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1、1,精浆生化检测的标准化与质量控制,陆金春武警江苏总队南京医院南京军区南京总医院,2,意 义,规范目前男科实验室精浆生化检测方法，以保证检测结果的准确性使不同实验室的精浆生化分析结果具有可比性，从而满足研究人员和临床医生的需要，并可减少重复检查给病人带来的沉重经济负担。,3,精浆生化标志可反映附属性腺功能酸性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、锌、柠檬酸和镁反映前列腺功能；果糖和前列腺素反映精囊腺功能；游离左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和-葡糖苷酶反映附睾功能等。,4,（一）精浆-葡糖苷酶测定,精浆总-葡糖苷酶的测定 检测方法为葡萄糖氧化酶法 精浆中性-葡糖苷酶的测定 前列腺分泌的酸性-葡糖苷酶能够被十二烷基硫酸
2、钠（SDS）选择性抑制，检测过程中加入SDS后，检测出的-葡糖苷酶活性即为中性-葡糖苷酶活性。,5,我们评价了离心速度、冻融、糜蛋白酶及禁欲时间对精浆葡糖苷酶活性检测的影响。,6,精浆葡糖苷酶活性检测的批内CV值 2份新鲜精浆样本分别检测葡糖苷酶活性10次，葡糖苷酶活性分别为(20.920.81)U/ml和(42.751.37)U/ml，批内CV值分别为3.85%和3.19%。,7,2位技术人员检测的精浆葡糖苷酶活性的比较,8,精浆总-葡糖苷酶检测中应注意三点,离心速度不同，精浆总-葡糖苷酶活性有所差异 精浆总-葡糖苷酶活性与禁欲时间的长短密切相关 精浆总-葡糖苷酶活性的检测应进行质量控制,9
3、,不同速度离心后的精浆中葡糖苷酶水平,10,不同速度离心后的精浆中精子密度的比较,11,禁欲时间对精浆葡糖苷酶的影响,12,糜蛋白酶对精浆葡糖苷酶活性检测的影响,13,冻融后的精浆葡糖苷酶的检测结果,14,（二）精浆果糖测定,用于检测精浆果糖的方法有间苯二酚显色法、气相层析法、吲哚显色法等多种方法。我们评价了果糖标准液、离心速度、精液和精浆放置时间、冻融、糜蛋白酶等对精浆果糖浓度的影响，并比较了不同技术人员的精浆果糖检测结果。,15,精浆果糖检测中应注意四点：果糖标准液配制后应放置2周后使用，而使用2周后出现吸光度降低时应立即更换新的果糖标准液 离心速度不同精浆果糖浓度稍有差异 精液液化后应立
4、即离心将精子和精浆分离，否则会影响精浆果糖检测结果 精浆果糖测定中应引入质量控制体系,16,精子悬液果糖浓度的检测结果 10份精子悬液标本的果糖浓度均为0，提示，精子不含果糖。,17,不同速度离心后精浆果糖及精子浓度的比较 1 000g离心10 min和3 000g离心15 min后精浆果糖浓度没有显著性差异（P=0.176）。而精子浓度比较差异极显著（P=0.000）。,18,Comparison of sperm concentrations in seminal plasmas obtained at 1 000g for 10 min or 3 000g for 15 min,19,果
5、糖标准液吸光度的监测,20,精浆 放置时间对果糖浓度的影响,21,精液 放置时间对果糖浓度的影响,22,糜蛋白酶对精浆果糖检测的影响,23,冻融对精浆果糖浓度的影响,24,不同技术人员精浆果糖测定结果的比较 两位技术人员对10份精浆标本的果糖检测结果见图。两者比较没有显著性差异（P=0.643）。,25,Comparison of fructose concentrations between 2 technicians,26,（三）精浆酸性磷酸酶测定,检测方法普遍为磷酸苯二钠法 标准曲线法和试剂盒法 我们评价了离心速度、稀释后放置时间、冻融、糜蛋白酶对酸性磷酸酶检测的影响。,27,精浆酸性磷
