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1、重组DNA技术与基因工程(ppt 66页),重组DNA技术与基因工程,5,2,3,4,1,6,重组DNA技术与基因工程的基本概念,重组DNA技术所需的基本条件,重组DNA技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母中的表达,3 重组DNA技术的操作过程,切,接,转,增,检,A DNA的体外重组（切与接）,3 重组DNA技术的操作过程,同种内切酶生产的粘性末端的连接,同尾酶生产的粘性末端的连接,不同粘性末端的连接,人工粘性末端的连接,重组率,基于同源重组的In-Fusion连接,同种内切酶生产的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA
2、,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,同尾酶生产的粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,5,5,BclI,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,不同粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,G,ACGTC,3,T4-DNA ligase,5,5,PstI,3,T4-DNA pol,切平,5,5,G,C,Klenow,补平,5,GGATC,CC
3、TAG,GATCC,5,CTAGG,5,5,人工粘性末端的连接 5突出末端,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GG
4、ATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,退火,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,人工粘性末端的连接 3突出末端,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,Pst I,Pst I,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,
5、5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,人工粘性末端的连接 平头末端,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3 G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3,C,退火,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAAAAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,S1,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,加热
6、,基于同源重组的In-Fusion连接,载体质粒,重组质粒,每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的15个碱基序列,引物,引物,In-Fusion酶,加入In-Fusion酶,3715 min+5015 min,PCR扩增,转化,重组率,重组率的定义,重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数；在常规实验条件下，重组率一般为25-75%；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。,重组率,提高重组率的方法,提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1,载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,EcoRI,5,G,CTTAA p,AAT
7、TC,G,5 p,5,5,AATTC,G,5 HO,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-A G,5,G A-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸单酯酶,碱性磷酸单酯酶,重组率,提高重组率的方法,加装同聚尾末端：,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCC
8、GTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）,3 重组DNA技术的操作过程,转化的原理与技术,转化率,转化细胞的扩增,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞的制备：,100 ml 菌体培养至OD600=
9、0.5，离心收集菌体；,用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心,用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体；,冰浴放置12-24小时，备用。,收集菌体；,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：,取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组,冰浴放置半小时；,在42保温 2 分钟（热脉冲）；,快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟；,DNA连接液，混匀；,加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增）；,涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。,转化的原理与技术,细菌原生质体的转化,革兰氏阳性细菌（
10、如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子。,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化。,转化的原理与技术,细菌原生质体的转化,不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。,细菌原生质体的制备：,转化的原理与技术,细菌原生质体的转化,取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加
11、入10-20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+,细菌原生质体的转化：,细菌原生质体的再生：,原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生,的等渗溶液，混匀。,在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。,转化的原理与技术,l噬菌体DNA的转染,感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5；吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟；转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。,转化的原理与技术,电击转化,将待转化的质粒或D
12、NA重组连接液滴加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。,转化率,转化率的定义,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，,即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。,
13、转化率,转化率的定义,例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA。,转化率 转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模。例,如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，经切,接处理后的载
14、体转化率一般要比天然的载体低100倍。欲获得104个重,组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？,若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：,104/107 X 10-2=0.1 mg 载体DNA,考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：,0.1/20%=0.5 mg 载体DNA,载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算出,（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。,转化率 转化率的影响因素,载体及DNA重组分子方面：,载体本身的性质：,不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。,载体的空间构象：,质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连
15、接操作后的载体由于,空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低,两个数量级。,插入片段的大小：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。,转化率,转化率的影响因素,受体细胞方面：,受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则,较高。,转化率 转化率的影响因素,转化方法方面：,受体细胞的预处理：影响最大,供受体的比例：,Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA,转化方法：,Ca2+诱导转化 106-107/mg DNA,原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA,原生质体转化
16、105-106/mg DNA,l-DNA转染 107-108/mg DNA,电穿孔转化 106-109/mg DNA,转化细胞的扩增,扩增操作,转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37培养一个小时；原生质体转化后的再生过程；l噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作。,转化细胞的扩增,扩增操作的目的,增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序,扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选,表达外源基因，便于筛选和鉴定,C 转化子的筛选和鉴定（检）,3 重组DNA技术的操作过程,载体遗传标记检测,克隆DNA序列
17、检测,外源基因产物检测,C 转化子的筛选和鉴定（检）,3 重组DNA技术的操作过程,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。,转化子,重组子,目的重组子,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,抗药性筛选法的基本原理：,抗药性筛选法可区分转化子与非转,化子、重组子与非重组子。,将外源DNA片段插在EcoRI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcr,将外源DNA片段插在BamHI位点：,非重组子呈 Apr、Tcr,重组子呈 Apr、Tcs,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,抗药性筛选法的基本操
18、作：,先将转化液涂布含有Ap的平板，再,将Ap平板上的转化子影印至含有Ap,和Tc的平板上。,在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板,上不长的转化子即为重组子。,Ap,Ap+Tc,影印,挑选,载体遗传标记检测,营养缺陷型筛选法,营养缺陷型筛选法的基本原理：,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本原理：,显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：
