肝胆生物化学检验课件.ppt

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1、肝胆生物化学检验,Company Logo,教学目标,教学时数 6学时,熟悉肝胆基本解剖生理功能；熟悉血氨、胆红素、总蛋白、清蛋白/ALT/ALP等 分析前变异（标本收集与前处理）；掌握ALT/ALP/AST/DB/TB/TP/Alb等检验方法原理 熟悉肝胆酶学、胆红素、氨、蛋白等临床意义,Company Logo,梗阻性黄疸梗阻性黄疸生物化学标记物特点？该患者在被检验师开始分离血清时已发现偏黄，血清偏黄色主要由黄疸引起，有时候为摄入着色剂引起黄疸病 通常胆红素会沉积在皮肤 粘膜或眼睛,Company Logo,肝功能评估常见生物化学指标（与功能相关）酶学：ALP ALT AST GGT 5-

2、NT(核苷酸酶）生物转化及排泄：TB DB合成：TP Alb代谢及排泄：TG TC 尿素 氨,Company Logo,Company Logo,Company Logo,一、肝脏结构,（一）解剖学特点,双重血液供应,腹主动脉的分技肝动脉,氧,门静脉,营养,双重输出管道,肝静脉,代谢降解物,下腔静脉,胆道系统,脂溶性物质及其代谢产物,体外,Company Logo,（二）肝脏的显微结构特点,1、组织结构,2、亚细胞结构,（三）细胞的再生,Company Logo,二、肝脏的生物化学功能,排泄功能物质代谢功能生物转化,重要生化功能,Company Logo,（一）排泄功能,主要排泄对象：胆汁酸、

3、胆红素、氨,1、胆汁酸代谢,（1）胆汁的分泌：,胆汁功能：促进脂类的消化吸收，同时能将体内某些代谢产物及生物转化产物不断地排入肠道随粪便排出体外。,胆汁的来源：,肝胆汁 胆囊胆汁 十二指肠,胆汁的成分：,水/胆汁酸（盐）、卵磷脂、蛋白质、脂肪酸和胆固醇,Company Logo,（2）胆汁酸生成及种类：,初级胆汁酸（肝细胞）次级胆汁酸（肠道）,初级游离胆汁酸初级结合胆汁酸（甘氨酸/牛磺酸）次级游离胆汁酸次级结合胆汁酸（甘氨酸/牛磺酸）,Company Logo,（3）胆汁酸肝肠循环：,（4）胆汁酸的功能：,促进脂类消化促进脂类吸收抑制胆固醇从胆汁中析出沉淀,游离型胆汁酸,结合型胆汁酸,Comp

4、any Logo,2、胆红素代谢,胆色素,尿胆素原 粪胆素原尿胆素粪胆素胆绿素胆红素,未结合胆红素(单核吞噬细胞系统如骨髓、脾脏),结合胆红素（肝脏）,胆素原,胆红素代谢概况,Company Logo,部位肝脏细胞,鸟氨酸,瓜氨酸,瓜氨酸,精氨酸代琥珀酸,ATP,AMP+PPi,延胡索酸,鸟氨酸,精氨酸,H2O,尿素,天门冬氨酸,NH3,CO2,氨甲酰磷酸,+H2O,尿素循环,3、氨代谢,Company Logo,（二）物质代谢功能,1、营养物质代谢,2、激素及维生素代谢,(1)在蛋白质代谢中的作用(2)在氨基酸代谢中的作用(3)在糖代谢中的作用(4)在脂代谢中的作用,激素的灭活主要在肝脏进行

5、,多种维生素能在肝细胞内储存并进行转化,Company Logo,胆红素代谢紊乱生化,（一）胆红素代谢障碍,定义:,黄疸分类:,黄疸,和阻塞性黄疸,溶血性黄疸,肝细胞性黄疸,高胆红素血症,高胆红素血症高胆红素血症可分为肝前性、肝性、肝后性肝前性高胆红素血症可能为溶血或血红素代谢旺盛、红细胞破坏血红蛋白增加、镰状细胞贫血引起 表现为非结合胆红素升高 结合胆红素正常肝性高胆红素血症既可能为未被转运到肝脏或肝脏生物转化功能缺陷引起，前者典型的如吉氏综合征、后者典型如克-纳氏综合症 新生儿黄疸（缺UDPG转移酶）表现为非结合和结合胆红素都升高 肝酶学指标如ALT AST多升高 表明肝脏有炎症或肝细胞有

