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1、攀枝花学院本科毕业设计（论文）金龙胆草中总皂苷的提取研究学生姓名： 学生学号： 院（系）： 年级专业： 指导教师： 二一二年五月 摘要本实验采用水浴回流提取，分别通过单因素实验、正交实验考察金龙胆草总皂苷的最佳工艺条件，为金龙胆草总皂苷药理药效研究提供材料，同时为其进一步开放奠定基础。方法 以熊果酸为对照品，用紫外可见分光光度法建立熊果酸的标准曲线；在单因素试验的基础上，以总皂苷含量为指标，采用正交试验方法考察提取温度、固液比、乙醇浓度、提取时间等因素对提取工艺参数做初步研究。结果（1）单因素实验结果：设计金龙胆草的提取工艺为乙醇浓度分别为50%，60%，70%，80%，90%；固液比分别为1
2、：20，1：25，1:30，1：35，1：40；提取温度分别为50，60，70，80，90；提取时间分别为0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h；（2）正交实验结果：提取温度A，固液比B，乙醇浓度C对指标影响显著。根据以上分析，可定出影响指标的因素显著性主次顺序为：ABCD。总皂苷的优选浸提条件（各因子优水平组合）为最佳提取温度70，最佳固液比1:30，最佳乙醇浓度为80%，最佳提取时间2h。关键词：金龙胆草； 总皂苷；水浴回流提取； 正交试验法 ABSTRACTThe purpose of Water bath reflux method extraction process of tot
3、al Saponins in Gold gentian conditions of a preliminary study and with the traditional craft make that nol compared to optimize the extraction of total Saponins in Gold gentian conditions. Method Use Ursolic acid as reference substance, by ultraviolet-visible spectro photometry Ursolic acid standard
4、 curves set up; in the single factor test, based on the total Saponins content as an index, using orthogonal test approach to Extraction temperature solid- liquid ratio, ethanol concentration , extraction time on the extraction process parameters to do a preliminary study. Conclusion The gentian des
5、ign gold extraction process is the concentration of ethanol were 50%, 60%, 70%, 80%, 90%; solid-liquid ratio were 1:20,1:25,1:30,1:35,1: 40; extraction temperature is 50 C, 60 C, 70 C, 80 C, 90 C; extraction time for 0.5h, 1h, 1.5h, 2h, 2.5h; The experimental results show that: The yield of total Sa
6、ponins as an index, Water bath reflux method extraction is superior to the traditional reflux extraction method, total Saponins in Gold gentian the best extraction process for the 80% ethanol concentration, solid-liquid ratio of 1:30, Extraction temperature to 70Degrees Celsius, extraction time to 2
7、hour.Key words: Gold gentian, total Saponins, Water bath reflux method extraction,orthogonal test method目 录摘要IABSTRACTII第一章 绪论11.1 金龙胆草的来源与性质11.2 金龙胆草的化学成分11.3 三萜皂苷的生物活性11.3.1.体外活性11.3.2体内活性21.3.3抗致突、抗促癌作用31.3.4降血糖、血脂作用31.3.5保肝作用41.3.6抗病毒作用41.3.7抗心肌缺血作用51.3.8对脑损伤的保护作用51.3.9抗炎、抗过敏作用51.3.10抑制黄体细胞活性61.
