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1、生化检测常识,目录,第一章 生化检测基本常识1.1标本的获得第二章 常规生化检测项目简介2.1生化项目的临床意义第三章 生化仪参数测量原理3.1自动生化仪的分类3.2分立式生化仪结构3.3生化检验的原理和方法3.4生化分析仪测定方法的分类及应用度的计算3.5.测定值计算方程3.6 定标参数和浓度的计算第四章 几个重要概念51试剂空白52样本空白53水空白54样本55质控物质56底物控制,生化检测基本常识,生化检测是医院检验科（或化验室）常用的检测手段，通常以人的血清为标本，通过测量血清中各生化成份的含量，为临床诊断提供依据。,1.1标本的获得,一般要求病人空腹时采静脉血（全血）。全血经过离心机
2、离心，分层为血清和血细胞，正常情况下，上层颜色浅且透明（血清），下层颜色深且不透明（血细胞）。有的血清较为特殊，或分层不明显（融血），或血清不透明（脂血，呈牛奶状）。,第二章 常规生化检测项目简介,2.1生化项目的临床意义,丙氨酸氨基转移酶（ALT）：又称为谷丙转氨酶（GPT）是衡量肝功能的重要指标，许多低端医疗机构在做体检时仅测此一项生化项目。正常人一般在40U/L以内。干粉试剂复溶后为单试剂，液体试剂一般为双试剂，应用动力学法可计算结果。,蛋白,蛋白：通常测白蛋白（ALB）和总蛋白（TP），终点法。一般用单试剂，有的TP试剂为双试剂，可用两点终点法测。蛋白质是血清的主要成份，大部份由肝细胞
3、合成。通过蛋白的测定可以协助某些疾病的诊断。,血糖,血糖：血液中的葡萄糖简称血糖（GLU）。常用于糖尿病的诊断。正常人空腹血糖一般为3.96.1mmol/L。市场上单、双试剂的商品化试剂盒都有，可用终点法（单试剂）或两点终点法测量（双试剂）。,门冬氨酸氨基转移酶（AST）,门冬氨酸氨基转移酶（AST）：又称为谷草转氨酶（GOT），主要用于心肌和肝胆疾病及骨骼肌病的诊断。是肝功能测试的常用指标之一。正常人一般在40U/L以内。同ALT一样，无论单、双试剂，用动力学法可计算结果。,碱性磷酸酶（ALP）,碱性磷酸酶（ALP）：主要用于肝胆疾病及骨骼病的诊断。是肝功能测试的常用指标之一。正常人一般在2
4、40U/L以内。用动力学法计算结果。,-谷氨酰转移酶（GGT）,-谷氨酰转移酶（GGT）：主要用于肝胆疾病诊断。是肝功能测试的常用指标之一。正常人一般在50U/L以内。用动力学法计算结果。,胆红素（BiL）,胆红素（BiL）：胆红素的测定，能准确反映黄疸的程度，判断黄疸的类型。一般测量总胆红素（TBil）和直接胆红素（DBil）。,甘油三酯（TG,甘油三酯（TG）：其含量测定是血脂分析的重要内容之一。,总胆固醇（CHOL）,总胆固醇（CHOL）：是游离胆固醇和胆固醇酯的总称，其测定对高脂蛋白血症和冠心病的诊断及发病机理的研究有一定意义。,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）,高密度脂蛋白胆固醇（H
5、DL-C）：主要在肝脏中合成，是血清中颗粒数最多的脂蛋白。其含量是冠心病诊断的重要依据之一。,肌酐（CREA）,肌酐（CREA）：是肌酸代谢的最终产物，由肾脏排出。是肾功能的重要指标之一。,尿素（Urea）,尿素（Urea）：是蛋白质分解代谢的终产物。血尿素测定是肾功能的最敏感指标。,载脂蛋白A1(APOA1):,载脂蛋白A1(APOA1):是高密度脂蛋白的主要组成成分，临床上主要用于脑血管病风险度的估计。,载脂蛋白B(APOB):,载脂蛋白B(APOB):是低密度脂蛋白的主要组成成分，临床上主要用于冠心病的风险度的估计。,肌酸激酶（CK）,肌酸激酶（CK）：肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉
