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1、第一章 绪论 4个学时第二章 实验室配置及基本技术 2个学时第三章 植物细胞工程的理论基础 4个学时第四章 植物组织器官培养技术 6个学时第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产 3个学时第六章 原生质体培养和体细胞杂交 3个学时第七章 人工种子及植物种质资源保存 2个学时 第八章胚胎干细胞培养 2个学时 第九章动物细胞培养 4个学时第十章动物细胞融合与单克隆抗体 4个学时第十一章动物组织与胚胎工程 1个学时第十二章试管动物与克隆动物 1个学时,课程初步安排：36学时,第八章 动物细胞培养,第一节 动物细胞体外培养方法 第二节 体外培养动物细胞的生物学特性第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定第四节
2、 动物细胞的低温保存第五节 细胞同步化第六节 器官培养（自学）,第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定,一、培养细胞常规检查（一）肉眼观察培养物颜色及混浊度（二）倒置显微镜观察细胞生长状态（三）培养细胞的污染检测和排除二、细胞系的鉴定,（三）培养细胞的污染检测和排除,培养细胞的污染：混入培养环境中对细胞生长有害的成分和造成细胞不纯的异物，包括：微生物（真菌、细菌、病毒和支原体）化学物质（影响细胞生存非细胞所需的化学成分）细胞（非同一种的其他细胞）,常见微生物污染。微生物污染包括细菌、酵母菌、霉菌和病毒污染。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要污染源。严格之无菌操作技术、
3、清洁的环境以及品质良好之细胞来源和培养基严格无菌配制是减低污染之最好方法。,1、微生物污染及其排除,微生物污染的途径微生物污染对细胞的影响微生物污染的检测微生物污染的防治,a.空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气的污染。b.器材：培养器皿、器械，CO2培养箱。c.操作：无菌观念不强。d.血清：质量不好、检查不严。e.组织样本：避免用碘消毒。,由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入的抗菌素的抗污染能力也有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救。1）一般在细胞受到有害物污染早期或污染程度较轻时，如果能及时处理并去除污染物，部分细胞有可能恢复。2）当污染物持续存在培养
4、环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，细胞质出现较多的颗粒状物质；较重者细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现了大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。3）不同微生物污染物对细胞的影响也有差别，支原体和病毒对细胞形态和机能的影响是长期、缓慢和潜在的；霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内抑制细胞生长或是产生有毒物质杀灭细胞。,真菌的污染真菌的种类很多，污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物，一般肉眼可见。短期内培养液多不混浊。倒置显微镜下可见在细胞间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝悬浮飘荡
5、在培养液中。高倍镜下可见到很多菌丝有链状排列的菌珠，念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。,细菌污染细菌的污染较为多见是大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单胞菌等。加用抗菌素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。一旦发生易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，出现明显混浊现象。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在。细胞生长停止并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液向肉汤细菌培养基内滴加，37下培养检测是否污染。,Fungus,支原体污染支原体是一种大小介于
6、细菌和病毒之间（最小直径0.2um）并独立生活的微生物。约有1可通过滤菌器。无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，在光镜下不易看清内部结构。支原体污染以后多吸附或散在分布于细胞表面和细胞之间。培养液可不发生混浊，多数情况下，细胞病理变化轻微且可由于传代、换液而缓解，易被忽视；个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养皿脱落。确定有无支原体污染可做如下检测：相差显微镜检测、荧光染色法、电镜检查、DNA分子杂交检查等。,培养细胞的污染一旦明确，多数将无法救治，如果污染的细胞不是具有重要价值，一般发现污染后应尽快弃之，以防污染扩大影响其它细胞。防止污染关键在于严格无菌操作，为防止污染和抢救
7、有价值的细胞，目前一般可采用一下措施：（1）抗生素（2）加温处理（3）动物体内接种,细胞系特征及细胞系间交叉污染的测定,同工酶分析血型及主要组织相容性抗原的测定G显带技术DNA分析,二、细胞系的鉴定,细胞系组织来源的鉴定,具有特征性标志的超微结构分析免疫学试验测定细胞骨架蛋白组织特异性抗原的鉴定细胞特殊功能的生化检查方法细胞来源及特征数据的计算机化,第四节 动物细胞的低温保存,细胞的冷冻保存是细胞培养实验室的常用方法。细胞冻存与细胞传代保存相比。可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。其原理是在低于-70的超低温条件下，细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。,液体的固化有两种方式