19、载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒,pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本操作：,Ap+X-gal,重组子（Apr+lacZ-）,将外源基因克隆在pUC18的lacZ 标记基因内部，使之灭活，此时重组子为Apr、lacZ-基因型，乳白色菌落；而非重组子则为Apr、lacZ+基因型的蓝色菌落。,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行
20、酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Apr,lacZ,ori,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,用BamHI酶切转化子质粒DNA；,电泳观察酶解产物片段。,重组子：2.7 kb+4.0 kb,非重组子：2.7 kb,如果外源DNA片段也是
21、2.7 kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然,后通过其长度来鉴定其是否为重组子,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,区分重组子与非重组子,如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1/50。,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Apr,lacZ,ori,S,S,B,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb
22、,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Apr,lacZ,ori,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分目的重组子与非目的重组子,用EcoRI酶切转化子质粒DNA,目的重组子：3.0 kb+3.7 kb,或者：1.0 kb+5.7 kb,用PstI酶切转化子质粒DNA,目的重组子：3.2 kb+3.5 kb,或者：0.8 kb+5.9 kb,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,4.0 kb,2.0 kb,2.0
23、 kb,区分目的重组子与非目的重组子,对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0 kb和2.7 kb两条带子，实际上2.0 kb的条带中含有两种不同的,2.7 kb,2.0 kb,E,分子。,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,部分酶解图谱法：,2.2 kb,PstI EcoRI BamHI,B,B,E,4.4 kb,1.2,1.8 kb,E,B,0.6,0.8,该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：,BamHI全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 kb,BamHI+EcoRI全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb,其中，1.2 kb片段的存在表
24、明该片段位于一端。,BamHI部分酶解：1.4 2.6 4.0 kb,其中，1.4 kb的片段必为0.6 kb和0.8 kb两片段，表,明两者是连在一起的；同理，2.6 kb的片段必为0.8,kb和1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后，,4.0 kb的片段必为0.6 kb和3.4 kb两片段，表明两者,是连在一起的。,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。,克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位
25、杂交法,菌落原位杂交法的基本操作：,影印,用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；,洗涤,杂交,感光,用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜；,用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜；,80烘干固定影印薄膜；,薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；,用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜；,用X光胶片覆盖薄膜感光。,洗涤,压片,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的制备：,用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：,单链结构（双链DNA可用碱变性）,足够长度（至少12个碱基）,内部不含互补区,探针的制备方法或来源包括：,人工合成,cDNA合成,同源序列,mRNA,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂
26、交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记,3AAAAAAAAAAACCAGCUUCCGAACUGAUUUAGGCU,5mRNA,反转录酶,Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）,5TTTTTTTTTTT,5mRNA,3cDNA,3AAAAAAAAAAACCAGCUUCCGAACUGAUUUAGGCU,5TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：DNA聚合酶介导的缺刻前移标记,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5
27、,Mg2+5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,DNase I,DNA pol I,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：ABC荧光标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,荧光胺,Biotin 生物素,Avidin,生物素结合蛋白,烷烃连接臂,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：ABC显色酶标记,
28、GCTTGAGCAGTAACCTG,显色酶,Biotin 生物素,Avidin 生物素结合蛋白,烷烃连接臂,生色底物,颜色产物,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：地高辛系统标记,dUTP-连接臂-甾醇半抗原,digoxigenin DIG,抗体-显色酶交联复合物,克隆DNA序列检测,PCR扩增检测法,如果已知克隆的目标基因两侧的序列，便可合成引物，以待鉴定的重子DNA为模板，实施PCR。能扩增出大小相符,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Apr,lacZ,ori,4.0 kb,片段的即为期
29、望重组子。,由于PCR技术日益普及，因此该程序已成为鉴定重组子,和期望重组子的首选方法。,克隆DNA序列检测 DNA序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本原理：,DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有：,DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）,聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 bp/601 bp）,电脑自动检测、记录、编辑程序,用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit）,克隆DNA序列检测,DNA序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基
30、本操作：,DNA聚合反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳,克隆DNA序列检测,DNA序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本反应：,Klenow,OH 3,5 P,T,dNTP+ddATP,T,T,T,T,T,OH 3,5 P,A,G,T,C,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,克隆DNA序列检测 DNA序列分析法,基于DNA合成的454超高通量测序战略：,待测DNA样品的预处理：,A 接头,B 接头（含生物素分子）,高压气流随机打断,400-600 bp片段,两端连接扩增和测序接头,克隆DNA序列检测 DNA序列分析法,基于DNA合成的454超高通量测序战略：待测DNA的固相emPCR扩增
31、,变性,表面涂有抗生物素蛋白的磁珠,结合,包裹,水油乳状囊泡,扩增,释放,变性,克隆DNA序列检测 DNA序列分析法,基于DNA合成的454超高通量测序战略：多重DNA测序反应,3 T-C-G-A-G-G-G-A-C-C-A-G-T-C-G-T-A-,5 A-G-C-T-C-C-G,pppT,PPi+APS,sulfurylase,ATP,luciferase,luciferin,oxy-luciferin+hv,160万孔,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,淀粉酶目的基因的鉴定：,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水,的淀粉加入固体培养基内
32、，培养基呈混浊状。将,待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基,因的目的重组子可其表达的淀粉酶分泌出胞外，,并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形,成透明圈。如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，,易于辨认。,蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定。,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子。在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从
33、抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生。,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,目的重组子,诱导抗性,抽取重组质粒,再次转化,外源基因产物检测 蛋白质生物功能测定法,DNA结合蛋白编码基因的鉴定：,影印,用聚乙烯薄膜影印裂解平板；,洗涤,杂交,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定；,80烘干固定影印薄膜；,与探针溶液中杂交；,洗涤、干燥、感光。,用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板；,聚乙烯膜,探针选用能与,目标蛋白特异,性结合的DNA,片段。,外源基因产物检测 蛋白质生物结构鉴定法,放射免疫原位杂交鉴定：,影印,用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印,洗涤,与I125标记的IgG保温,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定；,与I125标记的IgG保温；,洗涤、干燥、感光。,用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板；,含抗体的聚乙烯膜,裂解平板；,洗涤,压片,外源基因产物检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选。,3 重组DNA技术的操作过程,C 转化子的筛选和鉴定（检）,B 重组DNA分子的转化和扩增（转、增）,A DNA的体外重组（切、接）,