6、以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。可用于早期诊断急性心肌梗，常见肌病(如进行性肌营养不良发作期、病毒性心肌炎、多发性肌炎、挤压综合征等严重肌肉损伤)及脑血管疾病的诊断。,-羟丁酸脱氢酶（HBDH）,-羟丁酸脱氢酶（HBDH）：与肌酸激酶相同，用于诊断心肌梗死。-淀粉酶（AMY）：在临床应用方面，-淀粉酶活力升高与急性胰腺炎、胰腺管道阻塞、腹内疾病、流行性腮腺炎及细菌性腮腺炎。,钙、氯、铁、钾、钠、镁、磷：这7项都属于离子组合，用于诊断人体中离子的含量。,常用检测项目表,序号项目名称缩写组合参考值白蛋白：ALB，肝功能3555g/L
7、 总蛋白：TP，6080g/L碱性磷酸酶：ALP，15112U/L 门冬氨酸氨基转移酶：AST（GOT），837U/L丙氨酸氨基转移酶：ALT（GPT），065U/L-谷氨酰转移酶：GGT，050U/L直接胆红素：DB，06umol/L 总胆红素：TB，018umol/L肌酐：CREA 肾功能：53115mol/L尿酸：UA，210430umol/L 尿素：UREA，2.56.4mmol/L,胆固醇：CHOL 血脂：3.66.5mmol/L甘油三酯：TG，0.451.81mmol/L 高密度脂蛋白：HDL，0.91.68mmol/L低密度脂蛋白：LDL，2.73.1mmol/L 载脂蛋白：A1
8、APOA，11.01.6g/L载脂蛋白：BAPOB，0.61.1g/L 脂蛋白：Lp（a），030mg/dL肌酸激酶：CK，心肌酶类21190U/L,肌酸激酶同工酶：CK-MB，025U/L-羟丁酸脱氢酶：HBDH，70180U/L 乳酸脱氢酶：LDH，114240U/L钙：Ca离子，2.02.6mmol/L 氯：Cl，95105mmol/L铁：Fe，930mol/L 钾：K，3.55.5mmol/L 镁：Mg，0.61.1mmol/L 钠；Na，135145mmol/L磷；P，0.81.6mmol/L-淀粉酶：AMY，其它100220U/L葡萄糖：GLU，3.95.8mmol/L,生化仪参数
9、测量原理,3.1自动生化仪的分类,3.1.1连续流动式自动化分析仪,连续流动式自动化分析仪也叫管道式分析仪，其特点是测定项目相同的各待测样本与试剂混合后的化学反应，是在同一管道中经流动过程完成的。这类仪器一般可分为空气分段系统式和非分段系统式。所谓空气分段系统是指在吸入管道的每一个样品、试剂以及混合后的反应液之间，均由一小段空气间隔开；而非分段系统是靠试剂空白或缓冲液来间隔每个样品的反应液。在管道式分析仪中，以空气分段系统式最多，且较典型，整套仪器是由样品盘、比例泵、混合管、透析器、恒温器、比色计和记录器几个部件所组成。管道内的圆圈表示气泡，气泡可将样品及试剂分隔为许多液柱，并起一定的搅拌作用
10、。但气泡影响比色，必须在比色前除去。将几个单通道管道式分析仪结合起来，对一个样品同时测定几个项目。著名的有12通道分析仪，命名为顺序多项自动分析仪（sequential multiple auto analyzer）简称SMA12/60。同时发展为SMAC，C为计算机（computer）的缩写。这类大型分析仪至今仍有使用者。它对每个样品可同时分析12个项目，每小时可分析60个样品。后来发现不加入空气泡，更有利于结果的检测，发展为流动注射分析法（flow injection analysis）。试剂的流动仍用比例泵驱动，样品用转动阀加入液流，反应后比色检测。,3.1.2离心式生化分析仪,离心式分
