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1、重组DNA技术,Recombinant DNA Technology,张晓伟E-mail:,北京大学医学部生物化学与分子生物学系,1973，Cohen等人首次使用DNA克隆技术成功,克隆（clone）,克隆即指同一副本或拷贝（copy）的集合；获取同一拷贝的过程叫克隆化。,【实例】肝组织分离肝实质细胞单一肝实质细胞繁殖-细胞克隆,自众多分子中分离获得相同分子，即为分子克隆，在分子生物学和遗传学领域所谈的分子克隆专指DNA克隆.,第一节 概述,DNA克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、
2、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（gene cloning）,基因工程,重组DNA技术（recombinant DNA technology）：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。,一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等,1、目的基因（target gene）：cDNA或基因组DNA,2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等,cDNA（complementary DNA）：指体外经反转录合成的，与RNA（常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。,基因组
3、DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组DNA。,质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。,3.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。,3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、RNA酶、DNA酶，等,常用的是II类限制性内切酶,许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构 回文结构：DNA的两条链呈旋转对称，即中心
4、轴两侧的碱基序列为互补序列。,配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端,3.2 DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、Klenow片段(Klenow 酶)、T4 DNA聚合酶以及Taq酶等,3.3 DNA连接酶T4 连接酶：可用于粘端与平端的连接,4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞,质粒的特点：1、环状DNA，2kb数百kb。2、某些质粒可以重组到染色体中复制。,质粒载体,3、质粒的遗传信息可以赋予细胞某些性状（抗药性等），这些性状的有无常用于鉴定质粒是否存在于活细胞中。,4、质粒复制分两型严谨型、松弛型,松弛性质粒，拷贝数多，不受细胞内染色体控
5、制。,质粒载体,严谨型质粒，拷贝数少，复制受染色体控制。,质粒载体,理想质粒载体的条件：1、具有自主复制能力；2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开；3、分子量相对较小，能够容纳目的基因；4、具有较多单一限制性内切酶位点；5、有一个或多个筛选标记；6、具有较高的遗传稳定性。,The constructed plasmid pBR322,质粒载体,外源基因插入位点EcoR含一个复制起始点（ori）抗药基因terr和ampr,1977年由Boliver和Rodriguez等人自E.coli的天然质粒建成。,1、克隆载体,An example of an E.coli expressi
6、on vector.,质粒载体,2、表达载体,外源基因插入位点复制起始点（ori）标记基因启动子调控序列,噬菌体载体,常用噬菌体：噬菌体载体、M13噬菌体,1、噬菌体载体,（1）结构：线性双链DNA，由三个片段组成（左臂、中央、右臂）；感染细菌后，可以形成封闭环分子。,（2）两类载体置换型载体：适于基因组DNA克隆。插入型载体：适于cDNA克隆。,2、M13 噬菌体单链DNA，用于DNA序列分析、体外定点突变,其它类型载体,一、柯斯质粒（cosmid）,二、逆转录病毒载体,三、Ti质粒,可重组45kb的大片段，用于构建基因组文库,适用于动物细胞的基因工程,用于植物细胞基因工程,其它类型载体,四
7、、酵母人工染色体（YAC）,一、限制-修饰体系（restriction-modification system）,在细菌中与限制性内切酶同时共存有一种甲基化酶，两种酶共同构成细菌的限制-修饰体系,内切酶：切除限制外源DNA甲基化酶：保护自身DNA,限制性核酸内切酶,二、限制性内切酶分类：依据酶的组成、所需辅助因子及裂解方式分为三类,1、三个亚基组成的限制酶,既有内切酶又有甲基化酶活性需ATP供能辅助因子：Mg2+,S腺苷甲硫氨酸切割：特异性差，切割识别位点约400-700bp或更远的DNA。,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,既有内切酶又有甲基化酶活性需ATP供能辅助因子：Mg2+切割：识别
8、位点周围25-27 bp内,3、两个亚基组成的限制酶,2、一个亚基的限制酶：常称作限制性内切酶,只有内切酶活性，无甲基化酶活性不需ATP供能辅助因子：Mg2+切割：特异位点内,酶识别序列结构呈二元旋转对称又叫作回文结构(palindrome)，即两条链的序列相同、方向相反（反向平行）,限制性核酸内切酶,Rats live on no evil star.5 rats live on 3 3 no evil star 5,【经典举例】Eco RI,限制性核酸内切酶,限制性内切酶切割产物：具有5磷酸基和3羟基基团由于酶的作用不同可以产生三种切割末端。,（1）5突出末端：如Eco RI,酶识别DNA
9、序列的长短不同，一般为4-18bp,（3）平头钝性末端：如Hpa I,限制性核酸内切酶,（2）3突出末端：如Pst I,第二节 DNA克隆的基本过程,分、切、接、转、筛、表达,一、“分”：目的基因及载体的制备,1、分离基因的方法：化学合成、基因组DNA、cDNA、PCR,基因组DNA文库(genomic DNA library)：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库,cDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与
10、适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。,聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合成的过程,一、化学合成法,目的基因的获得,对已知基因的核苷酸序列，或蛋白质的氨基酸序列，推导出该多肽编码的核苷酸序列，用DNA合成仪经化学方法合成此基因。,【举例】胰岛素原、心钠素等,二、基因组DNA文库,目的基因的获得,OH 3,OH 3,OH 3,三、cDNA文
11、库的建立,目的基因的获得,四、DNA聚合酶链反应（PCR）,PCR技术的发明,PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Karry Mullis教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖,PCR操作应注意的问题：,DNA样品的纯度 Taq酶的高保真性：Vent,pfu等引物的特异性,2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA,克隆载体（cloning vector）：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等,表达载体(expression vector)：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物,