6、损伤,Company Logo,肝后性高胆红素血症通常为结石、肿瘤、疤痕引起胆管堵塞，表现为结合胆红素升高，非结合胆红素正常，ALP GGT升高 脂类代谢异常其他影像学检查可辅助诊断梗阻部位该例患者 最后被诊断为胆结石,Company Logo,案例2,一新生儿 从第三天总胆红素开始升高 母亲O型 新生儿A型 接受光疗（450nm）转化非结合胆红素，否则导致胆红素穿过新生儿血脑屏障，发生脑瘫 耳聋 智力低下并监测 胆红素家属寻求合理的解释,Company Logo,生理性黄疸：2-3天出现，4天开始好转，也可能持续2周 一般非结合胆红素升高 肝酶学正常 其他原因：溶血性疾病、先天性胆管闭锁、新

7、生儿特发性肝炎 导致持续升高溶血性黄疸 主要是免疫机制引起溶血 属于肝前性其检查方法？,Company Logo,Company Logo,血清胆红素测定,重氮盐法,胆红素氧化酶(bilirubin oxidase,BOD)法,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、,导数分光光度法,直接分光光度计法,测定方法,Company Logo,1重氮盐改良J-G(Jendrassik and Grof method,J-G)法,(1)原理:,血清中结合胆红素与重氮盐反应生成偶氮胆红素；同样条件下，游离胆红素需要在加速剂作用下，使游离胆

8、红素分子内的次级键断裂，极性上升并与重氮试剂反应。反应完成后加入终止试剂，继而加入碱性酒石酸钾钠使紫色偶氮试剂转变为蓝色，波长600nm下比色分析，求出血样中总胆红素的含量。,(2)方法评价：,推荐的常规方法，其方法的线性范围较宽，在342mol/L(200mg/L)浓度下有较好的准确性和精确性，高浓度时准确性和精确性降低。因此，建议浓度过高时减少血样用量测定。,Company Logo,【临床意义】,【参考范围】,黄疸的鉴别诊断,总胆红素:5.119.0mol/L(0.31.1mg/dL)直接胆红素:1.716.8mol/L(0.10.4mg/dL),Company Logo,2胆红素BOD

9、测定法,(1)原理:,BOD在不同pH条件下催化不同组份的胆红素氧化生成胆绿素，胆绿素与氧进行非酶促反应转变为淡紫色化合物，胆红素的最大吸收峰在450nm 附近。随着胆红素被氧化,450nm下降，下降程度与胆红素浓度成正比。；在pH8.0条件下,未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，用于测定总胆红素,在pH=4.5的酸性条件下，BOD仅能催化结合胆红素和大部分胆红素，而游离胆红素不被氧化，测定其含量代表结合胆红素。,(2)方法评价：,BOD法测定总胆红素的准确性、精密度比改良J-G法好,Company Logo,【参考范围】,血清总胆红素：10.264.10mol/L 血清结合胆红素：2.572.

10、56 mol/L 胆红素mol/L=胆红素mg/L X 17.1,【临床意义】,见重氮比色法,Company Logo,尿胆素原测定,新鲜标本（受胆红素干扰 可能被氧化为尿胆素）方法：埃里希反应（试剂酸性对二甲基苯甲醛 红色）胆红素干扰排除：氯化钡沉淀过滤,Company Logo,胆汁酸代谢障碍,1、胆汁酸合成障碍2、胆汁酸向肠道排出障碍3胆汁酸肠肝循环紊乱4胆汁瘀积病变时胆汁酸代谢紊乱,Company Logo,血清胆汁酸测定,高效液相色谱法,放射免疫分析法,酶免疫分析法,比色分析测定法,测定方法,Company Logo,(1)酶比色法测定原理,3-HSD,胆汁酸+NAD+3-氧-5类固

11、醇+NADH（1）,NADH+NBT 甲jie（蓝色化合物=540nm）（2）,3-氧-5类固醇+NAD+3-氧-5类固醇+NADH（3）,黄递酶,4-DH,酶比色法,Company Logo,由于胆汁酸在血中含量低，方法检测的灵敏度达不到要求，通过增加3-氧-5-类固醇脱氢酶(4-DH)，胆汁酸经3-HSD催化的产物3-氧代胆酸在4-DH作用下再次脱氢，加大了NADH的生成量，提高了反应的检测能力（见反应式1、2、3）。但以上两种方法都存在一个缺点：生成的蓝色产物是一种染料，易于附着管壁，难于清洗或堵塞管道。,酶循环法测定原理为：,NAD+,Thio-NAD,Thio-NADH,胆汁酸,3-