11、析仪是1969年以后发展起来的一种分析仪，由Anderson设计，其特点是化学反应器装在离心机的转子位置，该圆形反应器称为转头，先将样品和试剂分别置与转头内，当离心机开动后，圆盘内的样品和试剂受离心力的作用而相互混合发生反应，最后流入圆盘外圈的比色槽内，通过比色计进行检测。离心式分析仪主要由两部分组成，一为加样部分，二为分析部分。加样部分包括样品盘、试剂盘、吸样臂（或管）、试剂臂（加液器）和电子控制部分（键盘和显示器等）。加样时转头置于加样部分。加样完毕后将转头移至离心机上。分析部分，除安装转头的离心机外，还有温控和光学检测系统，并有微机信息处理和显示系统。,13分立式生化分析仪,所谓分立式，
12、是指按手工操作的方式编排程序，并以有节奏的机械操作代替手工，各环节用传送带连接起来，按顺序依次操作。分立式分析仪与管道式分析仪在结构上的主要区别为：前者各个样品和试剂在各自的试管中起反应，而后者是在同一管道中起反应；前者采用由采样器和加液器组成的稀释器来取样和加试剂，而不用比例泵；前者一般没有透析器，如要除蛋白质等干扰，需另行处理。恒温器必须能容纳需保温的试管和试管架，所以比管道式分析仪的体积要大。除此以外，其它部件与管道式的基本相似。分立式分析仪的基本结构如下图所示。Depout公司还推出一种袋式分析仪，即试管变为塑料袋，反应在袋内进行，也以袋作比色杯。这种袋只能一次性使用。,3.1.3干片
13、式分析仪,干片式分析仪是80年代问世的。首先Eastman kodak公司以其精湛的化学工艺造出了测定血清中血糖、尿素、蛋白质、胆固醇等的干式试剂片。当加上定量的血清后，在干片的前面产生颜色反应，用反射光度计检测即可进行定量。这类方法完全革除了液体试剂，故称干化学法。Boehringer Mannheim公司推出了用全血的干征试剂。即将血细胞排除于滤膜之外，而血浆与试剂发生反应后显色检测。,3.1.4模块式自动化系列,7600系列全自动生化分析仪是日立公司于1998年开发出来的系列分析仪。它是由各种不同功能的模块组合而成，功能模块包括有样本投入部、电解质测定的ISE模块、常规实验项目测定的D模
14、块、特殊实验项目测定的P模块、复查样本缓冲部和样本收纳部。根据D模块和P模块数目组合成不同型号的分析仪。模块组合式实验室自动化系统包括：样品前处理系统，样品输送系统和样品后处理系统（生化分析，电解质分析，血液分析等）。样品前处理系统由能独立工作，不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。由样品投入部，离心分离部，开栓部，在线分注部，非在线分注部，贴条码部，盖栓部，样品分注收存部，标本接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的一部分，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。后处理系统有电解质分析系统，生化分析系统以及血液分析系统等。,16全实验室自动化分析系统
15、,从检验标本处理开始，即标本的识别、传输、处理（分离血清等）、分注、分类（按项目分类）、检测和收费的自动化流水作业，到分析后自动储存标本，检验结果的自动分析、报告与传送，自动提示异常值或危险值，申请检验医师随时查询检验结果的全过程实现自动化、网络化。,3.2分立式生化仪结构,全自动生化分析仪一般由以下部分构成：探针系统、搅拌和冲洗系统、恒温系统、反应盘、光路系统构成。,21探针系统,液面检测技术：通过检测阻抗或电容、电流的变化，感知到空气和液面，可保证探针的感应装置至液面时会自动停止下降，即可增加速度也可减少污染，防止堵塞。,22搅拌和冲洗系统,搅拌系统是让样品和试剂混合后迅速分布均匀，保障测