8、3.11对味蕾受体细胞的作用61.4 前景6第二章 实验部分72.1 材料72.2 仪器72.3 工艺流程72.4 实验方法82.4.1测量波长的选择82.4.2标准曲线的制备92.4.3提取单因素实验方法92.4.4提取工艺正交试验设计方法102.4.5总皂苷含量测定方法10第三章 结果与分析113.1 标准曲线绘制113.2水浴回流法提取金龙胆草总皂苷单因素实验方法113.2.1 提取温度对提取效果的影响113.2.2固液比对提取效果的影响123.2.3提取溶剂浓度对提取效果的影响133.2.4提取时间对提取效果的影响143.3提取金龙胆草总皂苷正交实验方法14第四章 讨论与总结174.1
9、本研究的结果与测定的金龙胆草总皂苷偏低的原因174.2标准品的选择174.3金龙胆草皂苷提取温度的选择174.4金龙胆草皂苷提取时间的选择174.5提取溶剂的选择174.6结论174.7展望18参考文献19致谢20第一章 绪论1.1 金龙胆草的来源与性质金龙胆草为四川、云南等地的民间草药，历代本草未见记载，散见于四川、云南等地的中草药手册中。金龙胆草及其制剂在中国药典1977年版一部及四川省药品标准中收载I”。原植物为菊科白酒草属植物苦蒿(Conyza blinii Lev1)，该属植物全世界约有80100种，主要分布于东、西半球的热带和亚热带地区。我国有10种变种，除木里白酒草和宿根白酒草因
10、资源局限，尚未见有药用记载外，其它种在国内或国外都有药用记载，主要用于各种炎症疾病的治疗21。金龙胆草以干燥地上部分人药，有清热解毒、消炎祛痰，止咳平喘的功能。用于慢性气管炎、胃肠炎、肾炎、肝炎、痢疾、口腔炎、中耳炎、风火牙痛、湿疹、痔疮、外伤出血、烫火伤及牲畜创伤。1.2 金龙胆草的化学成分金龙胆草的化学成分主要有萜类、皂苷、酚性物质、酸性物质、挥发油及生物碱等。其中金龙胆草的皂苷成分主要为三萜皂苷，含量大致为1.63.0，从其干燥地上部分的乙醇提取物中可分离得到16种三萜皂苷类化合物。 1.3 三萜皂苷的生物活性三萜皂苷是由三萜皂苷元和糖、糖醛酸和其他有机酸组成,已发现达30余种类型,除了
11、个别是无环三萜、二环三萜及三环三萜外,主要是四环三萜和五环三萜两大类。三萜皂苷目前已成为天然产物研究中最活跃和进展最快的领域。它广泛地分布于植物中,具有多种重要的生物活性和广泛的药理作用,如:抗癌、抗炎、抗过敏、治疗白血病、抗病毒、降血糖、防治心脑血管疾病等。山于三萜皂苷是一类复杂的大分子化合物,过去的研究进展比较缓慢,近年来,随着现代分离方法和结构测定技术的应用,使三萜皂苷的研究有了突破性进展,同时随着生物测试体系的快速发展,使人们能够更好地研究和确定皂苷的多种生物活性和药理作用,在不久的将来三萜皂苷一定会因其特殊的生物活性和药理作用而备受人们的重视的。1.3.1.体外活性许多研究表明三萜皂
12、苷具有抗肿瘤活性。据报道,一类环状的双糖链糖苷对多种癌细胞系有很强的细胞毒作用。从葫芦科植物合子草中分离得到的四种皂苷lobatosidesB、C、D、E对多种癌细胞系表现出显著的细胞毒效应,其中lobatoside E则对肺癌、黑素瘤和结肠癌的癌细胞系的毒性更强一些。其GI50分别为0.14,0.14和0. 36mol/l。五加科植物波斯常春藤(Hederacolchica) 中具有新结构的齐墩果酸单糖苷(Hedercolchiside)A对肺癌A549等六种肿瘤细胞系均有细胞毒效应,其IC50从4. 5mol/l到12mol/l不等,构效关系研究表明其C3位苷化,且糖的连接次序为O-L吡喃