12、氧代胆汁酸,NADH,3-HSD,Company Logo,(2)酶比色测定法评价：,快速、简便、准确、可靠和适用的优点。它即可以手工操作、也可以在自动化仪器上进行。但试剂价贵、不易保持。对酶量的要求严格，以保证酶促反应在零级反应下进行，酶量不足易产生误差。此外，标准品的制备非常重要。常采用甘氨胆酸溶入小牛血清中制成冻干品。,【参考范围】1 7 mol/L(成人空腹血清总胆汁酸),血清胆汁酸测定的临床意义1、总胆汁酸测定肝细胞微损伤确定诊断价值指标高胆红素血症与胆汁瘀积的区别 TBA测定正常而胆红素升高，可视为高胆红素血病 TBA升高，胆红素正常为胆汁瘀积 两者均升高考虑为胆汁瘀积性黄疸,2、

13、胆汁酸比值测定 胆道梗阻时，患者血清中CA和CDCA升高，以CA为主，CA/CDCA1。肝实质细胞损坏时，血清中以CDCA为主，CD/CDCA1因此，CA/CDCA比值可作为鉴别梗阻性病变黄疸和肝细胞病变（黄疸）的指标。,3、其它 药物：所致的中毒性肝炎、早期TBA 指示回肠病变或功能紊乱的指标 胆汁酸耐量试验,任何引起肝细胞损伤的病理过程都可能引起血中胆汁酸升高可见于各种类型的肝病、肝硬化、脂肪肝，也见于急慢性胆道阻塞。其中空腹胆汁酸测定是一种敏感、特异性强并相对简单的肝功能试验，是目前公认最敏感的肝功能试验之一。特别适用于可疑有肝病但其它生化试验正常或轻度异常的病人诊断。,案例3,59岁女

14、性 未明原因发烧 瘙痒 血清棕黄色,Company Logo,Company Logo,血浆酶紊乱检验,1肝脏合成酶类:胆碱脂酶、凝血因子、铜蓝蛋白；2.肝细胞内酶:ALT、AST 3肝脏阻塞性疾病酶活性改变：ALP、GGT4肝硬化疾病酶活性改变：单胺氧化酶（MAO）,Company Logo,酶活性测定的基本知识,酶活性的概念 酶活性单位 酶活性单位的计算 酶促反应进程 酶促反应底物动力学,Company Logo,一、酶活性的概念,酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。,底物浓度为S,产物浓度为P,时间为t，反应速度为v,v=-dS/dt 或 v=dP/

15、dt。,注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。,Company Logo,二、酶活性单位,定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。,惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。国际单位：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L。Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量，1Katal=60106IU。,Company Logo,三、酶活性单位的计算,步骤：,运用公式进行计算。,明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位定义确定物质量、体积和时

16、间的单位，,Company Logo,计算公式:,产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml）酶单位/升=每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）,分光光度法测定的公式：,（A测定 A对照）V总106 每单位规定的保温时间酶单位/升=LV标 实际保温时间,Company Logo,四、酶促反应进程,酶促反应进程曲线,Company Logo,酶量的测定：,通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（E）与酶促反应速度成正比，即E-dS/dt或EdP/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。酶活性测定时首先要确定线性

17、期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。,酶的含量,酶活性,酶促反应初速度,Company Logo,五、酶促反应底物动力学,中间产物学说：,酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催化底物反应生成产物。E+S ES E+P,Company Logo,米-曼氏方程：,VmaxSv=S+Km,上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度，S代表底物浓度，Km称为米氏常数。,Company Logo,（一）米氏常数的定义,由米-曼氏方程可以导出：,（Vmax-v）SKm=v,当v=1/2Vmax时，Km=S。因此Km值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数

18、，具有重要的应用价值。,Company Logo,（二）Km值的应用,1.鉴定酶的种类,Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其Km值加以鉴定。,Company Logo,表7-1 某些酶的Km值,酶 底物 Km(mmol/L),乳酸脱氢酶 丙酮酸 0.017己糖激酶 D-葡萄糖 0.05 D-果糖 1.5-半乳糖苷酶 D-乳糖 4.0碳酸酐酶 H2CO3 9.0过氧化氢酶 H2O2 25蔗糖酶 蔗糖 28糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108,Company Logo,2.反映酶与底

19、物的亲合力,Km值越大，酶与底物亲合力越小，Km值越小，酶与底物亲合力越大。,3.选择酶的最适底物,Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。,Company Logo,4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率,根据米-曼氏方程可以计算,5.设计适宜的底物浓度,酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的90%95%、底物消耗率为1%5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。,Company Logo,(三)Vma

20、x的应用,定义：Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。,应用：Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的转化率：,TN=底物转化量（mol/s）/酶量（mol）,Company Logo,(四)Km和Vmax的测定,1Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法,1 Km+S Km 1 1=+v VmaxS Vmax S Vmax,Company Logo,2Cornish-Bowden作图法,又称为直线线性作图法。,Company Logo,同工酶测定,同