16、试正常进行。常用的搅拌方法为冲入空气、搅拌、振荡等，但是都容易产生气泡和外溢等问题。目前最好的方法是螺旋式搅拌棒附着特富龙涂层，一方面减少气泡，另一方面减少携带和污染。清洗系统一般包括试剂针的内外臂清洗、样本针的内外臂清洗、比色杯的清洗。,23恒温系统,全自动生化仪一般都设有30和37度两种温度。目前常见的有水浴、空气浴，最新的是恒温液循环加温方式。水浴的优点是温度均匀、稳定；缺点是升温缓慢，开机预热时间长，因水质化（微生物、矿物质沉积）影响测定，因此要定期换水和比色杯。空气浴的优点是升温迅速，无需保养；缺点是温度易受外界环境影响。恒温液循环加温集干式空气浴和水浴的优点，即有水浴温度稳定、均匀
17、的优点，又有空气浴升温迅速、无需维护保养的优点。,24反应盘,现在大多数采用硬质玻璃比色杯（石英杯），其透光性好，易清洁，不易磨损。,25光路系统,光源：光源分为卤素灯和高压闪烁氙灯。相对而言卤素灯寿命长，价格低，是大部分生化仪的首先。,3.3生化检验的原理和方法,临床生化检验，主要在技术方面的应用方面上探讨生化检验新技术以及新的标记物的选择和评价，用于帮助诊断，又称“诊断生化”。主要应用于下列技术：光谱技术、电化学分析技术、层析技术、电泳技术、离心技术、抗原抗体特异性反应和标记技术、核酸扩增、杂交及序列分析技术等，其中生化分析仪主要运用了光谱技术中的吸收光谱法和比浊法。,分别介绍如下,31吸
18、收光谱法,311光谱范围和电子跃迁,波长从200nm400nm的电磁辐射，称为紫外光，波长从400nm760nm的电磁辐射，称为可见光。,312吸收曲线,以波长（）为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘制出的一条曲线称为吸收曲线。在一段波长范围内，有最大吸收波长max和最小吸收波长min在最大吸收波长处测定可获得最大的测定灵敏度。,313吸光度的定义,一束强度为IO的平行单色光通过一个含有浓度为C的吸光物质、厚度为L的吸收池时，如上图，一些光子被吸收，光强从IO衰减为It，则该溶液的吸光度A等于：,314Lamber-Beer定律,A=CL其中为吸光系数，有两种表示方法摩尔吸光系数和比吸光系数，摩尔吸
19、光系数的意义为1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时的吸光度，比吸光系数的意义为浓度为1%（w/u）的溶液在厚度为1cm时的吸光度；C为溶液的浓度；L为吸收池的厚度（单位为cm，亦称光径）。Lamber-Beer定律的意义为：某溶液的吸光度等于该物质的吸光系数、浓度C和光径L（cm）的乘积，当光径不变时，浓度和吸光度成正比，这是生化分析仪利用吸收光谱法进行定量测定的基础，见下图：Lamber-Beer定律成立的前提条件是：（1）被吸收光为单色平行光，（2）待测定溶液为稀溶液。除特种蛋白外的大部分临床生化项目，配以相应的试剂，均可利用吸收光谱法在生化分析仪上进行测定。如：酶类：包括ALT、AST、AL
