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1、第四章 DNA的生物合成,DNA复制的特点,1、半保留复制,2、复制的起始，方向与速度,3、半不连续复制,4、DNA聚合酶催化，多种蛋白质参与,一、半保留复制 P514,半保留复制DNA在复制时，以亲代DNA的每一条链为模板，按碱基互补原则，分别合成新链，每个子代DNA中都含有一条亲代DNA链。,三种可能的DNA复制机制,实验证据Meselson和Stahl实验,亲代DNA 15N标记 新合成DNA 14N标记,独立完成复制的功能单位称为复制子(replicon)。DNA复制的起始，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，RNA引物的序列与模板DNA的碱基顺序相
2、配对。DNA复制大多为双向等速复制。,二、复制的起始，方向与速度,DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始位点(origin)。复制起始位点序列特征：富含AT，具有复制起始蛋白识别的区域。,细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列,原核与真核复制子,原核复制子,真核复制子,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),DNA的双向复制示意图,三、半不连续复制,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的前进方向必须是35。复制时，1条链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，可连
3、续合成，称为先导链(leading strand)，另一条链的前进方向与复制叉打开方向相反，不能连续复制，称为滞后链(lagging strand)。所以DNA的复制是半不连续复制。滞后链的复制过程:先以片段的形式合成冈崎片段，多个冈崎片段再连接成完整的链。,DNA的半不连续复制,活性：1.53 的聚合酶活性聚合反应：底物dNTP 2.核酸外切酶活性,（一）、DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA pol）,四、DNA聚合酶催化，多种蛋白质参与,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,切除突变的 DNA片段与冈崎片段中的引物。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,DNA聚合酶的核酸外
4、切酶活性,在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol）。参与DNA复制的主要是pol 和pol。,DNA聚合酶的种类,原核生物中的三种DNA聚合酶,pol 可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段保留了两种酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被称为Klenow 片段。,Klenow片段的分子结构,真核生物的DNA聚合酶,单链DNA结合蛋白是一些能够与单链DNA结合的蛋白质，以四聚体形式与单链DNA结合，起保持单链的存在的作用。,（二）、单链DNA结合蛋白（SSB蛋白）,解链酶，又称解旋酶，解螺旋酶，是用于解开DNA
5、双链的酶蛋白。延模板链移动，每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。,（三）、解链酶（helicase）,拓扑异构酶的作用特点能水解连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,能够松解DNA超螺旋结构的酶。,（四）、DNA拓扑异构酶(topoisomerase),DNA拓扑异构酶的作用机制,DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。滞后链冈崎片段的连接。,（五）、DNA连接酶,第三节 DNA的复制的过程,一、复制的起始,二、复制的延长,三、复制的终止,四、环状DNA的复制,五、端粒与端粒酶,DNA复制的起始由两步构成。
6、1解旋解链，形成复制叉：A.DnaA蛋白识别复制起始序列，由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA双螺旋结构解开，形成两条单链DNA。B.单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,一、复制的起始,2引发体组装和引物合成：A.由解链酶(DnaB蛋白)等6个蛋白装配成引发前体，并与引发酶(DnaG蛋白)形成引发体；B.在引发酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段作为引物，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引发体的组装形成,二、复制的延长,复制的延长指在DNA聚合酶催化
7、下，以亲代DNA链为模板，从53方向聚合形成子代DNA链。其化学本质是将dNMP逐个通过磷酸二酯键添加到子链3 末端羟基上。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,DNA延伸过程简图,三、复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,（一）去除引物，填补缺口：,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,（二）连接冈崎片段：,随从链上不连续性片段的连接
8、,四、环状DNA的复制过程,环状DNA复制有多种形式，比较常见的为复制、滚环复制和D环复制。复制是通过Colin实验发现的。其特点是：复制起始后双向复制，得到2个环状子代DNA分子。,Colin实验过程,滚环复制特点（1）不需RNA引物（2）只有一个复制叉，单向复制（3）形成多联体（concatemer）（4）一次起始可以合成多个子代DNA，效率高采用滚环复制的DNA，大多为噬菌体DNA。,滚环复制的过程,D环复制(D-loop replication)：是线粒体DNA 的复制形式，其特点是：单向复制，两条链合成不对称，形成一个双链环状分子与一个部分单链环。,D环复制的过程,链状DNA的末端问