8、，一种是形成尖锐的冰晶，另一种是进入无定形的玻璃化状态。根据冻存液在冻结后是否形成冰晶，冻存细胞可分为两种方法：非玻璃化冻存玻璃化冻存,冰晶损伤：冻存细胞过程中，因细胞内水分结冰形成冰晶而致的细胞损伤，包括细胞膜和细胞器的损伤。溶质损伤：冻存细胞过程中，因细胞外水分结冰形成冰晶，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高而引起的细胞损伤。,非玻璃化冻存,一、非玻璃化冻存,（一）非玻璃化冻存原理,非玻璃化低温冻存和复苏细胞的原则：缓慢降温，快速复苏在冻存液中加入冷冻保存剂,缓慢冷冻过程中：细胞外水分先结冰胞外电解质浓度升高细胞内水分渗出在细胞外形成冰晶减少胞内冰晶的形成，减少胞内冰晶损伤快速复苏过程中：避
9、免原有冰晶融化后，又以新的晶核为中心形成更大结晶即水的重结晶现象，减少冰晶损伤，提高冻存细胞的复苏率,慢冻快融以及冷冻保护剂的作用,冷冻保护剂的应用：是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。首先要求对细胞没有明显毒性。,主要包括有甘油、DMSO、乙二醇、乙酰胺、甲醇等；分子质量一般较小，易溶于水，易结合水分子，易穿透细胞膜进入细胞内部；可降低细胞的冰点，延缓冻结过程。可提高细胞膜对水的通透性，冻存时促进细胞内水分渗出细胞外，减少胞内冰晶损伤。可稀释细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，减少溶质损伤。,渗透性保护剂,主要包括有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡萄糖、白蛋白、羟乙基淀粉等；一般是
10、些大分子物质，不能渗透到细胞内部，可溶于水，可结合水分子；可稀释细胞外电解质的浓度，减少溶质损伤。可降低细胞外自由水的含量，减少细胞外冰晶的形成。,非渗透性保护剂,细胞冻存方法,（二）冻存及复苏方法,1.预先配制冻存液,避免因临时配制产热而伤害细胞。含有20%血清的细胞培养液,10%DMSO；2.取对数生长期细胞胰蛋白酶消化（悬浮生长的细胞则不需处理）将消化好的细胞收集于离心管并计数，离心1000rpm/min,5min；3.去除消化液及培养液，加入配制好的冻存培养液，使细胞密度为51061107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，分装入无菌冻存管中，11.5ml/管。冻存管必须旋紧确保密封；4
11、.冻存管上应写明细胞的名称、冻存时间等信息。装好已作标记的小袋或支架同时作好记录；5.封好的冻存管即可直接冻存。,冻存方法,标准程序（精确控制冷冻速度需要细胞冻存器）1.当温度在-25以上时，降温速率为12/min；2.当温度达-25以下时，降温速率为510/min；3.当温度达-100时，可迅速放入液氮中细胞冻存器。简易程序(方法之一)1.将冻存管放置于塑料盒或小纸盒中，周围固定以免倾倒；2.将安置好的小盒放入小型泡沫包装盒内，再放入70冰箱中，尽可能减缓降温速率；3.3h后，取出冻存管移入液氮容器内。,慢冻程序：,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37水浴中并轻轻摇动令其内容尽快融化（1分
12、钟左右）；（2）从水浴中取出冻存管，酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，出去上清夜，再重复用培养液洗一次；（3）用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入CO2培养箱中进行培养，次日更换一次培养液。继续培养。,复苏方法,注意取冻存管时操作人员应戴防护面罩及手套，防止冻存管可能爆裂之伤害!,液氮罐,冻存温度。是指能长久保存细胞的一个深低温度。在这样的温度下，细胞生化反应极其缓慢或停止，经长期保存和复苏后仍能保持正常的结构和功能。从实际和效益的观点出发，液氮温度（196）是目前最佳冷冻保存温度。冷冻速度融冻速度冷冻保护剂,（三）影响细胞冻存的因素,冷冻储
13、存运输：利用特殊容器盛液氮或干冰保存。效果好但麻烦。充液法：选生长至1/31/2瓶底壁、生长状态好的细胞，弃掉旧培养液，补充新培养液至瓶颈，留微量空气，封口膜封口。贴身携带，达目的地后倒掉多余培养液，次日换液。,培养细胞的运输,第五节 细胞同步化,概念：细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生的或是经人为处理造成的细胞周期同步化，前者称自然同步化，后者称为人工同步化。类型：自然同步化:人工同步化:选择同步化细胞沉降分离法，有丝分裂选择法 诱导同步化DNA合成阻断法,中期阻断法,一、分离同步化细胞,（一）各期细胞的分离,1、离心洗脱法2、细胞分类拣选法3、梯度沉降法,（二
14、）分裂期细胞的分离,M期细胞的分离：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物的伤害。缺点：获得细胞数量少（分裂细胞约占1%2%）,二、诱导细胞同步化,（一）G1/S期细胞的分离,1、低温处理法2、营养饥饿法3、胸腺嘧啶核苷阻断法,（二）分裂中期细胞的分离,采用低毒或无毒的DNA合成抑制剂特异地抑制DNA合成，而不影响处于其他时期细胞进行细胞周期运转，从而将被抑制的细胞抑制在DNA合成期的实验方法。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度AdR、GdR和TdR均可抑制DNA合成使细胞同步化。其中高浓度TDR对S期细胞毒性较小，因此常用T
15、dR双阻断法诱导细胞同步化。优点是同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长，个别细胞体积增大。,G1/S期细胞的分离,TdR双阻断法进行细胞同步化,将过量的TdR加入细胞培养液，凡处于S期的细胞立刻被抑制，而其他各期的细胞则照常运转，培养一定时间（TG2+TM+TG1）后，所有这些细胞则被抑制在G1/S期交界处；将TdR洗脱，更换新鲜培养液后，阻断于G1/S期交界处及S期的细胞，开始复制DNA并沿细胞周期运转；释放时间大于TS且在解除抑制的细胞到达G1期终点前，再次向培养液中加入TdR，经过一定时间培养，所有细胞都会被抑制 再G1/S期交界处。,TdR双阻断法进行细胞同步化,利用抑制微管聚合的药物将细胞阻断在细胞分裂中期。常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较少。优点是操作简便，效率高，无非均衡生长现象。缺点是药物处理时间过长，所得到的细胞常不能恢复正常细胞周期运转。,分裂中期细胞的分离：,