20、P、ACP、r-GT、a-HBDH、LDH、CK、CK-MB、a-AMY、等。底物/代谢产物类：包括TG、TC、HDL-C、LDL-C、UA、UREA、Cr、Glu、TP、Alb、T-Bil、D-Bil、NH4+、CO2等。无机离子类：包括Ca、P、Mg、Cl等。,32比浊法,321比浊法分两类：透射比浊法和散射比浊法。,带有小粒的悬浮液和胶体溶液都具有向四面八方散射入射光的性质，当一束平行光通过含有悬浮质点的悬浮液或胶体溶液时，同时受到散射和吸收两个因素的影响，使光的强度减弱。在光源的光路方向上测量透射光（实际上还包括散射光）强度与入射光强度比值，并通过该比值测定出悬浮液或胶体溶液中质点的溶
21、度，称为投射比浊法；在光路的其他方向上测量散射光强度，从而测定出悬浮液或胶体溶液中质点的浓度，称为散射比浊法。,322测定原理,透射比浊法,颗粒大小与光源波长接近，一束强度为I0的平行单色光通过一个含有悬浮质点（颗粒大小与光源波长接近）的悬浮液或胶体溶液时，如上图，其透射光强度I可用下式表示：I=IOe-L式中,L为悬浮液或胶体溶液在光前进方向上的长度，为浊度系数，与悬浮质点的浓度C成线性关系。令=2.3KC，则：该式与Lamber-Beer 颗粒大小远小于光源波长定律相似，这是生化分析仪利用投射比浊法进行定量测定的基础，该法可以与吸收光谱法共用一个检测器，所以生化分析仪，不需增加任何部件，均
22、可利用此法进行测定。大部分特种蛋白，如载脂蛋白类（apoAI,apoB等）、补体类（C3，C4等）免疫球蛋白类（IgG,IgM等）等，配以相应的试剂，可利用此法在生化分析仪上进行测定。,散射比浊法,一束强度为IO平行单色光通过一个含有悬浮质点（颗粒大小远小于光源波长）的悬浮液或胶体溶液时，如上图，与入射光垂直方向上，其散射光强度I可用下式表示：式中，n1,n2分别表示质点与介质的折射率，V表示单位体积内的质点数，r表示质点半径。可见散射光强度与悬浮质点的浓度成正比，这是利用散射比浊法进行定量测定的基础，因另需在光路垂直方向上增加一检测器，目前只有极少数生化分析仪可利用散射比浊法进行定量测定，而
23、几乎所有的特种蛋白分析仪、免疫分析仪等都能利用散射比浊法进行定量测定。,323方法学分析,（1）散射比浊法与透射比浊法：散射比浊法灵敏度高，线性范围宽，但干扰因素多。（2）比浊法与吸收光谱法：比浊法特异性差，灵敏度低。,3.4生化分析仪测定方法的分类及应用度的计算,4.4.1终点法,4.4.1概述,指经过一段时间（一般为10分钟左右）的反应，整个反应达到平衡，由于反应的平衡常数很大，可认为所有的被测定物已转变为产物，反应液的吸光度不在增加（或降低），吸光度的增加（或降低）程度与被测定物的浓度成正比。如下图：如图所示：t1时刻加入试剂（体积为V），t2时刻加入样本（体积为S），然后搅拌并反应，之
24、后测量反应液的吸光度，在t3时刻反应达到终点。T2 t3为测定时间。,442反应度R（Response）的计算,结果的计算包括三个部分：反应度R（Response）的计算、定标参数的计算和浓度（或活性）的计算。这里仅介绍R的计算，定标参数的计算和浓度（或活性）的计算在后面专门讨论。1）单试剂单波长终点法反应度R=t3时刻吸光度-t2前一时刻吸光度（体积校正因子)或R=t3时刻吸光度-单试剂空白吸光度。2）双试剂单波长终点法t1时刻加入第一试剂（体积为V1），t2时刻加入样本（体积为S），之后搅拌，t3时刻加入第二试剂（体积为V2）并立即搅拌，t4时刻反应打到终点。t3-t2为孵育时间，t4-t
25、3为测定时间。反应度R=t4时刻吸光度-双试剂空白吸光度,4.4.2一级动力学,4.4.2概述,一级动力学是指在被测物参与反应的条件下，在一定的反应时间内，反应速度与反应物浓度的一次方成正比，由于反应物在不断的消耗，因此整个反应速度在不断的减小，表现为吸光度的增加（或降低）速度越来越小，由于这类反应达到平衡的时间很长，且平衡常数不算很大，必需在特定时间段内进行监测，该段时间内吸光度的增加（或）降低与被测定物的浓度成正比，见下图。一级动力学法又被称为初速率法、固定时间法、二点动力学等。如图所示：t1时刻加入试剂（体积为V），之后测量试剂空白的吸光度，t2时刻加入样本（体积为S），t3时刻反应稳定
