心肌肌钙蛋白,一、概述,心肌蛋白(Troponin，Tn)是肌肉组织收缩的调节蛋白，与原肌球蛋白(Tropomyosin)和肌动蛋白(Actin)结
10、合构成肌原纤维的细肌丝，参与肌肉的收缩和舒张过程。心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin，cTn)是心肌细胞内结构蛋白，由三种亚基组成，包括Ca2+结合亚基-肌钙蛋白C(TnC)，抑制亚基-肌钙蛋白I(cTnI)和与原肌球蛋白结合亚基-肌钙蛋白T(cTnT)，三种亚基组成复合体，调节肌肉收缩活动。,在心肌细胞受损后，随肌原纤维崩解破坏而不断释放进入血液。其中cTnC不能作为心脏特异性标志物，因为骨骼肌cTnC与心肌cTnC的氨基酸序列是完全相同的。而cTnT与cTnI在心肌与骨骼肌中具有独特的氨基酸排列，所以心肌中cTnT和cTnI具有心肌特异性，其远比CK，CK-MB等酶变化更为敏感
11、，能检出酶学方法检查不出的微小的心肌坏死。肌钙蛋白是目前为止发现的辅助诊断心肌损伤的最佳确定标志物，,2002年中华医学会检验学会在其公布的“心肌损伤标志物的应用准则”中建议:将心肌肌钙蛋白(cTnT或cTnI)取代CK-MB成为检出心肌损伤的金标准。,二、心肌肌钙蛋白T,心肌肌钙蛋白T（cTnT）是20世纪90年代发展起来的一种新的诊断心肌缺血、坏死的高敏感性、高特异性的血清学指标。cTnT参与构成心肌调节蛋白，其结合于心肌细胞收缩器上，分子量为37000 D。AMI后23小时cTnT就升高，24天达到峰值，cTnT活性可较正常上限升高数十至百倍以上，1214天下降至正常。在AMI后，cTn
12、T升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，诊断AMI的绝对敏感窗口在cTnT也较CK、CK-MB宽，其中cTnT为10.5140小时，而CK和CK-MB是931小时。鉴于cTnT浓度升高持续时间长，其对长期间诊断，对回顾性诊断都是非常适宜的指标。,最近研究发现，cTnT在骨骼肌损伤、肺部疾病、肾衰竭时也升高，其心肌特异性较心肌肌钙蛋白I（cTnI）低。,三、心肌肌钙蛋白I,cTnI是心肌细胞所特有的一种收缩蛋白，仅存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上，是一种单链多肤，分子量为22500 D。肌钙蛋白I(cTnI)含有三个亚型:快反应型、慢反应型、心脏特异型。前两者与骨骼肌相关，后者仅存在于心肌中。cTnI
13、与骨骼肌Tn的氨基酸序列显示40%不同源性，且cTnI肤链的N端增加了31个氨基酸，分子量为24。cTnI在胎儿及健康或疾病状态的成人骨骼肌中不表达，因此具有高度心肌特异性，为cTnI作为心肌细胞损伤的特异性标志物奠定了基础。,在人心肌组织内cTnI的含量约为5mg/g湿重组织。生理状态下，cTnI以两种形式存在于心肌细胞内，少量cTnI(3%5%)游离于细胞浆中以游离形式存在，为可溶性，大部分以结构蛋白形式固定于心肌肌纤维上，为不可溶性。正常人血液中cTnI含量一般低于0.3g/L，当心肌细胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流，随着损伤加重，结合部分的
14、cTnI被分解出来，成为游离的cTnI不断释放入血，导致cTnI持续升高。,四、比较cTnI和cTnT的诊断价值,比较cTnI和cTnT作为早期诊断心肌损伤的价值：cTnT在出现骨骼肌损伤、肾衰竭等疾病时也升高，而 cTnI分子量较小，正常血中浓度很低，心肌损伤后能快速释放入血液中，且呈百倍升高，且在血清中持续性存在;因此，cTnI是目前效率最高的诊断AMI标志物。,2001年11月美国心脏病学会和心脏病协会提出测定cTnI作为诊断AMI和急性冠状动脉综合症危险分层的第一位标准。在人类心肌损伤的诊断中，cTnI已经成为“金标准”之一。,心肌肌钙蛋白I的测定方法,一、化学发光免疫分析法,实验原理