9、题：线状DNA，复制完成切去引物后，会产生5末端缺失。,五、端粒与端粒酶,5,3,5,3,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。,5,3,3,5,5,3,3,5,端粒酶(telomerase),端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA（端粒酶RNA）为模板，通过反转录酶（端粒酶反转录酶）催化反转录反应对末端DNA链进行延长。,端粒酶的分子结构,端粒酶的爬行模型（动画演示）,反转录酶和反转录现象的发现理论意义：
10、RNA兼有遗传信息传代与表达功能。应用意义：可人工合成cDNA及构建cDNA文库。,反转录酶与反转录现象,Temin,Baltimore,反转录过程,第三节 DNA的突变,一、基因突变的特征与意义,二、基因突变的类别,三、引起基因突变的原因,一、基因突变的特征与意义,可以通过复制而遗传的永久性DNA结构的改变，称为基因突变（Gene Mutation）。其特征是：1.基因突变在生物界中是普遍存在的；2.基因突变发生频率很低；3.基因突变是随机发生的；4.基因突变是不定向的，有可逆性。,基因突变的后果与意义1.突变导致表型的改变，严重的导致死亡（致死型突变，条件致死型突变）；2.突变是很多疾病的
11、发病基础；3.大多数基因突变不产生个体的变化；4.突变是进化的分子基础。,二、基因突变的类型,DNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation)。多个碱基的改变称多点突变，也称复突变（multiple mutation),点突变的类型,发生在同型碱基之间。,转换,1.碱基替换:一个碱基替换为另一个碱基,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,血红蛋白-亚基的点突变,2.碱基缺失：一个碱基从DNA大分子上消失。,3.碱基插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。
12、,缺失或插入都可导致框移突变。,缺失引起的框移突变,复突变的类型,插入,增加一段顺序。,缺失,减少一段顺序。,复突变,倒位,一段碱基顺序发生颠倒。,易,位,一段碱基顺序的位置发生改变。,重排,一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换。,重排 DNA分子内较大片段的交换。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,从对遗传信息的改变上定义，点突变还可分为三类：,1.自发因素：(1).自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。(2).自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。(3).复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,三、引起突
13、变的因素,由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。如：X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,2.物理因素：,嘧啶二聚体的形成,(1).脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。,3.化学因素：,(2).碱基类似物：如5溴尿嘧啶等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。,2-氨基嘌呤,5-溴尿嘧啶,5-BrU,:G,:A,ATGC 转变,烯醇式渗入为 GCAT 转变,(3).烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基,如
14、氮芥类，使鸟嘌呤甲级化，造成碱基缺失。(4).DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。(5).断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,4.生物因素：,如病毒感染，转座子转位，质粒转化等因素都可能引起DNA序列发生改变。,第四节 DNA的修复,一、直接修复,二、错配修复,三、切除修复,五、SOS修复,四、重组修复,DNA损伤修复(repair)：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。,直接修复错配修复切除修复重组修复SOS修复,修复的主要类型：,1光复活：（light repairing）：这是一种广泛存在的修复作用
15、。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物在300600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复光复活酶从DNA上解离。,一、直接修复,2.烷基转移修复,通过甲基转移酶，对引起甲基化的DNA损伤进行修复。,对DNA复制忠实性有很大贡献，依据“保存母链”原则，修复新合成子链中的错配。依据母链DNA中GATC序列中腺苷酸N6位的甲基化分辨母链与子链。Cell杂志 2005年封面文章报道体外重建错配修复系统。,二、错配修复,错配修复机制,参与蛋白与功能：MutS：识别突变位点MutS-MutL：
16、寻找甲基化位点MutH：切断未甲基化链核酸外切酶：切除突变序列DNA pol III：修补缺口SSB蛋白，连接酶等,三、切除修复,所谓切除修复，即是在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。,针对受损碱基，常常由于自发突变造成。步骤：1，糖苷水解酶特异性切除受损核苷酸N-糖苷键，在DNA链上形成去碱基位点（AP位点）。2，AP核酸内切酶切断磷酸酯键，并切去包括AP核酸在内的一小段DNA。3，DNA pol I填补缺口，DNA连接酶连接,1、切除修复,针对核苷酸受损伤后无法形成氢键情况。切除修复机制的基本过程是
17、将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。,2、核苷酸切除修复,参与蛋白：UvrA,B,C geneDNA切割酶DNA聚合酶：DNA pol I（原核），DNA pol（真核）DNA连接酶,核苷酸切除修复,四、重组修复(recombination repairing)：这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。主要依赖DNA pol II和修饰后的DNA pol III进行DNA复制。对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,五、SOS修复,