26、，t4时刻停止对反应进行监测；t2-t3为延迟时间，t3-t4为测定时间。,4.2.2反应度R的计算（单、双试剂相同）,反应度R=t4时刻吸光度t3时刻吸光度,4.4.3零级动力学法,4.4.31概述,指反应速度与被测定物浓度的零次方成正比，也就是与被测定物浓度无关，因此，在整个反应过程中，反应物可以匀速地生成某个产物，导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加，减小或增加的速度（A/min）与被测物的活性或浓度成正比。零级动力学法即通常所说的动力学法，也被称为连续监测法，主要用于酶活性的测定。实际上，由于底物浓度不可能足够大，随着反应的进行，底物消耗到一定的程度后，反应速度不再与酶活性
27、成正比，因此，零级动力学法是针对于特定时间段而言的，各试剂商对这段时间有严格规定，见下图中的t3-tn:t1时刻加入试剂（体积为V），t2时刻加如样本（体积为S），t3时刻反应稳定，tn时刻停止对反应进行监测；t3到tn之间的时间内，吸光度匀速变化，变化的速率和反应物的浓度成线性关系。t3-t2为延迟时间，tn-t3为测定时间。,432反应度R的计算（单、双试剂相同）,其中n=t3到tn间的数据个数Ti=时间Ai=某一时间的吸光度,第四章 几个重要概念,51试剂空白,由于生化测试测量的均为相对吸光度，所以从理论上说，所有终点法的测试都需要把试剂本身的吸光度扣除。试剂本身的吸光度就是试剂空白。测
28、量方法是按照正常测试的试剂和样本量，把样本换成蒸馏水来测量。,52样本空白,由于溶血、脂血、黄疸等情况，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响。所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白，可以去处这方面的影响。测量方法是按照正常测试的试剂和样本量，把试剂换成蒸馏水或生理盐水来进行测量。,53水空白,比色杯在加入水以后的吸光度。,54样本,生化测试的样本包括血清、血浆、尿液、脑脊髓液等体液，最常用的是血清。血清的制备是在采血后加入凝固剂或者在水浴箱中水浴，促使血液凝固，然后在离心机离心，血细胞和血浆沉在试管下部，上面的血清就是生化测试中所需的样本血清。注意纤维蛋白可能漂浮在血清当中，在制备样本的过
29、程当中要挑出来。,55质控物质,人工混合血清或者动物血清，有定值和未定值两种，用于室内和室间质控。检验科通过每天的质控测试，监控测试的可靠性。,56底物控制,仅对零级动力学有效，一些高浓度（活性）样品使底物耗尽，使反应不在为零级（零级动力学法）或1级（固定时间法）反应，为能正确反应测定结果，需设置底物控制（某一特定吸光度），该底物控制应正好是反应曲线中线性区与非线性区（零级动力学法）或1级反应区与多级反应区（固定时间法）的临界点，是在反应时间内反应没有发生底物耗尽时所能达到的最小（反应曲线向下）或最大（反应曲线向上）的吸光度值。某一项目的底物控制值与所用试剂盒密切相关，就某一特定试剂盒来说，底物控制值应由用户预先用一系列已知浓度（或活性）的样本来确定：观测这些样本的实时反应曲线，找出反应曲线上反应时间内线性区与非线性区的交叉点的吸光度，该吸光度就是该项目的底物控制值。更换试剂后，需用相同的方法重新确定。,