13、鼠李糖(12) -L吡喃阿拉伯糖是保持活性的基本结构单元。此外西南银莲花(Anemone davidii Franch)中的三个三萜皂苷对人癌细胞体外生长有抑制作用，紫金牛科紫金牛属植物九节龙(Ardiseapusilla)中的两个九节龙皂苷(ardi-pusilloside)对小鼠肉瘤(S180)、小鼠艾氏腹水癌(EAC)、黑色素瘤(B16)以及小鼠肝癌(HEPA)均有抑制作用；San-guishbrbaofficinal根中提取的三萜皂苷对人的鳞片癌(HSC-2)细胞有细胞毒活性;大豆皂苷经体外实验证实可通过抑制癌细胞DNA合成、干扰细胞代谢及改变细胞外移的性质,抑制帖附型细胞帖壁生长,对
14、肺腺癌细胞SPC-A21生殖有抑制作用。葫芦科另一种植物土贝母(Bobostemma paniculatum)根中的酰化环状双糖链糖苷(tubeimoside),可抑制肿瘤细胞中的DNA合成,并可诱导肿瘤细胞表型逆转,同时可使HL-60白血病细胞的细胞增殖率及粒性白血球的功能性表达降低,引起粒性白血球的细胞化学和酶功能障碍，这些研究结果提示tubeimoside可望成为治疗白血病的侯选药物;人参三醇(PTS)是人参皂苷内抑制白血病细胞的有效成分,能抑制HL260细胞的生长并增强其对化疗药物的敏感性,为临床应用提供依据。1.3.2体内活性移殖了B16-BL6黑素瘤和26-M3. 1结肠癌的同系小
15、鼠经口服及静脉注射多重方式给予人参皂苷Rh2、Rg3后,可明显抑制癌向肺部的转移。其机理是抑制肿瘤细胞的侵润、粘附及肿瘤细胞诱导的血管生成作用; Rg1 灌胃和Rh1 腹腔注射对U14均具有明显的抑制作用,可能与其促进细胞因子TNF-A的分泌及其基因表达有关;高勇等的研究结果表明Rg3抑制血管生成作用可能是由于Rg3 抑制了肿瘤组织内活细胞生长因子(BEGF)的表达。来自于植物Maesa lanceolata叶子中的3位苷化齐墩果酸型皂苷体内作用于绒毛膜癌时,可抑制肿瘤组织诱导的血管生成作用。移植了卵巢癌的裸鼠经腹膜内给予人参皂苷Rh2,并同时给予顺铂(cisplatin) ,结果表明两者合用
16、较之单用时,小鼠的生存时间明显延长,而肿瘤的生长受到明显抑制。菊科植物一枝黄花中的三萜皂苷VirganreasaponinE可能通过促进血清肿瘤坏死因子TNF2的释放而抑制小鼠DBA/22MC. SC21纤维肉瘤以及180纤维肉瘤的生长。绞股蓝总皂苷经腹腔注射对小鼠Lewis肺癌细胞具有明显的抑制作用.作为中国传统中药的人参,其主要成分人参皂苷具有多种药理作用,人参皂苷Rhl及其前体Rgl对小鼠宫颈癌(U14)和EAC有明显的抑制作用,具有很强的抗肿瘤作用, Rh1抗肿瘤作用强Rg;其二醇组皂苷Rh2 经研究具有很高的抗肿瘤活性,对癌症细胞具有分化诱导、增殖抑制和诱导细胞凋亡等作用。樊光华等研
17、究人员发现Rh2可诱导体外培养的人肝癌Bel27404细胞凋亡:人参皂苷Rg3可抑制胃癌诱导的血管内皮细胞的增殖,明显抑制B16黑色素瘤的生长及生殖活性,还具有抑制甲状腺癌血管生成的作用,可有效抑制其生长和转移。此外人参皂苷通过阻止细胞增殖周期的G0/Gl期或促使细胞死亡两种方式抑制肿瘤细胞U20S的增殖。1.3.3抗致突、抗促癌作用从澳大利亚沙漠植物Acacinvictoriae中提取的三萜皂苷勒樘碱用于由7,122二甲基苯并芘(DMBA) +佛波酯(TPA)诱导的小鼠二阶段皮肤瘤模型后可显著抑制小鼠表皮的增生,较之对照组可达到60 以上,抑制真皮层细胞的炎症反应,减少小鼠皮肤肉瘤的形成。研
18、究其作用机制显示avicins抑制了细胞中超二倍体的出现,降低了肿瘤形成早期中的H2ras的61位密码子第二个碱基(AT)的突变体的形成,突变率降低了74 ,同时还降低了82OH-dG的形成。从泻根(Bryoniadioica)的根中得到的三帖皂苷能很好地抑制TPA诱导的炎症反应,对TPA诱导的EBVEA的半数抑制量为0. 20. 6g/ear。其中bryoniosidesE显示出强烈的EB病毒早期抗原(EBV2EA)抑制作用,在1103molratio/TPA剂量时,抑制率可达到100。这类皂苷有望发展成为一类有效的预防肿瘤药物。1.3.4降血糖、血脂作用日本学者Takashi等从云南七叶树