15、：化学发光免疫分析法(CLlA)是化学发光法和免疫分析法结合的产物。它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性。CLlA是用化学发光反应的试剂（可以是发光剂或催化剂等）标记抗原或抗体，标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤（如离心分离，洗涤等），然后再加入氧化剂或酶底物，最后以测定发光强度形式测定待测物的含量。,基本类型：化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大类:直接标记化学发光物质的化学发光免疫分析、以酶为标记物的化学发光酶免疫分析和以电化学发光物质为标记物的电化学发光免疫分析。,实验材料：待测血清；ALP-Avidin，Biotin，Sulfo-NHS-
16、Biotin，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液；AMPPD；化学发光检测用微量反应板；多标计数仪等；,生物素-检测抗体(Biotin-IgG2)复合物的制备：清洗平衡浓缩离心管：以PBST清洗浓缩离心管，在其顶部填充PBST，以5000rpm 4离心4 h。浓缩抗体、更换支持缓冲液：加入0.5mg待标记抗体，以5000 rpm离心40 min以浓缩抗体，加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液1.5mL，以5000rpm离心，重复1次，加入HEPES缓冲液0.4mL，振荡混匀。标记生物素：加入0.2 mL Sulfo-NHS-Biotin，震荡混匀，室温反应30min。加入含0.5
17、%叠氮钠的HEPES缓冲液2 mL，以5000 rpm离心5 h，重复4次，最后将沉淀物以HEPES缓冲液重新悬浮至0.5ml，储存于4备用。,实验方法：微量反应板孔内捕获抗体的包被和封闭：96孔化学发光分析用微量反应板孔内分别加入一定量10g/mL的捕获抗体(IgG1)溶液，置于4冰箱中包被过夜;然后以含有0.05%Tween 20的Tris-HCl洗涤液(pH 7.0)洗涤板孔3次，加入含1%BSA的封闭液于4封闭过夜，以Tris-HCl洗涤液洗涤3次，拍干，用保鲜膜包好置于-20冰箱中保存备用。,实验方法：微量反应板孔内的免疫反应：取已包被IgG1并封闭好的微量反应板，于板孔对应位置加入
18、抗原标准或样品50 L/孔，加入含1:2000稀释的Biotin-IgG2和1:2000稀释的ALP-Avidin的混合液50 L/孔，振荡混匀，37 温育60 min。,实验方法：化学发光检测：取出微量反应板，以去离子水清洗板孔6次，拍干残留水，加入1:50稀释的AMPPD发光试剂10/孔，37温育10 min，然后将反应板转移到多标计数仪中读取每孔的发光强度。绘制出标准曲线，根据样品孔的发光强度从标准曲线上求出对应样品中抗原(cTnI)的含量。,方法评价：检测速度快，整个测定周期约75 min，比传统的两步双抗体夹心ELISA法快得多。具有很高的灵敏度，方法检出限为0.02 ng/mL，比