21、工酶的定义同工酶产生的机理同工酶的测定方法,Company Logo,同工酶的定义,是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。,Company Logo,一、同工酶产生的机理,（一）由不同基因位点编码（二）由等位基因编码（三）由多肽链化学修饰产生,Company Logo,二、同工酶的测定方法,（一）按照理化性质不同进行分离鉴定,1电泳法 同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。,2层析法,根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法加以分离。,Company Logo,（二

22、）按照底物专一性不同进行鉴定,同工酶底物专一性不同，Km值也不同。如果同工酶之间的Km值差别足够大，可以通过测定其Km值加以鉴定。,（三）按照最适pH不同进行鉴定,同工酶分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如果同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓冲溶液的pH值加以鉴定。,Company Logo,（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定,（五）按照耐热程度不同进行鉴定,（六）选择性抑制法,Company Logo,酶学分析在临床诊断上的应用,血浆酶的来源酶的区域化分布酶活性测定在临床诊断中的应用同工酶的诊断价值,Company Logo,一、血浆酶的来源,血浆酶,血浆特异酶,非血浆特异酶

23、,外分泌酶,细胞内酶,Company Logo,二、酶的区域化分布,表7-3 诊断常用血清酶的来源,血清酶 符号 来源,鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝 谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝山梨醇脱氢酶 SDH 肝丙氨酸氨基转移酶 ALT 肝、肾、心异柠檬酸脱氢酶 ICD 肝、胎盘、心-谷氨酰转肽酶-GT 肝、胆、肾、小肠5-核苷酸酶 5-NT 肝、胆道单胺氧化酶 MAO 肝、肾、脑 天门冬氨酸氨基转移酶 AST 心、肝、骨骼肌肌酸激酶 CK 骨骼肌、心、脑乳酸脱氢酶 LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺碱性磷酸酶 ALP 小肠、胎盘、肝、肾酸性磷酸酶 ACP 前列腺、红细

24、胞、血小板淀粉酶 AMS 胰、唾液腺脂肪酶 LPS 胰,Company Logo,三、酶活性测定在临床诊断中的应用,（一）在肝脏疾病诊断中的应用（二）在急性心肌梗死诊断中的应用（三）在急性胰腺炎诊断中的应用（四）在骨骼疾病诊断中的应用（五）在肌肉疾病诊断中的应用（六）在前列腺疾病诊断中的应用（七）在肿瘤诊断中的应用,四、同工酶的诊断价值,Company Logo,血清酶测定,（一）氨基转移酶测定,1赖氏法测定ALT,（）原理：,（）方法评价：赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出；NaOH的浓度对显色有影响；该法的重复性差。,Company Logo,【参考范围】525卡门氏单位,【临

25、床意义】,(2)慢性活动性肝炎或脂肪肝：,(1)肝细胞损伤的灵敏指标:,ALT轻度增高(100200IU),或属正常范围,Company Logo,2.连续监测法测定ALT,（）原理：采用酶偶联反应,即L-丙氨酸和-酮戊二酸在ALT作用下，生成丙酮酸和L-谷氨酸。丙酮酸再在LD作用下生成L-乳酸，同时NADH被氧化为NAD+,可在340nm处连续监测到NADH的消耗量,从而计算出ALT活性浓度。双试剂法:首先使血清与缺少-酮戊二酸的底物溶液混合，37保温5分钟，将标本中所含的-酮酸(如丙酮酸)消耗完，然后，加入-酮戊二酸启动ALT催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反

26、应期吸光度下降速率(-A/min)，来计算ALT的活性。,Company Logo,（）方法评价：存在着两个副反应，会使测定结果偏高；A、血清中存在的-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH。B、血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗NADH。双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反应，测定准确性高，是ALT测定的首选方法；血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性；避免使用溶血标本。,Company Logo,3.赖氏法测定AST,（）原理：血清中的AST可催化门冬氨酸(aspartate)与-酮戊二酸间的氨基移换，生成草酸乙酸(oxaloacetate)和L-谷氨酸。草酸乙酸自

27、行脱羧转变成为丙酮酸。反应60分钟后，加入2，4-二硝基苯肼终止反应，并与酮酸生反应生成两种2，4-二硝基苯腙。在碱性条件下,两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在505nm处差异最大，由草酸乙酸转变成的丙酮酸所生成的苯腙呈色强度显著大于-酮戊二酸苯腙。据此可用比色法测定AST活性。,（）方法评价：赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出；该法的重复性差：负干扰现象,Company Logo,【参考范围】828卡门氏单位,【临床意义】,肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎：血清AST也可轻度增高。,心肌梗死：血清中AST活性增高,各种肝病病人：血清AST的升高,Company Logo,4连续监测法测定A