12、二、“切”：限制性内切酶切割目的基因和载体DNA,三、“接”：重组体的构建,重组体构建,一、粘性末端连接,1、同一限制酶切割位点连接，碱基配对结合成重组分子。,2、不同限制酶切割位点连接，因有相同末端，经配伍后连接,重组体构建,配伍末端连接,二、平端连接,平端在T4连接酶作用下可以连接。,三、同聚物加尾连接,利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的互补作用完成连接，需末端转移酶。,四、人工接头连接,用人工合成某酶切割序列的接头，与DNA平端相连后形成粘性末端再连接。,重组体构建,重组体构建,2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞的过程,3、感染（transfection）
13、：以l噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（transduction）,四、“转”：重组DNA分子导入受体细胞,1、转化（transformation）：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程,两个技术：制备感受态细胞和导入方法。,重组体导入细胞,感受态细胞制备：,经某些方法处理后，具备接受外界DNA 能力的细胞，称为感受态细胞。目前常用的多为E.Coli k-12株的衍生物。限制酶缺陷型，使导入DNA免遭降解。DNA重组缺陷型，以保证导入DNA完整独立
14、存在，不与细菌中基因组DNA重组。安全宿主菌，在非培养条件下不生长。,导入受体细胞的方法：转化、转染、感染（转导）,五、“筛”：筛选出含重组DNA的受体细胞,1、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）】,2、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法,针对载体携有某些标志基因或目的基因的筛选方法，直接测定基因及表型。,1、抗药性标志选择,含抗药性基因的载体（ampr,Tetr,Kanr）转入的细菌，可在含该药物的培养板上形成菌斑，进行初步筛选。,重组子的筛选,一、直接筛选法,Screening for desired recombinant b
15、y antibiotic resistance genes(clones 2,5,and 8),【实例】质粒载体含-半乳糖苷酶N端序列（LacZ基因），而突变株细菌中可表达-半乳糖苷酶C端序列，只有在两者共同表达时，才有酶的活性。,重组子的筛选,2、标志补救,导入基因的表达产物与受体菌的营养缺陷互补，利用营养突变株筛选叫标志补救。,pUC18质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal，X-gal（半乳糖苷酶的底物）便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。在多克隆
16、位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色克隆,利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒,重组子的筛选,蓝白斑筛选,3、分子杂交法：用32p标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的重组DNA片段进行杂交，直接鉴定目的基因。4、PCR/DNA序列测定,用特异的抗体与目的基因的表达产物相互作用进行筛选。,二、免疫学方法,重组子的筛选,六、“表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达,1、外源基因在原核细胞的表达,大肠杆菌是最常用的原核表达体系,真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体,2、真核表达体系,酵母、昆虫及哺乳动物细胞等 表达产物更接近天然蛋白质,基因工程的基本步
17、骤,1、分,2、切,3、接,5、筛,4、转,6、表达,基因工程的基本步骤,第三节 重组DNA技术与分子医学的关系,疾病基因的发现、发展新药物、DNA诊断、基因治疗及遗传病的防治,一、疾病相关基因分析,1、功能克隆（functional cloning）：根据基因的功能（通常是根据其蛋白质）产物来寻找、克隆与疾病相关的基因,2、定位克隆（positional cloning）：从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因,二、制造生物活性蛋白,基因工程产品,A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase is exp
18、ressed.Light was produced after the plant was watered with a solution containing luciferin,the substrate for this lightproducing enzyme(see Box 13-3,Fig.2).Dont expect glow-in-the-dark ornamental plants at your local nursery anytime soon;the light is actually quite weak and this photograph represent
19、s a 24 hour exposure.The real point-that this technology allows the introduction of new traits into plants-is nevertheless elegantly made.,转基因植物,基因工程的应用,转基因动物,三、基因诊断,基因诊断：利用分子生物学的基本原理和技术，在DNA或RNA水平上分析、鉴定与某些疾病有关基因的改变（基因结构及其表达水平的异常）,遗传病的产前诊断、感染性疾病的快速诊断、某些肿瘤的早期诊断以及器官移植供体的选择和法医学鉴定等,四、基因治疗,基因治疗（gene ther
20、apy）：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，从而达到治疗疾病目的的方法,1、基因治疗的方法（分类）,（1）基因矫正（gene correction）：将致病基因的异常碱基进行纠正，而保留正常部分,（2）基因置换（gene replacement）：正常基因通过同源重组，原位置换疾病基因,（3）基因增补（gene augmentation）：对机体输入正常的目的基因，通过增补基因的表达产物，调控或纠正细胞的某些功能,（4）基因失活（gene inactivation）：采用各种方式抑制或破坏某种基因的表达，如反义RNA和RNA干扰(RNAi)技术、核酶、基因敲除（gene kn
21、ock-out）等,2、基本程序,（1）治疗性基因的选择,（2）载体的选择,（3）靶细胞的选择,（4）基因转移,直接体内疗法：将外源基因转移到体内特定细胞内，使外源基因得到表达，从而达到治疗的目的,间接体内疗法（细胞介导）：将外源基因导入合适的靶细胞内并使其表达，体外进行细胞增殖后再输回病人体内，使基因在体内表达,Ashanti de Silva,was the first patient to be treated with gene therapy.,重症联合免疫缺陷病的基因治疗 腺苷脱氨酶基因治疗(1990),小结,基本概念：基因工程 重组DNA技术 限制性核酸内切酶 聚合酶链反应（PCR）cDNA文库 基因组DNA文库基因工程的基本过程：分，切，接，转，筛，表达理想质粒载体的特点,