19、(Aesculus assamica)中分离得到两个新三萜皂苷长柄七叶树素(assamicin)和,首次报道了它们具有胰岛素样活性。当assamicin和浓度分别为100和25g/ml时,可几乎完全抑制肾上腺素性大鼠脂肪细胞释放游离脂肪酸。另外可促进培养的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的吸收,皂苷浓度为25g/ml时,检测含有H-2-脱氧葡萄糖的3T3-L1细胞时,与对照组比较,这种作用可增强2. 5到3. 5倍。匙羹藤(Gymnema, sylvestreSchult)中的匙羹藤酸属于齐墩果酸型三萜皂苷,使降血糖活性成分,其降糖机理是抑制ATP酶活性而抑制葡萄糖的主动重吸收;王大元等通过实验证实
20、黄毛榴木(AraliadecaisneanaHance)中的齐墩果酸型三萜皂苷对正常小鼠、肾上腺素性高血糖小鼠及四氧嘧啶性糖尿病小鼠可产生明显的降血糖作用,从构效关系看,齐墩果酸的3位单糖氧苷是降血糖的基本结构。西洋参叶总皂苷不仅能降低血糖,还能够降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白,升高高密度脂蛋白,对冠心病和血脂异常有治疗作用,而贾桂燕等证实西洋参叶总皂苷和人参总皂苷都对胰脂肪酶活性有抑制作用。1.3.5保肝作用魏振满等人证实七叶皂苷钠能显著降低CCl4肝损伤所致的小鼠血清谷丙转氨酶升高,对小鼠实验性肝损伤具有明显的保护作用。三七皂苷和绞股蓝皂苷对酒精引起的肝损伤具有干预、保护作用,能减轻
21、肝脏组织脂肪变性程度将多种人参皂苷作用于CCl4诱导的肝损伤模型时,通过分析受损肝组织及检测血清中谷草转氨酶及谷丙转氨酶活性,结果显示人参皂苷可减低肝损伤,作用机理可能是皂苷与肝微粒体中的细胞色素P450酶相互作用,降低了此酶的活性。太白楹木根和辽东 木叶中的三萜皂苷可阻止CCl4诱导的肝损伤,抑制天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶,且作用强于甘草甜素。在临床上,甘草甜素在日本已广泛用于治疗慢性病毒性肝炎。刘玉平等的研究结果证实了2常春藤皂苷具有肝脏解毒作用。从Combretum quadrangalare植物的种子里提取的三萜皂苷混合物对原代培养的鼠肝细胞用D2半乳糖苷/TNF2诱导产生的肝损伤有
22、较强的抑制作用,同时在体内可阻止半乳糖苷/脂多糖 (LPS)诱导的肝损伤,降低血清中谷丙转氨酶。从构效关系看,天然及合成的齐墩果酸及常春藤的双糖链糖苷均有显著的护肝作用,但单糖苷则无活性,只有在苷元的C3、C28位均接有糖,才会产生活性。C24的取代基的变换, (CH3或CH2OH)不影响活性。合成的甘草酸双糖苷,有(12)连接,末端有2glucuronopyranose时,作用较甘草酸更强。另外一项研究表明合成的齐墩果酸, 112去氧甘草酸的双糖苷活性很强,而-双糖苷则无明显活性。11位上羰基还原后,活性稍强于甘草酸,但苷元上的羰基替换为羟甲基时,活性剧烈下降。1.3.6抗病毒作用在抗艾滋病
23、HIV的研究中,豆科植物甘草中的甘草甜素(glycyrrhizin)具有体外抗HIV21的活性,其硫酸盐衍生物能够很好地抑制HIV21逆转录酶活性。Glycyrrhizin经化学修饰为112去氧化合物并在C和D环上有异环二烯结构后,对HIV21和单纯疱疹病毒HSV21的复制产生较强的抑制作用,浓度为0. 16mmol/L时,可以抑制HIV21诱导MT24和MOLT24两细胞系产生的致细胞病,浓度0. 5mmol/l时,对HSV21的抑制效果可达到50。山皂荚( Gleditsia japonica) 和肥皂荚( Gymnocladuschinensis)中的两个皂苷可明显抑制H29细胞中的HI