28、ST,（）原理：采用酶偶联反应,即L-门冬氨酸和-酮戊二酸在AST作用下，生成草酰乙酸和L-谷氨酸。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶作用下生成L-苹果酸，同时伴有NADH转化为NAD+，在340nm监测NADH的转化速率，从而计算出AST的活性。,双试剂法:同测定。,Company Logo,（）方法评价,误差可来自内源性和(或)外源性内源性干扰主要来自血清中高浓度丙酮酸和L-谷氨酸脱氢酶(GLDH)。外源性干扰来自试剂中污染的GLDH和AST。,【参考范围】540 IU/L(连续监测法测定),【临床意义】见赖氏法,Company Logo,(二)ALP测定,化学法,连续监测法：,鲍氏法,金氏法,皮氏法

29、,Company Logo,、金氏法测定ALP,（）原理：ALP在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解释放出酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，根据红色深浅确定ALP的活力。,(2)方法评价：,磷酸苯二钠比色法与更早的-甘油磷酸钠法相比具有较大的优点，如水解速度快，保温时间较短、灵敏度较高、显色稳定、不需去蛋白、操作简单、快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低；操作比较繁琐,，灵敏度低。,Company Logo,【参考范围】成人：313 单位，儿童：528单位,ALP金氏单位定义是100ml血清，37与底物保温15分钟，产生1mg

30、酚为1个金氏单位。,ALP主要用于诊断肝胆和骨骼疾病,【临床意义】,Company Logo,2.连续监测法测定ALP,（1）原理：,以磷酸对硝基酚(p-nitrophenyl phosphate,4-NPP)为底物，2-氨基-2-甲基-1,3-丙醇（2-amino-2-methyl-1-propanol,AMP）或二乙醇胺为磷酸基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，对硝基酚(p-nitrophenol，4-NP)在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。,（2）方法评价：,线性范围可达500U/L，批内CV为2.06%2.36%

31、，批间CV为2.74%。,Company Logo,【参考范围】男性：112岁 15岁 40 150U/L，25岁 40150U/L。,【临床意义】见金氏法,Company Logo,(三)GGT测定法 化学法（重氮反应比色法）和连续监测法。,1.重氮反应比色法测定GGT,原理：,【参考范围】男性 3 17 U/L；女性 2 13 U/L,2.连续监测法测定GGT,(1)原理：,(2)方法评价：,(2)方法评价：,重氮比色法活性单位：100ml血清在37下反应1hr,生成0.5mol的-苯胺为1个GGT活性单位。,男性：1150 U/L；(以-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺为底物)女性：732

32、 U/L 男性：40U/L；女性：30U/L(以-谷氨酰-4-硝基苯胺为底物),【参考范围】,Company Logo,(四)MAO测定,原理:,MAO主要作用于CH2-NH2基团，在氧参与下，氧化脱氨生成相应的卞醛、氨及过氧化氢。以苄氨偶氮-萘酚为底物,在O2和H20参与下，MAO催化生成苄醛偶氮-萘酚、氨及过氧化氢，用环己烷抽提后进行比色测定。,(2)方法评价：,【单位定义】：,1ml血清与底物在37孵育60分钟，催化单胺氧化产生1nmol苄醛偶氮-萘酚为1 个MAO单位。,【参考范围】1240 U/ml(1210340103 U/L)。,【临床意义】：肝硬化时，肝纤维化现象十分活跃，MA

33、O活性明显升高。,Company Logo,讨论：胆酶分离现象？,Company Logo,肝炎患者肝脏受损时，血清谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST和胆红素升高是同步的。但有时会出现另外一种情况，患者谷丙转氨酶升高与胆红素升高“不同步”，或是谷丙转氨酶升高远不如胆红素升高明显，即出现所谓胆酶分离现象。表明肝细胞大量坏死或淤胆型肝炎,Company Logo,血浆蛋白质紊乱检验,一、血浆蛋白质的组成、功能及分类,1、血浆蛋白质的组成：2、血浆蛋白质的功能：营养作用 维持胶体渗透压维持正常PH 运输作用免疫与防御功能催化作用抑制组织蛋白酶代谢调节凝血、抗凝血及纤溶作用。,免疫功能:IgA、IgG

34、、IgM、C3、C4、Kap、Lam、IgG subclasses 1-4、IgE、C1抑制物肾脏功能:白蛋白、转铁蛋白、IgG、a1-微球蛋白、B2-微球蛋白、a2-巨球蛋白、Kap-轻链、Lam-轻链、Cystatin C炎症:CRP、a1-酸性糖蛋白、触珠蛋白、a1-抗胰蛋白酶、铜兰蛋白、纤维蛋白原、SAA类风湿性疾病:RF、ASL、CRP、ADNaseB心血管疾病:ApoA-I、ApoB、ApoA II、ApoE、Lp(a)、肌红蛋白、纤维蛋白原、hsCRP营养监测:前白蛋白、白蛋白、视黄醇结合蛋白、转铁蛋白、铁蛋白出/凝血疾病:纤维蛋白原、AT3、纤溶酶原贫血:触珠蛋白、转铁蛋白、铁

