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1、细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳,细胞凋亡(apoptosis)细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程,凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。生物学意义:确保正常发育生长:清除多余的细胞 维持内环境稳定:清除受损、突变、衰老的细胞 积极防御功能:对病毒感染细胞阻止复制,细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学等的改变。其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质DNA在核小体连接部位断裂,形成以180200 bp为最小单位的单体或寡聚体片段。,实验原理,本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞DNA在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细胞染色质DNA在核小
2、体连接处断裂,形成180-200 bp或其整倍数的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯状电泳图谱(DNA ladder),而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞DNA电泳后则成模糊的“涂片状”。,材 料,1.凋亡细胞:经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞2.提取DNA:基因组DNA抽提试剂盒(RNA酶、蛋白酶K、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、DNA ladder 标准品等)3.DNA电泳:1%的琼脂糖凝胶、点样缓冲液4.实验器材:1.5mlEP管、吸附柱、收集管、台式高速离心机、65水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪,方 法,一、胸腺细胞的制备:小鼠摘眼球并断椎处死,取胸腺,浸入含510%小牛血清的
3、1640培养液中,置铜网上研磨,将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm,离心5min,制成1107细胞悬液备用。,二、提取胸腺细胞DNA:裂解细胞阶段(使用到的试剂:裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液)将细胞离心后小心倒出液体,离心管中加入100lL液和20lA液,充分混匀,置于55温浴20分钟,其间来回颠倒离心管3-5次。,(2)结合DNA阶段(使用到的试剂:结合缓冲液=B液、3MNaAC,pH4.8)加入10l 3MNaAC,随后加入1250l B液,充分振荡混合均匀(重要!),12000rpm离心3min。将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟,12000rpm离心3
4、0s,倒掉收集管中废液。第二次同上,静置1分钟,离心30s。,(3)漂洗阶段(使用试剂:600ul漂洗缓冲液2=W液)倒掉收集管中的废液,再加入600ulW液,12000rpm离心30秒。重复上叙步骤,再次加入600 ulW液,12000rpm离心30秒。倒掉废液,再次12000rpm离心30秒。,(4)洗脱收获(使用试剂:50l洗脱缓冲液=T液)小心取出离心吸附柱(不可沾上W液,因其中含有乙醇,会使提取DNA变性),将其套入一个干净的1.5ml eppendorf管中,沿吸附柱的正中间小心加入50l T液,静置1分钟后,于12000rpm离心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因组
5、DNA,取10l电泳。,三、DNA琼脂糖凝胶电泳:(5)制板:将1%的琼脂糖凝胶加热溶化,取20ml倒板,待凝,取梳。置板于电泳槽中,加电泳缓冲液至淹没过胶。(6)加样:取50 uL DNA样品与10uL点样缓冲液,混匀,10ul/孔。(DNA marker 直接加样,5 ul/孔)。,(7)电泳:点样孔置负极,电压80-100V,电泳至溴酚兰移出2/3距离时,关闭电源。(8)观察:取出凝胶板,置紫外透射仪上,可见绿色DNA区带。,注意事项:a 步骤2中,加入B液后一定要充分混匀。离心后,小心取出上清,Tips头不可吸附上白色沉淀(为基因组蛋白)。b 漂洗阶段(步骤3)一定要离心充分去除漂洗缓
6、冲液,可适当将离心时间延长。c 洗脱缓冲液一定要保证加入到吸附柱中央。,结果观察,加地塞米松培养的胸腺细胞DNA电泳后呈典型的“阶梯状”条带。未加地塞米松培养的胸腺细胞,DNA无类似改变。细胞坏死对照的DNA电泳呈现弥漫的片状图谱。,地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡1:DNA marker;2-3:细胞坏死对照4-6:细胞凋亡;7:正常细胞对照,基因组DNA抽提试剂盒,SDS(十二烷基硫酸钠):破细胞膜、核膜,使组织蛋白与DNA分离EDTA(乙二胺四乙酸二钠):抑制DNA酶活性,确保目的DNA不再降解Proteinase K:使染色质上蛋白质与DNA分离,并进一步降解为小肽/氨基酸酚、氯仿:抽提除去蛋白质异丙醇:沉淀DNAGoldview:DNA萤光染料,与DNA结合形成一种光络合物,在紫外光下呈绿色萤光,