24、V的复制(EC50为1. 1和2mol/l)并且毒性很低( IC50为9. 8和14mol/l)。从植物Aesculuschinensis种子中得到的三萜皂苷明显地抑制HIV21蛋白酶活性。从桔梗(platycodon grandiflorum)的根中分离到的三个新三萜皂苷具有抗病毒的活性,能有效抑制HSV21、呼吸道合胞病毒(RSV)和流感病毒(FluA);一定浓度的人参皂苷RgH3、Rb3 对HSV21有明显的抑制作用,阻止病毒吸附于易感细胞,或进入细胞内部,达到抑制或杀伤病毒之效果。黄芪总皂苷在Hep22细胞中,能够阻断HSV22333的感染,并抑制其增殖,对HSV21和HSV22均有很
25、好的抑制作用。另外苦瓜茎叶总皂苷也表现有一定的抗HSV22病毒活性。1.3.7抗心肌缺血作用人参皂苷Re,Rb1,Rg1,三七皂苷,西洋参总皂苷在局部及体外均能防止动物心肌细胞局部缺血和再灌注引起的心肌损伤,其主要机制是降低血清磷酸肌酸激酶(CPK)的释放,减少心肌Ca2+的累积,防止过氧化歧化酶(SOD)的活性降低,缩小心肌梗死面积,降低乳酸脱氢酶(LDH)活性,降低血清游离脂肪酸(FFA)及过氧化脂质(LPO)的含量,纠正心肌缺血时FFA代谢紊乱和防止脂质过氧化。五加科植物刺五加的茎叶总皂苷作用于急性梗塞犬时能明显增加心肌血流量,降低冠脉阻力,亦可明显减慢心率降低血压;同时减少心肌耗氧量及
26、心肌耗氧指数,从而发挥抗心肌缺血作用;对心肌梗死24h的大鼠,可明显缩小心肌梗死面积,增强抗氧化酶活性,纠正心肌缺血时FFA代谢紊乱和减少自由基对心肌的氧化损伤,因此对急性心肌缺血有保护作用。1.3.8对脑损伤的保护作用2七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显保护作用,能显著改善脑缺血-再灌注后脑梗死面积,减轻脑水肿,改善神经功能症状,其保护作用可能与抑制局部炎性渗出有关。刺五加皂苷对缺血性神经元凋亡有保护作用,可能是通过抑制NO的释放及稳定细胞膜拮抗神经元凋亡。1.3.9抗炎、抗过敏作用三七是五加科人参属植物,传统用于止血化瘀、消肿镇痛。近年来研究表明,三七总皂苷对多种实验性炎症模型
27、具有良好的抗炎活性。如:三七总皂苷及三七叶皂苷,对于角叉菜胶诱发的大鼠气囊膜炎具有明显的抗炎作用,升高中性粒细胞(Neu)内环磷酸腺苷(cAMP)含量,抑制炎症介质肿瘤坏死因子(TNF)及NO水平的升高,显著降低灌洗液中白细胞数量和蛋白含量,其抗炎机制与升高Neu内CAMP水平,抑制NO及TNF含量升高,减轻脂质过氧化损伤有密切关系。金银花中分离得到的新三萜皂苷忍冬苦苷C, 50200mg/Kg剂量对耳肿胀的抑制率为15.0 31.0 ,与同剂量的忍冬苦苷A的抗炎活性相当,明显优于同剂量的阿斯匹林。翼尾草中的三萜皂苷能显著的抑制炎症的产生,具有较强的抗炎作用。七叶树科植物欧马粟树(Aescul
28、ushyppocastanum)中得到七叶皂苷a, b, a, b可明显抑制大鼠因醋酸引起的血管渗透压升高,减少小鼠因角叉菜胶引起的急性脚爪肿胀。在结构上,酰基是保持活性的必需基因。目前七叶皂苷的衍生物七叶皂苷钠在临床上广泛用于脊椎综合征治疗,指(趾)水肿,血肿,血管疾病的治疗。1.3.10抑制黄体细胞活性ShengminSang等从麦蓝菜(Vaccariasegtalis) 的种子中分离得到一个新的三萜皂苷segetoside F,并首次报道了这种皂苷具有抑制黄体细胞活性,浓度在20g/ml时,抑制活性可达到100 , IC50值为12. 6g/ml。1.3.11对味蕾受体细胞的作用Arif