35、蛋白、可溶性转铁蛋白受体,涵盖最广泛的临床检测指标,氨基酸性质：两性电离及等电点、紫外吸收、呈色反应。生物大分子：胶体性质、变性、沉淀和凝固等特点。,蛋白质性质,蛋白质的分离,透析、沉淀、盐析、电泳、层析、超速离心,血浆蛋白质的分类,根据分离方法：盐析法：白蛋白和球蛋白两大类（各种蛋白质的亲水性和所带的电荷均有差别。）电泳法（醋酸纤维素薄膜）：白蛋白、1球蛋白、2 球蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、球蛋白。,3、血浆蛋白质的分类,白蛋白（4060）1-球蛋白（1-抗胰蛋白酶、血清类粘蛋白、1-酸性糖蛋白、甲胎蛋白）2-球蛋白（-脂蛋白、触珠蛋白、铜蓝蛋白、2-巨球蛋白）-球蛋白（转铁蛋白、血红素结合

36、蛋白、微球蛋白、纤维蛋白原、脂蛋白、补体）-球蛋白（各种免疫球蛋白主要位置及C-反应蛋白）,电泳法分类,根据生理功能分类：,1、白蛋白（albumin,Alb)肝实质细胞合成，分子量66 458，半衰期1519天，是血浆中含量最多的蛋白质，占4060。,二、一些临床常检测血浆蛋白质,由于白蛋白在血浆中浓度高而且分子量小，其主要生理功能是维持血液胶体渗透压。另外，白蛋白能结合诸如胆红素之类的疏水分子。在体内担负转运各种离子、酶类、脂溶性物质、激素和药物的功能。在机体营养作用中也起重要作用。参考范围：血清白蛋白3555gL,1）血液中的白蛋白,2）脑脊液中的白蛋白,CSF中白蛋白全部来自血液。CS

37、F中白蛋白增高与血脑屏障通透性增高有关。可见于多发性硬化症、病毒性脑炎或脑膜炎、细菌性脑膜炎等颅内和椎管内炎症性疾病和某些神经系统疾病。参考范围：CSF白蛋白134237mgL,3）、微量白蛋白尿（MA）,尿ALB正常成人尿ALB 大约3.9024.4mg/24h儿童 尿ALB 0 13.3mg/24h尿AlbCr(肌酐)2.5mgmmol 尿中蛋白超过以上数值则称蛋白尿。,肝细胞合成，分子量54 000，半衰期1.9天。,2、前白蛋白（prealbumin,PA）,3、转铁蛋白（transferrin,TRF 或 Tf）由肝及单核吞噬细胞系统合成，分子量76500，位于球蛋白区带，负责运载消

38、化管吸收的及 红细胞降解释放的铁，以转铁Fe3+复合物的形 式进入骨髓，用于合成血红蛋白。半衰期7天。,【参考范围】2.5-4.3g/L【临床意义】属急性时相反应蛋白 并用于贫血的诊断,缺铁性低色素贫血血浆转铁蛋白含量增高,但铁的饱和度很低；红细胞对铁利用障碍引起贫血时，血浆转铁蛋白正常或降低，但铁的饱和度增加。,3、转铁蛋白（transferrin,TRF 或 Tf）,由淋巴细胞合成，存在于所有有核细胞的表面，特别是淋巴细胞和肿瘤细胞。可自由通过肾小球滤过膜，但在肾小管几乎全部重吸收，被重吸收的2微球蛋白在肾小管细胞完全降解。,4、2微球蛋白（2microgluobin,BMG 或2m）,【

39、参考范围】1.0-2.5mg/L(血清)；尿：0.2mg/L以下【临床意义】血浆2微球蛋白含量升高见于炎症、肿瘤、各种类型白血病及肾功能衰竭，尿毒症患者血清2微球蛋白可达40mg/L。,4、2微球蛋白（2microgluobin,BMG 或2m）,2微球蛋白（2m）,血清升高：肾小球滤过功能低下，慢、急性肾炎，肾功能不全,肾前性：病毒感染，免疫疾患（SLE，Sjogren），恶性肿瘤。,尿中升高：肾前性 肾小管障碍：Fanconi，氨基甙类抗生素，重金属中毒，Wilwon，烧伤。肾小球障碍,5、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP),第一个被认定为急性时相反应蛋白,由肝细