19、传统的两步双抗体夹心ELISA法检测限降低一个数量级以上。检测范围宽(0.0436.2 ng/mL)，比传统的两步双抗体夹心ELISA法提高近两个数量级。,方法评价：结果可靠，与传统ELISA法的测定结果符合性良好。由于具有以上优点，该方法有着广阔的市场推广应用前景。化学发光法安全、灵敏、通用性强，是研究和应用很广泛的方法，但相对ELISA法而言，该方法仪器成本相对较高。,实验原理：先将待测血清与一定量的兔抗cTnI抗体混合、37孵育。然后加入125I标记的cTnI，与待测血清中的cTnI竞争抗cTnI抗体，形成抗原一抗体复合物。该复合物与再次加入的猴抗兔IgG结合形成沉淀。离心除去上清液。测
20、定沉淀物的放射强度，根据标准曲线求得cTnI的浓度。,二、放射免疫法,方法评价：实验中所用的抗体都为多克隆抗体，因而交叉反应多，灵敏度差，测定低限只能达到10g/L，而且检测时间为24-36 h，与骨骼肌的交叉反应率在STriI浓度为20 mg/L时可达25%，且操作复杂，反应时间长，同时，由于存在放射污染的危险，其临床应用受到限制，因此已经基本被其它更安全、简便的方法取代。,实验原理：将待检血清和辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的多抗混合、37孵育。把孵育液加入被cTnI包被的微孔板中。由于包被的cTnI与待检血清中的cTnI竞争多抗，使HRP被间接地
21、固定于微孔板上，通过测定微孔板中HRP的催化活性，与标准曲线对照计算cTnI的浓度。,三、酶联免疫吸附法,方法评价：ELISA法是国内研究最多的测定cTnI的方法，该方法灵敏度适中，使用相对比较简便，仪器价格也不很高，但该方法也存在着许多不足，如测定周期偏长、灵敏度相对较低、需要配备特殊的仪器以及专业的操作人员等。该法最低检出限为4g/L，反应时间长达56 h。由于测定中使用了多抗，交叉反应仍然无法消除，存在较大的局限性。,四、胶体金免疫层析法,实验原理：利用两个cTnI 单克隆抗体的结合来检测cTnI。当血清样本滴到吸收孔内，第一个被胶体金标记的抗体与cTnI 结合形成一个抗体抗原结合体。第
22、二个固定化的cTnI 单抗捕捉到这个结合体，产生一个粉红色的颜色带，相对于无结合体的存在，反应圈内则没有色带。方法评价：该法标本用量少，简便快速，适合于cTnI 的床旁检测。基于该方法开发的检测卡，虽可快速完成检测，但仅能用于cTnI 定性和急性心肌梗死患者的初选，临床应用有一定局限性。,实验原理：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物，在增浊剂的作用下，迅速形成免疫复合物微粒，使反应液出现浊度，待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。该法将cTnI与胶乳颗粒表面的抗体结合，导致相邻的胶乳颗粒彼此交联，进而通过比较反应前后透射光和散射光改变的程度，达到测定目的。方法评价：该法灵敏
23、度可达0.3 ng/mL，线性范围为0 25 ng/mL免疫比浊法相关性好、线性范围宽、精密度高，具有一定的临床应用价值。,五、免疫比浊法,实验原理：金标银染法是以硝酸纤维膜作为基底，结合一步法双单克隆抗体夹心技术、蛋白质芯片技术、纳米金探针技术以及纳米颗粒上的银染放大技术建立的一种检测cTnI 的快速测定法。方法评价：该方法在预先准备好膜基底和免疫金探针的情况下，能在40 min 内报告结果。检测临界值为0.3 ng/mL，线型范围为0.3 42 ng/mL，对肌红蛋白、sTnT、sTnI 的交叉反应非常低，与ELISA 法相比符合率为86%。但该方法仅是对cTnI进行的初步探索，尚不成熟。