29、a ahamed等首次报道了从豌豆或其它豆科植物中得到的三萜皂苷chromosaponin能够刺激绿头苍蝇糖味受体细胞,其最佳浓度为0.1mmol/L,低于蔗糖的刺激浓度100倍。进一步的研究表明,这种皂苷透过质膜后激活G2蛋白介导的糖的信号传导通路,给予G2蛋白抑制剂后,糖受体细胞对皂苷、蔗糖和果糖的反应下降,这些结果表明此皂苷可直接激活G2蛋白。癌症和心脑血管疾病目前已成为影响健康的最主要疾病之一,因此开发防治药物在医疗保健和新药开发方面均具有极其重要的地位。中药以其独特的药性理论和确切的临床疗效正越来越受到重视。依据传统的中医理论,从中药中获取活性部位或单体化合物将是一种开新药的捷径。三
30、萜皂苷具有广泛的生物活性和药理作用,对其作用及机制的研究大大推动了三萜皂苷的开发及应用。三萜皂苷具有抗肿瘤、抗病毒的作用,这一结果为应用三萜皂苷治疗AIDS、肿瘤等奠定了理论根据,另外三萜皂苷在心脑血管疾病方面的应用也将有助于寻找和发现更有效的用于治疗心脑血管疾病的天然药物。因此从三萜皂苷中研究开发具有新的作用机制或特点的新药将成为抗癌和心脑血管药物研究的一个重要方向。1.4 前景不难看出，由于金龙胆草仅在四川、昆明的民间药物手册中记载，且主要分布在云南四川等地 ，故国内外相关研究报道很少，近年来，鉴于其所拥有的丰富资源和开发价值，国内兴起了金龙胆草皂苷片和浸膏片的生产热潮，同时，2000年四
31、川省攀枝花市科技局批准米易县为攀枝花市金龙胆草人工种植基地，并与成都华神股份有限公司合作开发了野生金龙胆草人工驯化变家种的科技攻关，目前已总结出一整套种植技术。随着金龙胆草化学成分的研究和提取分离工艺的进一步优化，相信此药材的开发前景会有进一步提升。第二章 实验部分2.1 材料熊果酸标准品（由上海源叶生物科技有限公司提供，含量90%）；所用试剂 无水乙醇、石油醚、香草醛、冰乙酸、高氯酸等均为分析纯试剂。所用水为去离子水。2.2 仪器 粉碎机 （DFT-100型 上海新诺仪器厂）电子天平 （AG135型 上海精密科学仪器有限公司）恒温水浴锅 （018268型 金坛市大地自动化仪器厂）；电热恒温鼓
32、风干燥箱 （DGG-9140A型 上海森信实验有限公司）；722型紫外-可见分光光度计 （上海光谱仪器有限公司）；2.3 工艺流程如图2.3所示粉碎、烘干浸提提取液脱脂定容粉末滤液含量计算金龙胆草图2.3提取总皂苷工艺流程2.4 实验方法2.4.1测量波长的选择 精密吸取0.16mg/ml的熊果酸标准溶液0.3ml，在722型紫外-可见分光光 度计上从400 nm-800 nin范围进行波长扫描，同时以试剂空白作参比。结果表明熊果酸在548nm处有最大吸光度且空白对照干扰最小。图2.4.1 熊果酸标样显色后可见光吸收曲线2.4.2标准曲线的制备 精密称取熊果酸4mg，加甲醇溶液定容至25mL，
33、制成每1 mL含 0.16 mg的标准溶液。精密移取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml分别加入7支干燥具塞的试管中，水浴挥干溶剂，各加入新配制的5香草醛冰醋酸溶液02ml，高氯酸08 ml ，于60恒 温水浴加热15 min，取出。流水冷却2 min，加冰醋 酸5 ml，摇匀，随行试剂空白，用可见分光光度计在548 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以含量( g)为横坐标绘制标准曲线，求回归方程2.4.3提取单因素实验方法分别考察不同的提取温度、固液比、乙醇浓度、提取时间对提取效果的影响。 处理温度对金龙胆草总皂苷提取的影响提取温
34、度（）5060708090总皂苷含量（%） 处理固液比对金龙胆草总皂苷提取的影响金龙胆草：80%乙醇（gml）1:201:251:301:351:40总皂苷含量（%）提取液浓度对金龙胆草总皂苷提取的影响乙醇浓度（%）5060708090总皂苷含量（%）处理时间对金龙胆草总皂苷提取的影响提取时间（h）0.511.522.5总皂苷含量（%）2.4.4提取工艺正交试验设计方法 根据已有的资料及实际情况，选用提取温度（A），固液比（B），乙醇浓度（C），提取时间（D）作为考察因素，以测得的浸提取样品中总皂苷含量为考察指标，选用L16（4）正交表设计，得到供试液。2.4.5总皂苷含量测定方法 取供试品1