6、酸酶检测中应注意三点 精浆稀释后需立即检测 离心速度对精浆酸性磷酸酶检测结果可能有影响 精浆酸性磷酸酶测定中应引入质量控制体系,28,不同速度离心后精浆ACP活性和精子密度的比较,29,精浆稀释后放置时间对ACP活性的影响 随机选取10例精浆，110 000稀释后立即检测ACP活性或稀释后放置30 min再次检测ACP活性，两者比较有极显著性差异（t 3.770，P 0.001）。,30,糜蛋白酶对精浆ACP活性检测的影响,31,冻融对精浆ACP活性的影响,32,（四）精浆-谷氨酰转肽酶（-GT）测定,检测方法为化学比色法，可分为标准曲线法和试剂盒法 精浆-GT检测中应注意三点 精浆稀释后需立
7、即检测 离心速度对精浆-GT检测结果有影响 精浆-GT测定中应引入质量控制体系,33,（五）精浆锌的测定,检测方法为化学比色法 已有测定精浆中锌浓度的试剂盒出售,34,（六）精浆尿酸的测定意义,UA为人体嘌呤分解代谢的最终产物抗氧化功能，能清除单线态氧及羟基自由基等物质显著增加SOD活性 UA为正常男性生殖系统中重要的抗氧化物质之一UA对精子活力有利。而且，正常生育男性的UA水平显著高于不育患者精浆UA水平的检测对辅助诊断男性不育有重要意义,35,研究背景存在问题和结果,精浆UA的检测方法不统一，比较复杂，一般都要经过萃取后检测 均未对检测方法进行评价，故检测的结果难以有说服力,36,研究目的
8、,建立简单的、可以在临床实验室常规使用的方法进行方法学评价与精液参数的相关性,37,方法的建立,利用检测血清UA的UA氧化酶法加以改良后进行精浆UA检测 液化后的精液标本用Ba(OH)2和 ZnSO4沉淀蛋白上清与UA氧化酶试剂反应520 nm 波长处比色。精浆UA浓度=（测定管吸光度/标准管吸光度）595 mol/L。,38,方法学评价批内差异,随机选取精液标本1份，将其分成10份同时检测，结果为（509.0546.62）mol/L，CV为9.16%。,39,方法学评价批间变异,2份精液标本-20连续冻存10天，每天检测1次精浆UA浓度。样本1为（422.4243.25）mol/L，CV为1
9、0.24%；样本2为（372.2544.11）mol/L，CV为11.85%。,40,冻融对精浆UA水平没有明显影响，冻融精浆标本可以作为UA测定的质控品。,41,方法学评价离心速度,53份精液1 000 g离心10 min和3 000 g离心15 min后精浆UA浓度分别为（463.14186.81）mol/L和（454.39193.89）mol/L，两者比较无显著性差异（P=0.568）1 000 g离心10 min 时，90.57%(48/53)的精浆中仍有残余的精子，精子密度为（3.434.73）106/ml，而3 000 g离心15 min 后仅41.51%(22/53)的精浆含有残
10、余精子，精子密度为（0.481.88）106/ml，两者比较差异极显著（P=0.000）。,42,离心速度对精浆尿酸浓度有一定影响，但相对较小。为了保证精浆中不含精子，离心不得低于3 000 g离心15 min,43,方法学评价糜蛋白酶,Comparison of UA concentration in seminal plasma with or without chymotrypsin,44,方法学评价不液化标本,不液化精液可以加入糜蛋白酶促进液化，吸样时无拉丝形成,45,方法学评价2位技术人员的比较,2位技术人员检测的UA水平分别为(390.88172.86)mol/L和（393.311
11、76.01）mol/L，两者比较没有显著性差异（t=0.635,P=0.541）。,46,方法学评价2位技术人员的比较,47,精浆UA及精液参数的相关性,The result of seminal UA and semen parameters from 138 infertile men,48,精浆UA及精液参数的相关性,Correlation between seminal UA level and semen parameters,49,精浆UA与正常形态精子百分率之间的相关性,50,结论,目前建立的用于检测精浆UA的方法对于一般从事男科学实验室的技术人员是可行的 分离精浆时，离心速度不
