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1、项目名称：植物内生生防菌短芽孢杆菌GFP基因转化及其对黄瓜枯萎病生防机理的研究一、研究内容和重点要解决的科学问题1植物内生菌-短芽孢杆菌JK-2对黄瓜枯萎病原菌抑菌作用的研究从黄瓜植株组织内分离发现一内生菌JK-2，对黄瓜枯萎病具有抑制作用，经中科院微生物所鉴定为短芽孢杆菌（Bacillus brevis），进一步测定其对黄瓜枯萎病抑菌能力，用抑菌圈法、平板对峙法、盆栽法研究JK-2菌株不同培养时间，不同浓度，不同温度对黄瓜枯萎病原菌抑菌作用。1短芽孢杆菌JK-2对黄瓜枯萎病原菌的抑菌作用时间，浓度，温度下的抑制作用2短芽孢杆菌JK-2生物学特性研究1） 生长曲线2） 营养3） 温度4） PH
2、5） 通气3短芽孢杆菌JK-2GFP基因转化与异质性研究1） 转导方法：质粒，技术，设备，参数2） 异质性研究：转导前后生物学特性和抑制作用的比较4短芽孢杆菌JK-2-GFP对黄瓜侵入、定殖特性研究1） 侵入方法2） 侵入条件3） 定殖特性5短芽孢杆菌JK-2-GFP生防保护机制的研究1） 竞争关系（体内外共培养数量关系）2） 诱导关系（生理生化、酶活特性的变化）3） 拮抗关系（接种抗病特性）4） 促长作用6短芽孢杆菌JK-2-GFP防治黄瓜组培苗枯萎病的试验黄瓜枯萎病的病原、内生菌、生防菌的采集和鉴定以及在植株体内分布多态性的研究黄瓜枯萎病病原菌的分离及鉴定，对我省黄瓜主要产区枯萎病的发病情
3、况进行调查，分离、鉴定病原菌。研究黄瓜枯萎病的病害在植株体内分布、分析病原菌分布的多态性和致病性的分化特性。2枯萎病不同发病程度的黄瓜植株内生菌和枯萎病原菌的种群动态和群落结构选择枯萎病不同发病程度、发病时间、发病苗龄的黄瓜，分离和记数植株不同部位的内生菌种类和数量，通过生理生化实验和微生物自动鉴定仪，鉴定分离纯化黄瓜内生菌，对细菌和真菌一般鉴定到属，重要种类鉴定到种。分析黄瓜植株体内内生菌的分布特性；研究内生菌的群落结构特点、特征内生菌动态变化规律；分析内生菌群落结构对枯萎病发病程度的影响，研究内生菌的群落结构和动态变化与枯萎病原菌发生的相互关系。3对黄瓜枯萎病原菌有抑菌作用的内生生防菌的筛
4、选（短芽孢杆菌JK-2的筛选）抑菌圈法、平板对峙法研究内生菌（包括内生芽孢杆菌JK-2）对黄瓜枯萎病原菌的抑菌效应。室内盆栽研究内生菌（包括内生芽孢杆菌JK-2）对黄瓜枯萎病原菌的抑菌效应。内生菌（包括内生芽孢杆菌JK-2）无菌滤液对黄瓜枯萎病原菌的抑菌效应。内生菌（包括内生芽孢杆菌JK-2）菌体以及不同浓度菌液对黄瓜枯萎病原菌的抑菌效应。内生菌（包括内生芽孢杆菌JK-2）不同培养阶段对黄瓜枯萎病原菌的抑菌效应。4 短芽孢杆菌JK-2生物学特性研究及GFP基因标记41微生物学特性不同培养基、通气量、起始pH、不同温度、碳氮源设置以及不同基质浓度对JK-2生长状况、培养过程pH值、OD(620n
5、m)值、菌体数量的影响。对培养过程总糖消耗、对氮消耗的影响。JK-2不同培养时期-葡萄糖苷酶、过氧化物同功酶的变化。42 GFP基因标记采用本研究室成熟GFP基因标记手段，选择质粒？，电激法，电压，对JK-2进行标记。对标记后的JK-2-GFP菌株，进行微生物学和抑菌特性研究。5 JK-2-GFP侵染过程及侵染影响因素的研究5.1 JK-2-GFP侵染植株的路线和过程的研究。5.2外部因素对侵染的影响选择温度、湿度、浓度、侵染时间、侵染方式、植株不同的种植方式、不同的生长阶段、不同的生长状态等影响因子。5.3内生菌群落结构变化对JK-2-GFP侵染过程的影响。6 JK-2-GFP与枯萎病病原菌
6、生态竞争作用的动态观察6.1不同浓度配比条件下，JK-2-GFP与枯萎病原菌的生长竞争动态植株体外设置JK-2-GFP和枯萎病原菌的不同浓度配比，观察JK-2-GFP对黄瓜枯萎病原菌的拮抗作用以及二者的生态竞争的动态过程。6.2 不同侵染顺序，JK-2-GFP与枯萎病原菌的生长竞争动态7 JK-2-GFP生防保护机制的研究7.1 JK-2-GFP对黄瓜植株生长的影响。7.2 JK-2-GFP对黄瓜枯萎病原菌生长的影响7.3 JK-2-GFP内生定殖规律盆栽法，研究JK-2在植物根系的定殖范围、存活、繁殖数量、运动等规律。7.4 JK-2-GFP对抗病性相关酶活性的影响 研究经JK-2处理后，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)及过氧化氢酶(CAT)的活性的变化动态。7.5 JK-2-GFP在植株体内定殖后，对内生菌脂肪酸变化动态的影响利用全自动细菌鉴定仪分析菌株的脂肪酸变化动态，分析脂肪酸动态差异。