35、mL，水浴挥干，加入新配制的5 香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml于60恒温水浴加热15 min，取出。流水冷却2 min，加冰醋酸5 mL，摇匀，在538 nm测其吸光度值，计算金龙胆草总皂苷的含量，取3次平均值即为测量结果。第三章 结果与分析3.1 标准曲线绘制表3-1 标准曲线表熊果酸质量（%）01632486480112144吸光度0.020.090.1890.2450.3420.4380.5890.752图3.1 标准曲线图以熊果酸质量（ug）为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程为：Y=0.0051x+0.0151，R2=0.9986，表明在一定范围内线形关系良好。3.2
36、水浴回流法提取金龙胆草总皂苷单因素实验方法3.2.1 提取温度对提取效果的影响准确称取1g金龙胆草粉末，加入适量80%的乙醇溶液，设定固液比为1：25，提取时间为1h，提取温度分别设定为50，60，70，80，90将提取液抽滤，取上清液，将滤渣乙醇回流0.5h后合并提取液，检测总皂苷含量，实验结果见图3.2.1和表3.2.1。表3.2.1 处理温度对金龙胆草总皂苷提取的影响提取温度（）5060708090总皂苷含量（%）1.5191.7061.9341.9011.875 图3.2.1 处理温度对金龙胆草总皂苷提取的影响 由图3.2.1可见，随着温度的升高，总皂昔含量呈先上升再下降的趋势，50-
37、70时总皂昔含量显著增加，当温度达到70时，总皂昔含量最高，曲线达到最高点。这说明70是总皂昔提取的最佳温度。温度大于70时，随温度的增加，一些大分子物质溶出，一些活性成分被破坏，曲线呈下降趋势，即总皂昔含量降低。3.2.2固液比对提取效果的影响准确称取1g金龙胆草粉末，加入适量80%的乙醇溶液，设定提取温度为70，提取时间为1h，提取固液比分别设定为1：20，1：25，1：30，1：35，1：40将提取液抽滤，取上清液，将滤渣乙醇回流0.5h后合并提取液，检测总皂苷含量，实验结果见图3.2.2和表3.2.2。表3.2.2 处理固液比对金龙胆草总皂苷提取的影响金龙胆草：80%乙醇（gml）1:
38、201:251:301:351:40总皂苷含量（%）1.3711.5091.6081.5621.549图3.2.2 处理固液比对金龙胆草总皂苷提取的影响由图3.2.2可见固液比为1:20到1:30时，总皂昔含量显著增加，固液比1:30时总皂昔含量达最高点。继续增加固液比总皂昔含量已呈下降趋势。3.2.3提取溶剂浓度对提取效果的影响准确称取1g金龙胆草粉末，分别加入50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液，设定提取温度为70，提取时间为1h，固液比为1：25将提取液抽滤，取上清液，将滤渣乙醇回流0.5h后合并提取液，检测总皂苷含量，实验结果见图3.2.3和表3.2.3。表3.2.3 提取
39、液浓度对金龙胆草总皂苷提取的影响乙醇浓度（%）5060708090总皂苷含量（%）1.1941.4171.6451.7621.704 图3.2.3 提取液浓度对金龙胆草总皂苷提取的影响由图3.2.3可见，乙醇浓度达到80%时，总皂昔的含量最高，浓度再升高总皂昔含量有下降的趋势。原因可能是随着乙醇浓度的升高，使一些醇溶性物质的溶出增加。因此，确定乙醇浓度80%时为提取效果最佳点。3.2.4提取时间对提取效果的影响准确称取1g金龙胆草粉末，加入适量80%的乙醇溶液，设定固液比为1：25，提取温度为70，提取时间分别设定为0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h将提取液抽滤，取上清液，将滤渣乙醇回流