24、,六、金标银染法,实验原理：从心肌组织匀浆中分离、提取肌钙蛋白，并采用亲和色谱法和免疫印迹法等建立肌钙蛋白肽质量指纹质谱图谱，然后利用质谱分析仪检测急性心肌梗死患者的血清。结果表明质谱分析法可快速证实待测标本中是否存在肌钙蛋白，并可分析出肌钙蛋白I、T、C 三个亚单位各自所占的比例。方法评价：但其只能定性诊断，不能定量，尚需探索研究。该法可用于早期诊断急性心肌梗死，且通过比较证实飞行质谱法的敏感性和特异性均明显优于cTnI 快速检测法。,七、质谱分析法,实验原理：待分析物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经电子线
25、路(检测放大器)放大并输出。可构建一种表面等离子体子共振传感装置，用于检测cTnI。方法评价：具有一定的临床开发价值。,八、生物传感器,心肌肌钙蛋白I的临床意义,一、AMI的诊断、预后和危险分层,在AMI初期，cTnI的敏感性略逊于CK-MB，但CK-MB的心脏特异性及灵敏度较低而且血清半衰期相对较短。在AMI出现症状后46小时cTnI开始升高，15 24小时达峰值，持续68天。与传统的心肌酶CK，CK-MB，LDH相比，cTnI在诊治AMI方面有较高的敏感度，在发病1272小时内cTnI的敏感度达90%以上，72150小时内为70%;在AMI后4天内cTnI敏感度为93%100%。所以，cT
26、nI不仅适于AMI早期诊断，也适于中、晚期诊断，尤其适用于就诊时间晚，心肌酶已正常的AMI患者。,二、估计心肌梗死面积,AMI后cTnI的释放主要是心肌细胞坏死，结构蛋白分解所致，所以cTnI的释放量与心肌细胞坏死数量即心肌梗死面积可能有着较好的相关关系。用CK-MB计算梗死面积已得到病理和临床证cTnI含量与CK-MB有良好的相关性，说明cTnI含量越高AMI病人的梗死面积越大。研究表明，cTnI含量与AMI病人的梗死面积呈正相关，但与梗死部位无明显相关性。,三、判断溶栓疗效,早期冠状动脉再灌注的指示物CK-MB，Mb，cTnT和cTnI在血栓治疗成功后的早期动力学比较研究表明，四种标志物在
27、溶栓后释放的早期动力学基本相似，但是cTnT和cTnI在90 min的冠状动脉再灌注平均指数显著大于CK-MB和Mb。用cTnI，cTnT，CK和CK-MB作为溶栓疗效判断指标，其敏感度分别为95%，80%，54%和56%，特异度分别为100%，89%，79%和82%，表明cTnI在判断溶栓疗效中具有较高的临床指导价值。,四、监测心脏手术造成的心肌损伤,已有研究表明，cTnI是冠脉成形术后微小心肌损伤非常敏感的标志物，与支架是否置入无关。在cTnI不正常的患者中，有38%的患者在支架置入术后发生分支闭塞。cTnI对心脏手术后早期并发症具有预测作用，心脏手术期间明显的心肌损伤可以使术后并发症发病
28、率增加10倍。对心脏手术患者手术前后检测cTnI平，可及时发现心肌梗死并预测患者转归。冠状动脉搭桥术后心肌梗死的诊断在心脏手术中有重要作用，cTnI对术后微小心肌损伤的预测价值最高。,五、对病毒性心肌炎的诊断,一般应用心肌酶谱检查作为心肌损伤的指标，但其敏感性和特异性较差。cTnI仅在心肌特异表达，而CK-MB，AST，LDH非心肌细胞所特有，可产生假阳性。因而cTnI作为心肌细胞受损的敏感而特异的指标，在心肌炎早期诊断中具有很好的应用价值。造成cTnI升高早期与病毒损害有关，病程后期则与机体的免疫机制有关。,六、其他,烧伤患者心肌损伤诊断骨骼肌损伤的鉴别诊断甲状腺机能减退病人心肌损伤的诊断血液透析、危重及创伤后病人心肌损伤的诊断药物作用观察,问题及展望,cTnI 作为检测心肌损伤高度特异与敏感的指标，已广泛应用于临床诊断、风险分层与疗效观察等方面，且检测方法和技术不断更新，并日趋完善。但其目前仍面临一些问题，主要是检测方法尚未完全标准化以及质控手段的不完善，使不同检测系统的测定结果缺乏可比性。因此，在抗体的制备、参照物和检测试剂等许多方面均需建立统一的标准。随着在这方面研究的进一步深入，以及抗体制备及标记技术的不断进步，cTnI检测会有更广泛的研发及应用前景。,谢谢！,
