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1、抗癌药物敏感实验,一.实验药物储备液的配制一般按试验最高浓度的100倍配制储备液。体外药物敏感性试验所用药物浓度，一般根据血浆高峰浓度的0.10，1，10倍的剂量进行。亦可参考以下公式：试验药物浓度（ug/ml）试验时，一般3-5个对数级浓度,平均体重 60,mg平均体表面积 100,二.受试细胞的准备 根据实验目的选用体外培养的肿瘤细胞系如国际通用的Hela细胞系等，也可用肿瘤患者的新鲜手术标本制成细胞悬液备用。,三.药物疗效的评价1.体外抑瘤试验：合成化合物或植物提取物纯品的半数抑制浓度IC5010ug/ml或植物粗提物的IC5020ug/ml，并且有细胞毒性的剂量依赖关系，其最高抑制效应
2、达80以上；发酵液IC50大于1：100，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。,2.体内抑瘤试验：实体瘤疗效以瘤重抑制百分率表示，即瘤重抑制率（1-试验组瘤重/对照组瘤重）100 中草药抑制率30，合成药40腹水型肿瘤疗效可以生命延长率表示，即生命延长率（试验组存活天数/对照组存活天数-1）100非腹腔给药生命延长率50，腹腔给药生命延长率75,四.药物敏感性实验1.体外药物敏感试验 美蓝法：利用活细胞的脱氢酶提供氢离子，是美蓝还原为甲烯白（无色）。细胞死亡后脱氢酶失活无法使美蓝还原，故染成蓝色。检验用药后死细胞数反映药物抑瘤作用。假阳性率较高。,2.染料排斥实验法：根据活细胞在低浓度染液不着色
3、特点，一般用0.2台盼蓝或0.1伊红试验。药物导致细胞死亡时，细胞膜通透性增加，染料易透过细胞膜。加药后计算阳性细胞数以示药效。由于濒临死亡的细胞不易着色，故假阴性较高。,3.生长曲线测定法1）药物对细胞的杀伤率 将对照组及加药组生长曲线的线性部分延伸至Y轴，可分别得到截距NO及NO。代表接种后具有增殖力的细胞数。药物对增殖细胞的杀伤率（NO NO）/NO100,2）药物对倍增时间（TD)的影响 TD=t 2 Nt N0 t代表培养时间，N0 和Nt分别代表接种后及培养1小时后的细胞数。如倍增时间延长则表明药物使细胞增殖能力减弱。,3）药物对细胞生长饱和密度（Ns）的影响 取出在生长稳定期的培
4、养细胞，计数单位面积或体积的细胞均数，即细胞生长饱和密度。该值减小也表示细胞增殖活性减弱。4）放射性同位素掺入核苷酸前体物试验法 常用3H-TDR或3H-UDR掺入DNA或RNA合成期的细胞，用液体闪烁计数仪测知标记的DNA或RNA的含量，从而了解药物对肿瘤细胞DNA或RNA合成的抑制效应。,5）四唑盐（MTT）比色法 Mosmann（1983）首先报道此法。简便快速，便于大规模进行药敏试验，误差小且精确，无放射性污染。广泛应用于临床。接种细胞 培养细胞 3-5天后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，孵育4h终止培养吸弃上清 每孔加150ulDMSO振荡10min 比色：选择490nm
5、波长酶联免疫检测仪测定光吸收值并绘制吸收曲线,6）三磷酸腺苷生物发光法（ATPbioluminesence assay）是一种敏感可靠能测定各种细胞活力的方法。7）集落形成试验法8）3H亮氨酸掺入细胞蛋白质试验法9）抗癌药物的效能比测定法,2.体内抗癌药物敏感试验1）裸鼠移植瘤试验 1973年丹麦的C.W.Friis在BALB/cA近交系小鼠中发现自发性突变的无毛小鼠，该突变小鼠胸腺发育不良，免疫T细胞缺失，而培育成了BALB/cA-nu。之后引至日本实验动物中央研究所，1989年自日本实验动物中央研究所引入到中科院上海实验动物中心。,裸鼠特点:先天性胸腺缺损胸腺依赖性免疫功能缺乏，T细胞功能
6、接近于零，但B细胞功能基本正常异种移植时无排斥反应 故可以进行人体 肿瘤异种移植。,2）小鼠肾包膜下肿瘤移植试验 1978年Bogden首先报道了将人肿瘤组织移植于裸鼠肾包膜下的六天药敏试验方法。,细胞的克隆化技术,细胞克隆（cell cloning）：又称单细胞克隆，即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。原代培养细胞和有限细胞洗（二倍体细胞）比较困难，无限细胞系，转化细胞系和肿瘤细胞则较容易。,一.克隆培养（clone culture）技术1.稀释铺板法 消化法制备低密度细胞悬液（12个/ml）0.5ml/孔接种于培养板 612h后观察标记含单个细胞
7、的孔 待孔内细胞增至500-600个时进行分离培养 分离扩大培养,2.饲养层克隆法 饲养细胞（feeder cell）：为了使刚刚克隆化的极少量细胞生长繁殖，在培养皿中加入能贴壁生长的其它细胞。常用细胞：成纤维细胞，胸腺细胞，巨噬细胞。饲养细胞制备繁琐，应用较少。,3.胶原模板或血纤维蛋白膜层板克隆法 用胶原膜层或血纤维膜层取代饲养细胞，帮助单个细胞和密度极低的分散细胞黏附和贴壁，存活并繁殖。4.琼脂克隆法 琼脂是生长基质层帮助细胞贴附生长。适于病毒转化细胞和恶性转化细胞。5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化,二.影响克隆形成率的因素 接种众多单个分散细胞，经培养后能够增生形成克隆的百分数称克隆率或接种率（cloning efficiency）。影响因素：接种细胞密度：细胞悬液的细胞密度越大,克隆形成率越低培养基：Ham F12K培养液是最好的克隆化培养液。,血清：胎牛血清好于小牛血清。饲养细胞：有利于克隆的形成。激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，表皮生长因子等可以促进不同细胞生长。CO2:对绝大多数细胞克隆形成率有提高作用，常用5浓度。适应性生长基质：不同细胞采用不同生长基质。,三.克隆的分离1.克隆化环分离法2.射线照射分离法3.半固体培养基悬浮培养细胞克隆分离法,