40、0.5h后合并提取液，检测总皂苷含量，实验结果见图3.2.4和表3.2.4。表3.2.4 处理时间对金龙胆草总皂苷提取的影响提取时间（h）0.511.522.5总皂苷含量（%）1.2951.9012.1762.3322.292 表3.2.4 处理时间对金龙胆草总皂苷提取的影响由图4-4可见，当提取时间超过2h，随着提取时间的延长，总皂昔含量呈下降趋势，这可能是提取过程中有部分溶剂挥发所致。因此，选择的提取时间为2h。3.3提取金龙胆草总皂苷正交实验方法在单因素试验的基础上,确定以提取温度（A）、固液比(B)、乙醇浓度(C)、提取时间(D)等因素进行正交试验设计，,选用L16 (4) 正交表进行
41、正交试验,对试验结果进行极差分析。 表3.3.1 正交实验因素水平表实验号A 提取温度()B 固液比C 乙醇浓度(%)D 提取时间(h)1601：256012701：30701.53801：358024901：40902.5表3.3.2 正交实验表序号A 提取温度()B 固液比C 乙醇浓度(%)D提取时间(h)E 误差列总皂苷得率（%）1601:2560111.6262601:30701.522.0813601:3580232.0404601:40902.541.8185701:2570242.1176701:30602.532.2887701:3590122.0728701:40801.51
42、2.3749801:25802.522.07010801:3090212.14911801:35601.542.06212801:4070132.15813901:25901.531.87214901:3080142.21015901:35702.512.28416901:4060222.182K17.5657.6858.0668.0668.433K28.8518.7288.3898.3898.405K38.4398.4588.6948.4888.358K48.5488.5327.9118.4608.207T=33.403k11.8911.9212.0402.0172.108y=2.088k2
43、2.2132.1822.1602.0972.101k32.1102.1152.1742.1222.090k42.1372.1331.9782.1152.052极差R0.3220.2610.1960.105最优水平A2B2C3D3表4-3-3 正交实验方差分析表方差来源偏差平方和Q自由度f平均偏差平方和VF值临界值F显著性贡献率(%)A0.229 30.076 30.137 显著性41.764 B0.158 30.053 20.757 F(=0.05，f1=3,f2=3)=9.28显著性28.319 C0.108 30.036 14.188 显著性18.903 D0.028 30.009 3.684 不显著3.847 E0.008 30.003 3.804 T0.531 150.035 由表4-3-3实验结果可知，金龙胆草总皂昔的最佳提取工艺为:提取温度70，固液比1:30，乙醇浓度80%,提取时间2h。各种因素对提取效果影响的主次顺序依次为提取温度固液比乙醇浓度提取时间。通过方差分析检验可知，四种因素对提取率均有影响，提取温度、固液比、溶剂浓度对总皂昔的提取影响非常显著，提取时间对总皂昔含量的影响不显著。第四章 讨论与总结4.1本研究的结果与测定的金龙胆草总皂苷偏低的原因其一、实验前金龙胆草粉末不小心遇水变得潮湿，烘干后可能参入了一部分