40、胞合成,可结合多种细菌、真菌及原虫体对内的多糖。能激活补体，引发调理作用，增强细胞的吞噬功能，对血小板凝聚和血块收缩有抑制作用。,-球蛋白（各种免疫球蛋白主要位置及C-反应蛋白）,5、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP),【参考范围】8.0mg/L【临床意义】作为急性时相反应的一个敏感指标,C-反应蛋白在心肌梗死、创伤、感染、外科手术、肿瘤侵润时其血浆含量在2448小时内迅速升高，可达到正常水平的2000倍。,6、1酸性糖蛋白（1-AG）,升高：急、慢性感染，AMI，肾炎，结缔组织病，自身免疫，过敏，恶性肿瘤。,0.25-2.0g/L,是电泳1-球蛋白含量最高部分,但着

41、色很浅。,7、1抗胰蛋白酶（1-AT）,升高：感染，肿瘤，胶原病，妊娠，术后药物服用（口服避孕药，激素）,降低：遗传性：1-AT缺乏症后天性：ARDS，重症肝炎，肾炎，肺损伤，蛋白丢失，营养不良，早产儿，肾移植早期排异。,0.83-1.99g/L，是电泳1-球蛋这一区带显色的主要成分,8、铜兰蛋白（ceruloplasmin,CP）,血清中降低：先天异常；Wilson病，Menkes综合症，营养不良，肝疾患，蛋白丢失，新生儿。,血清中升高：肿瘤，感染，AMI，贫血，胆道梗阻，胶原病，妊娠，肺气肿，药物，吸烟。,19,9、触珠蛋白（haptoglobin,HP）,血清中降低：血管内、外溶血，合成

42、减低，手术（开胸术）自家输血ABO不适合骨髓移植，烧伤后肾功不全，疟疾，慢性丙型肝炎，自身免疫性溶贫；肾功能不全，自尿中漏出。,血清中升高：AMI，内源性发热，肿瘤。,10、2-巨球蛋白（2-macroglobin,2MG）,血清中2MG,降低：恶性肿瘤，RA，DIC，溶栓疗法，AMI，COPD，尿毒症，肌萎缩性侧索硬化，胰腺炎，溃疡性结肠炎，术后。遗传性2MG缺乏。,升高：慢性炎症，肝炎，肾炎，慢性肝病，糖尿病。,纤维蛋白原4.0%,2-巨球2.93%,触珠蛋白2.2%,铜兰蛋白0.53%,1抗胰蛋白酶1.99%,1酸性糖蛋白 2.0%,前白蛋白0.45%,转铁蛋白4.3%,白蛋白55%,其

43、他26.59%,细胞遭到破坏合成减低异常表达1、炎症、创伤:在急性炎症或某些组织损伤时,有些血浆蛋白质含量会增高,有些会降低,这些血浆蛋白质并被称为急性时相反应蛋白(acute phase reactants,APR)。包括：1抗胰蛋白酶、1酸性糖蛋白、结合珠蛋白、铜兰蛋白、C3、C4、C反应蛋白、纤维蛋白原、前白蛋白、白蛋白、转铁蛋白等。,三、疾病时的体液蛋白质,临床常用炎症的标志物,(急性时相蛋白)CRP a1-酸性糖蛋白 触珠蛋白 a1-抗胰蛋白酶 铜蓝蛋白 纤维蛋白原,CRP 特性,正常含量低（1000 倍）半衰期短（24 h）,1、炎症、创伤:,CRP 临床应用,100 mg/L 重

44、度炎症,1、炎症、创伤:,CRP 参考范围,炎症的诊断炎症与非炎症的鉴别炎症过程的监测疗效考核预后,1、炎症、创伤:,CRP在感染和组织损伤时可升高1001000倍，半衰期46h，对机体有益。,CRP 和炎症,1、炎症、创伤:,在发热、各种炎症状态、和创伤时，血清CRP水平升高1000倍。肝病,自身免疫失调和癌症,血清CRP中度升高。运用高灵敏的CRP方法（hs-CRP)对吸烟、肥胖、老年、以及表面健康的对象的检测，原先认为是正常的CRP（如：3 mg/L)，研究发现在“正常”水平内的hs-CRP 浓度的高低，和未来发生冠脉综合征的危险有关。引起普遍重视。,10 mg/L 无急性炎症,高敏C-