12、得低于3 000 g离心15 min 对于液化不全的精液标本，可加入糜蛋白酶促进标本液化,51,结论,正常形态精子百分率与精浆UA水平之间有显著正相关（P0.025），与精子活动率和a+b级精子百分率之间有呈正相关的趋势（P0.085和0.068）冷藏精浆标本可作为不同实验室之间精浆UA检测的质控品,52,(七)精浆肉碱的检测,又称肉毒碱、卡尼汀或维生素BT，相对分子质量为161.2。肉碱广泛存在于自然界中，是一种高极性、小分子季胺类化合物，为人体必需营养素，有重要的生化功能和临床应用价值。L-肉碱是线粒体膜上唯一的活化脂肪酸载体，主要功能是携带、转运活化的脂肪酸，特别是长链饱和和不饱和脂肪酸
13、穿越线粒体膜，进入线粒体内进行氧化和三羧酸循环反应，为机体的各种代谢活动提供能量。D-肉碱对肉碱乙酰基转移酶和肉碱脂酰转移酶具有竞争性抑制作用，影响脂肪酸的正常转运，因而对生物体表现出较大毒性。,53,肉碱分布于体内多种组织，以附睾中的肉碱浓度最高。以游离态和乙酰化形式存在。目前认为肉碱与精子在附睾中成熟有关。附睾本身无合成肉碱的功能，摄取的肉碱来自血浆。当精液中肉碱缺乏时，精子线粒体内正常的氧化过程缓慢，为精子提供的能量降低，可导致精子存活力和运动能力明显降低，进而可导致男性不育。对因肉碱缺乏的患者及时给予肉碱已成为目前治疗男性不育的新疗法之一。然而，目前临床上并没有有效、简便的常规精浆肉碱
14、的检测方法，因此，给予肉碱只是一种经验性的治疗。,54,检测方法,生物法：以肉碱喂养大黄粉虫幼虫，观察摄取和利用情况化学法：肉碱在酸性条件下与乙醇反应生成酯，酯在弱碱性条件下与溴酚蓝生成有色物质，其颜色的深浅与肉碱的浓度呈正比。该法不能区分L-型和D-型肉碱，而且，样本中凡含季胺基团或羟基基团物质对测定结果均会产生干扰,55,酶法：最常用的肉碱测定方法，肉碱和乙酰辅酶A在肉碱酰基转移酶（CAT）作用下反应，生成乙酰肉碱和辅酶A。生成的辅酶A分子中含有一个活泼的-SH基，利用该基团能与许多化合物反应，可以建立不同的酶测定法，如埃尔曼试剂法（DTNB法）高效液相色谱法：分离高效、检测灵敏、结果准确
15、。但需样本预处理。质谱法：肉碱测定的参考方法,56,（八）精浆弹性蛋白酶的检测,精浆弹性蛋白酶由活化的粒细胞分泌，已证实是一敏感和定量的生殖道炎症指标。已报道，弹性蛋白酶浓度与白细胞精子症显著相关。而且，生育男性比不育男性有较低的弹性蛋白酶浓度。由于精液白细胞的检测比较复杂，而且炎症过程中白细胞有可能受破坏不易被检测到，因此，精浆弹性蛋白酶的检测就相对有优势，其不仅适合于大量标本的检测，而且操作简单、快速。,57,检测方法,ELISA法：包被于固相载体的抗弹性蛋白酶抗体可与精浆中弹性蛋白酶相结合，结合的待测物再与特异性酶标记物（酶标抗弹性蛋白酶抗体或酶标抗1蛋白酶抑制剂抗体）反应，最后通过底物
16、显色，其吸光度大小与精浆标本中弹性蛋白酶浓度相关,58,临床意义,有研究标明，精浆弹性蛋白酶浓度与精液中白细胞呈良好相关性。精液白细胞浓度1106/ml时，精浆弹性蛋白酶浓度常1000 ng/ml。但当精液白细胞浓度1000 ng/ml。精浆弹性蛋白酶可作为隐性生殖道感染的诊断及愈后检测指标，并可用于治疗的随访。,59,精浆生化指标分析质量控制的初步研究,我们对目前男科学实验室开展的精浆生化指标分析项目中的精浆果糖、葡糖苷酶及酸性磷酸酶（ACP）的检测在南京市进行了质量控制的初步研究。,60,不同批号的质控品分装后的检测结果,61,不同实验室回报的质控品的结果,62,质控品分装后检测结果与不同实验室回报结果的比较,63,结 论,目前精浆果糖和葡糖苷酶的检测方法可以接受，而精子密度分析和精浆ACP检测的方法尚需改进或进一步规范化。,64,谢谢,