45、反应蛋白(hs-CRP),采用乳胶增强的比浊技术大大提高了分析的灵敏度(检测低限为0.005-0.10mg/l),在低浓度 CRP(0.15-10 mg/l)测定范围内有很高 的准确性.用这些方法所进行测定的CRP称为高敏感(high-sensitivity)或超敏感(ultra-sensitive)CRP,缩写 hs-CRP,1、炎症、创伤:,高敏C-反应蛋白(hs-CRP),动脉粥样硬化的血栓形成除了脂肪堆积过程外,也是一个慢性炎症过程,而CRP是动脉粥样硬化血栓形成疾病的介导和标志物。对表面健康的人群预示未来发生管脉 综合征的可能性。,1、炎症、创伤:,CRP（C反应性蛋白）,参考值：用

46、WHO CRP 标准品定标，测定468名健康人的均值为0.68mg/l，90%和99%百分位分别为3.0mg/l和10mg/l。多数主张将临界值定为1-2mg/l者有临床意义。,1、炎症、创伤:,1、肝脏疾病肝脏合成大多数血浆蛋白，肝枯否细胞参与免疫细胞的生成调节，肝脏疾患可以导致多种血浆蛋白质发生变化。2、肾脏疾病肾脏病变时早期就可以出现蛋白尿，而导致选择性血浆蛋白质丢失，严重肾病时肾小球失去分子筛的作用，可导致非选择性蛋白丢失。3、风湿病：免疫球蛋白IgA、IgG、IgM升高等。4、遗传性缺陷：某些蛋白质发生变异或量缺乏。,与疾病的关系,体液蛋白质测定方法:免疫化学法电泳法化学方法,四、体

47、液蛋白质测定,学习方法：【测定方法】【实验原理】【参考范围】【临床意义】,1、血清总蛋白（total protein,TP):,【测定方法】双缩脲法（目前推荐方法）【实验原理】蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相互结合而成的，二价铜离子在碱性溶液中与蛋白中的肽键（-CONH-)发生反应形成紫红色络合物，在540nm有吸收峰，并与蛋白含量 成正比。蛋白+Cu2+Cu 蛋白络合物（紫红色）【参考范围】6080g/L,【临床意义】,血清总蛋白升高：多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、冷沉淀球蛋白血症等多克隆性或单克隆性免疫球蛋白病，多发性骨髓瘤患者的血浆球蛋白大于50g/L，总蛋白大多都大于100g/L。血清总蛋

48、白降低：反应白蛋白合成减少或蛋白质的丢失肝细胞损害合成减少：肝炎、肝硬化、肝癌总蛋白60g/L,白蛋白25 g/L，低蛋白血症营养不良：摄入不足丢失过多：肾病、烧伤、大出血消耗增加：结核、甲亢、恶性肿瘤,2、白蛋白（Alb）的检测,【测定方法】溴甲酚绿终点法（推荐法）【实验原理】血清中白蛋白与溴甲酚绿（BCG）在pH4.2环境中结合生成绿色复合物，溶液由黄色变为绿色，在630nm有吸收峰，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比，从而测出白蛋白含量。白蛋白+BCG 白蛋白溴甲酚绿复合物【参考范围】3555g/L【临床意义】增高：严重失水、输入过多。减少：丢失、肝脏疾病、消耗性疾病、腹水形成、肾病、严重感染

49、、胶原病，血清白蛋白小于20g/L，临床可出现水肿。,3、血清球蛋白（globulin）,【检测方法】现多用血清总蛋白减去血清白蛋白【参考范围】20-30g/L 白蛋白/球蛋白(A/G):1.5-2.5/L【临床意义】血清球蛋白升高见于某些自身免疫性疾病、炎症或感染，还见于恶性M球蛋白血症。降低见于合成减少，有低球蛋白血症或无球蛋白血症。,4、血浆纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）测定,【测定方法】：纤维蛋白原凝固法免疫化学法【实验原理】：纤维蛋白原在凝血酶催化下形成纤维蛋白，纤 维蛋白原含量与形成纤维蛋白所用时间成反比。【参考范围】2.0-4.0g/L【临床意义】血浆纤维蛋白原为急性

50、时相反应蛋白之一,其血浆含量增高常见于某些感染、严重组织损伤、休克、外科手术后、肾炎、风湿热、恶性肿瘤等。其他放射治疗、月经期和妊娠期亦可增高。血浆纤维蛋白原含量减少常见于营养不良、严重肝功能损伤、弥散性管内凝血、胎盘早产剥离、分娩时羊水渗入血管使在血管内形成血栓、先天性纤维蛋白缺乏症等。,5、前白蛋白测定,【实验方法】免疫比浊法(透射比浊)【实验原理】抗原抗体反应形成免疫复合物，340nm测定。【参考范围】0.180.45 g/L【临床意义】能迅速反映营养摄入处于正平衡或负平衡。而白蛋白的半衰期长,达21 d,即使肝脏停止合成白蛋白,8 d后外周血中的白蛋白比浓度仅降低约20%,敏感地反映早